混合核苷片在急性胰腺炎大鼠細胞免疫調(diào)節(jié)中的作用研究

章諾貝 沈浩 劉惠芳

感染性胰腺壞死是膿毒癥(acute pancreatitis,AP)晚期的嚴重問題,并導致AP高死亡率。雖然感染在AP中起主導作用,但AP大鼠死亡的直接原因不是感染本身,而是免疫系統(tǒng)的抑制和全身炎癥反應［1,2］。大鼠AgBⅠ(抗原特異性T細胞激活的先決條件)和CD4+/CD8+比值是AP大鼠細胞免疫的重要指標。新近研究表明,在AP 中發(fā)現(xiàn) AgBⅠ顯著減少［3］。同時,外周血單核細胞的T細胞失衡可降低大鼠AP的組織學評分和存活率［4］。AP中的免疫抑制和由細胞凋亡引起的外周淋巴細胞減少與隨后感染并發(fā)癥的發(fā)展有關(guān)［5］。因此需要尋找一種新的方法增強AP的免疫反應和調(diào)節(jié)炎癥反應。本研究選擇48只AP 大鼠,旨在評估早期使用混合核苷片對AP免疫調(diào)節(jié)的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物模型與給藥

1.1.1 動物 成年雄性SPF Sprague-Dawley 大鼠(體重200～250 g)來自南昌大學動物實驗中心。所有大鼠都飼養(yǎng)在動物護理設施中,光/暗周期為12 h,并以標準商業(yè)飲食和隨意飲水喂養(yǎng)。實驗程序經(jīng)南昌大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準,并按照1983年赫爾辛基宣言的原則進行。

1.1.2 鼠AP模型建立 實驗前大鼠禁食12 h,但可以自由飲水。所有大鼠均在密閉室中以4% 異氟醚(雅培實驗室,上海,中國)2 L/min 氧氣進行麻醉誘導,并在 2% 異氟醚 2 L/min 氧氣中維持手術(shù)麻醉。AP 大鼠模型是通過將 1 ml/kg 體重的5%?；悄懰徕c(STC)溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)標準化逆行輸注到膽胰管中引起的。將生理鹽水 (20 ml/kg) 注射到背部皮下以補償手術(shù)后的體液流失。

1.1.3 給藥 混合核苷片組給予混合核苷片,20 mg/片,3片/次,3次/d,研磨成粉后配蒸餾水10 ml后喂服,共14 d。在整個治療過程中,對照組使用相同質(zhì)量的淀粉配相同體積的蒸餾水喂服,共14 d。喂服。

1.2 檢測與監(jiān)測 大鼠檢測從AP模型建立當天開始,并在給藥后第15天再次開始。在實驗設計中,大鼠在喂服藥物后進行了為期30 d的監(jiān)測或直至死亡(以先發(fā)生者為準)。在整個喂藥過程和30 d時間內(nèi),記錄感染率,包括膿毒癥、腹腔內(nèi)膿腫；記錄死亡率。

1.3 細胞免疫測定 在AP模型建立當天和混合核苷片口服后第15、30天采集血樣后進行分析。使用異硫氰酸熒光素標記的抗CD14(MultiSciences Biotech Co,上海)和藻紅蛋白標記的抗AgBⅠ(MultiSciences Biotech Co,上海),通過流式細胞術(shù)(Becton Dickinson,Heidelberg,德國)測定單核細胞上AgBⅠ的表達。CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+也通過流式細胞術(shù)測量。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,采用單變量方差檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用Fisher 精確概率法檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同時間點細胞免疫指標比較 組內(nèi)比較：對照組大鼠第0、15、30天CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、AgBⅠ組內(nèi)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。混合核苷片組大鼠第15、30天CD3+、CD4+、CD8+、AgBⅠ均高于本組第0天,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；混合核苷片組大鼠第15、30天CD4+/CD8+有所增加,但組內(nèi)不同時間點比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。組間比較：第0天,兩組大鼠CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、AgBⅠ組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。第15、30天,混合核苷片組大鼠CD3+、CD4+、CD8+、AgBⅠ均高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；兩組大鼠CD4+/CD8+比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 兩組不同時間點細胞免疫指標比較()

表1 兩組不同時間點細胞免疫指標比較()

注：與對照組比較,aP＜0.05；與本組第0天比較,bP＜0.05

2.2 兩組感染及死亡情況比較 第15天,混合核苷片組膿毒癥、腹腔內(nèi)膿腫發(fā)生率分別為8.33%、4.17%,均低于對照組的50.00%、66.67%,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；第30天,混合核苷片組膿毒癥、腹腔內(nèi)膿腫發(fā)生率分別為4.17%、4.17%,均低于對照組的83.33%、83.33%,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?；旌虾塑掌M死亡率為8.33%,低于對照組的70.83%,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組感染和死亡情況比較［只(%)］

3 討論

混合核苷片可增強機體機能,使細胞順利的進行代謝。然而,混合核苷片對AP免疫功能、感染并發(fā)癥和大鼠預后的影響尚不清楚。本研究表明,混合核苷片可改善AgBⅠ的表達,并降低 AP 大鼠的感染率。

在最近的研究中,AP 中的單核細胞 AgBⅠ 表達和 CD4+/CD8+被視為 AP 大鼠急性期免疫反應指標,單核細胞 AgBⅠ表達在病程初期時減弱,并與免疫功能受損AP 大鼠的病情嚴重程度有關(guān)［6］。本研究中,AP中AgBⅠ表達在AP模型建立時明顯較低,表明大鼠在疾病早期處于以循環(huán)淋巴細胞功能下降為特征的免疫抑制狀態(tài)。免疫抑制發(fā)生在AP早期階段,例如AgBⅠ的抑制,可能與AP 期間的感染并發(fā)癥密切相關(guān)。研究報道,在AP 時,免疫抑制在早期即發(fā)生,在出現(xiàn)器官功能障礙的大鼠中,AgBⅠ陽性單核細胞的比例在發(fā)病初期較低,或在監(jiān)測期間迅速下降［7］。有學者指出,單核細胞 AgBⅠ表達可預測AP大鼠早期發(fā)生的器官功能障礙風險,且AP大鼠的免疫抑制出現(xiàn)的早且發(fā)展迅速［8］。

本研究中,第14天,混合核苷片組AgBⅠ表達提高表明免疫抑制在炎癥損傷緩解后解除。然而,對照組中AgBⅠ表達在第30天無明顯變化,表明AP在30 d內(nèi)免疫抑制持續(xù)存在。認為這一結(jié)果與過度炎癥反應和隨后的高感染率有關(guān),在一定程度上導致免疫抑制和炎癥反應失衡。與對照組相比,混合核苷片組第15、30天AgBⅠ表達顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。混合核苷片提高了AP 大鼠的CD4+/CD8+,組內(nèi)不同時間點比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。這表明混合核苷片可能保留炎癥反應并避免抗炎階段免疫功能的大量喪失?；旌虾塑掌瑸楹铣扇梭w核酸和多種輔酶的前體物質(zhì)之一,是細胞活動的重要物質(zhì),參與體內(nèi)核酸代謝、能量代謝和核蛋白的合成,可調(diào)整機體的免疫能力,具有修復受損細胞、增強淋巴細胞免疫功能的作用。

本研究于30 d觀察期內(nèi)檢測了AP大鼠的免疫功能,以更好地了解混合核苷片是否可以改善免疫功能。將AgBⅠ表達與感染并發(fā)癥進行對比分析,以更好地了解AP大鼠免疫抑制與臨床結(jié)果之間的時間關(guān)系。

值得注意的是,混合核苷片組AgBⅠ水平在第15天有較大提升,與對照組相比保持較高水平,并伴隨著第30天感染率下降。研究指出,單核細胞群中低AgBⅠ表達細胞的百分占比是膿毒癥發(fā)展的可靠預測指標［9,10］。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,接受混合核苷片治療的大鼠第30天感染率顯著下降。

綜上所述,混合核苷片可以增強免疫反應,提高感染防御能力,降低AP大鼠的感染率和死亡率。