復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者NKT細(xì)胞、DNT細(xì)胞、T細(xì)胞亞群的變化探討

李想 李滿元 王宏亮 孫雨婷 王佳美

與同一配偶發(fā)生連續(xù)≥2次自然流產(chǎn)稱為復(fù)發(fā)性流產(chǎn),是婦女妊娠期一種常見的并發(fā)癥［1］。嚴(yán)重影響女性生理及心理健康,造成復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因復(fù)雜,已知病因包括生殖道異常、染色體異常、內(nèi)分泌失調(diào)、自身免疫性因素等。引起不孕不育的因素很多,相關(guān)研究結(jié)果表明,免疫學(xué)因素對(duì)于不育及正常妊娠起到了至關(guān)重要的影響［2］。自然性殺傷T細(xì)胞(natural killert,NKT細(xì)胞)是一群同時(shí)具有NK細(xì)胞標(biāo)志,又具有很多T細(xì)胞受體(TCR)的獨(dú)特淋巴細(xì)胞亞群。NKT免疫細(xì)胞可以在人體內(nèi)分泌大量的細(xì)胞免疫因子,參與控制人體的自身先天性免疫和自身適應(yīng)性免疫。NKT細(xì)胞對(duì)于在治療惡性腫瘤者自身免疫、抗病毒自身免疫以及其他自身免疫功能性疾病中都具有很大的促進(jìn)作用。雙陰性調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(double negative regulatory T cells,DNT細(xì)胞)是一種即可以通過免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受又可以主動(dòng)調(diào)控自身免疫功能的細(xì)胞［3］。本文通過研究復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者DNT細(xì)胞、NKT細(xì)胞以及T細(xì)胞亞群的變化,旨在為不育癥提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2020年9月～2021年4月在生殖門診就診的265例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者作為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組,145例進(jìn)行健康體檢婦女作為健康對(duì)照組。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組年齡25～42歲,平均年齡(30.25±4.35)歲；≤30歲129例,年齡＞30歲136例。健康對(duì)照組年齡22～45歲,平均年齡(29.15±5.68)歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 方法 采用EDTAK2采集兩組研究對(duì)象的清晨空腹靜脈血2 ml并立即送檢,檢測外周血DNT細(xì)胞(CD3+CD4-CD8-)、NKT細(xì)胞(CD3+CD56+CD16+)及T細(xì)胞亞群(CD3+T、CD3+CD4+Th、CD3+CD8+Tc)水 平,不能立即檢測可放4℃冰箱保存24 h。準(zhǔn)備2只流式專用管分別加入CD45-FITC/CD8-PE/CD4-ECD/CD3-P5CD45-FITC/CD56-PE/CD19-ECD/CD3-P5亞群試劑(深圳邁瑞公司)各15 μl,再分別加入50 μl抗凝全血振蕩30 s后避光反應(yīng)15 min,然后再加入450 μl的溶血?jiǎng)?振蕩30 s再次避光反應(yīng)15 min后用邁瑞的流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。采用CD45設(shè)門圈定白細(xì)胞群。在十字門圖中圈出相應(yīng)細(xì)胞。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組DNT細(xì)胞(CD3+CD4-CD8-)、NKT細(xì)胞(CD3+CD56+CD16+)及T細(xì)胞亞群(CD3+T、CD3+CD4+Th、CD3+CD8+Tc、Th/Tc)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組DNT細(xì)胞、NKT細(xì)胞水平比較 兩組DNT細(xì)胞比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組NKT細(xì)胞水平高于健康對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組DNT細(xì)胞、NKT細(xì)胞水平比較(,%)

表1 兩組DNT細(xì)胞、NKT細(xì)胞水平比較(,%)

注：與健康對(duì)照組比較,aP＜0.05

2.2 兩組T 細(xì)胞亞群水平比較 兩組CD3+T、CD3+CD4+Th、CD3+CD8+Tc及Th/Tc比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 兩組T 細(xì)胞亞群水平比較(,%)

表2 兩組T 細(xì)胞亞群水平比較(,%)

注：兩組比較,P＞0.05

3 討論

NKT細(xì)胞是1984年Hercend T等命名的,是一群既具有NK細(xì)胞功能又有T細(xì)胞功能的細(xì)胞。其在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中備受關(guān)注［4］。NKT細(xì)胞的來源目前各種說法不一,但絕大多數(shù)人認(rèn)為NKT細(xì)胞對(duì)胸腺有依賴。Kronenberg等［5］通過對(duì)小鼠進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)NKT胞都是從圍生期的小鼠胸腺中產(chǎn)生,并由DNT細(xì)胞偏離了主流進(jìn)行分化發(fā)育而來。也有一些科學(xué)研究認(rèn)為NKT細(xì)胞主要是從傳統(tǒng)胸腺T細(xì)胞系統(tǒng)中的一個(gè)子系細(xì)胞演變而來。Baron等［6］根據(jù)NKT細(xì)胞在某些特定條件下是否存在對(duì)α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-galactosylceramide,α-GalCer)/CDld復(fù)合體進(jìn)行反應(yīng),分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型。發(fā)生復(fù)合反應(yīng)的一類細(xì)胞就是經(jīng)典NKT細(xì)胞,反之則是非經(jīng)典的NKT細(xì)胞。

目前經(jīng)典NKT細(xì)胞簡稱Ⅰ型,是研究較多的。Ⅰ型NKT細(xì)胞能夠通過調(diào)控 Th1 與Th2有關(guān)細(xì)胞因子的生成、穿孔素介導(dǎo)細(xì)胞毒物質(zhì)的作用和自身免疫反應(yīng)問題［7］。非經(jīng)典NKT細(xì)胞也被人們稱為Noninkt細(xì)胞,其幾乎占據(jù)了絕大多數(shù)蛻膜細(xì)胞NKT細(xì)胞,分泌Th2相關(guān)的各種細(xì)胞因子,維持正常的妊娠環(huán)境［8］。同時(shí)還可以抑制體液免疫、遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生［9］。有報(bào)道稱［10］,經(jīng)典的NKT細(xì)胞在人與小鼠中具有高活性,能上調(diào)Th1相關(guān)的細(xì)胞因γ-干擾素(IFN-γ)與腫瘤壞子因子-α(TNF-α)的表達(dá)。進(jìn)一步研究可以明確推斷經(jīng)典型的NKT細(xì)胞及其誘導(dǎo)下的Th1參與介導(dǎo)的自體免疫,阻止了男性精子與卵子結(jié)合并影響其成功著床,損傷蛻膜及滋養(yǎng)細(xì)胞而可能引起流產(chǎn)。司斯［11］發(fā)現(xiàn)某些習(xí)慣性流產(chǎn)或體外受精失敗的患者體內(nèi)具有高水平 NKT 細(xì)胞的表達(dá)。Boyson等［12］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞活化后不但導(dǎo)致妊娠早、中期流產(chǎn),還可引起早產(chǎn)。也有學(xué)者報(bào)道稱［13］,NKT細(xì)胞通過產(chǎn)生白細(xì)胞介素-4(IL-4) 誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答,調(diào)控 Th1/Th2 平衡,維持母胎的免疫耐受,從而獲得妊娠成功。妊娠是一種免疫耐受/抑制平衡的一種狀態(tài)。袁靜等［14］研究發(fā)現(xiàn)少量的NKT細(xì)胞對(duì)維持妊娠狀態(tài)有一定的促進(jìn)作用。而大量的NKT細(xì)胞則會(huì)發(fā)生相反的結(jié)果造成流產(chǎn)［15］。本文數(shù)據(jù)與上述研究的結(jié)論相符,也進(jìn)一步充分證明了NKT細(xì)胞在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中重要性。DNT細(xì)胞也是近年來被發(fā)現(xiàn)的一群T細(xì)胞,參與機(jī)體的固有免疫。目前已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤、傳染性疾病以及其他免疫系統(tǒng)疾病等方面都存在異常增高,并且會(huì)促進(jìn)疾病的發(fā)展［16］。能夠起到調(diào)節(jié)免疫的作用［17］。輔助性T淋巴細(xì)胞(Th細(xì)胞表型為CD3+CD4+CD8-)、NKT細(xì)胞(Tc細(xì)胞表型為CD3+CD8+CD4-)也被認(rèn)為是重要的一種免疫調(diào)控細(xì)胞,當(dāng) Th/ Tc濃度升高時(shí)就會(huì)提示細(xì)胞的免疫功能亢進(jìn),反之則會(huì)提示細(xì)胞的免疫功能減退。

本文研究結(jié)果顯示,兩組DNT細(xì)胞、CD3+T、CD3+CD4+Th、CD3+CD8+Tc及Th/Tc比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組NKT細(xì)胞水平高于健康對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。由此發(fā)現(xiàn)NKT 細(xì)胞具有雙重調(diào)節(jié)機(jī)制,既可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)導(dǎo)致流產(chǎn),也可以維持正常妊娠狀態(tài)。進(jìn)一步分析可以得出造成流產(chǎn)的NKT細(xì)胞是經(jīng)典型的NKT細(xì)胞,維持正常妊娠的是非經(jīng)典型NKT細(xì)胞。

綜上所述,對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者進(jìn)行外周血NKT細(xì)胞的檢測有著重要的意義,其即能有效提示臨床復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者存在免疫系統(tǒng)功能異常,又能快速明確病因,對(duì)免疫異常者進(jìn)行有效的干預(yù),可幫助復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者順利實(shí)現(xiàn)妊娠。