宏基因二代測(cè)序?qū)Y(jié)締組織病并發(fā)免疫抑制宿主肺炎患者的病原學(xué)分析

張安兵 袁小玲 夏秀瓊 呂燕華 張丹丹 梁劍平

近年來，隨著診療技術(shù)不斷提高，結(jié)締組織病(Connective tissue disease，CTD)發(fā)病率也越來越高，患者死于原發(fā)病的比例逐年下降[1]。但是，由于病人的生存時(shí)間延長(zhǎng)及糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的長(zhǎng)期使用，合并肺炎患者的比例也逐漸升高[2]。因該類患者免疫力低下，感染特殊、罕見病原體較多，臨床經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療難度大，傳染病原學(xué)檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、陽性率不高。因此，臨床上亟需新的檢測(cè)方法來快速、準(zhǔn)確診斷感染病原體，為臨床“靶向”抗感染治療提供客觀依據(jù)。宏基因二代測(cè)序技術(shù)(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)被逐漸應(yīng)用于臨床病原體檢測(cè)，現(xiàn)將我科近3年結(jié)締組織病并發(fā)免疫抑制宿主肺炎患者的臨床資料進(jìn)行mNGS結(jié)果分析，從而概括出該類患者的病原學(xué)分布，旨在為這類患者早期經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取符合入選標(biāo)準(zhǔn)的我院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科2019年1月至2021年7月收治的結(jié)締組織病并發(fā)免疫抑制宿主肺炎患者為研究對(duì)象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2019年美國(guó)感染病學(xué)會(huì)/美國(guó)胸科學(xué)會(huì)(IDSA/ATS)“成人社區(qū)獲得性肺炎診治指南”對(duì)社區(qū)獲得性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；②所有患者均診斷為結(jié)締組織病；③患者使用糖皮質(zhì)激素和(或)免疫抑制時(shí)間≥1個(gè)月；④年齡≥18歲。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)締組織疾病累及肺部；②患獲得性免疫缺陷綜合征者；③粒細(xì)胞缺乏者；④嚴(yán)重肝功能、腎功能損害者；⑤合并急性心力衰竭者；⑥合并各種腫瘤；⑦妊娠或哺乳期婦女；⑧存在纖支鏡檢查禁忌癥者。

二、研究方法

將符合入選標(biāo)準(zhǔn)的32例患者納入研究，所有患者均完成纖支鏡肺泡灌洗術(shù)；患者肺泡灌洗液樣本均干冰保存送至廣州達(dá)安臨床檢驗(yàn)中心行mNGS檢測(cè)，mNGS標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸均按照該公司標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范執(zhí)行。

收集患者性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、吸煙史、基礎(chǔ)疾病、使用免疫抑制劑情況、血常規(guī)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血常規(guī)中性粒細(xì)胞比例(N%)、胸部CT結(jié)果、肺炎嚴(yán)重指數(shù)評(píng)分(PSI評(píng)分)等一般資料(見表1)。收集患者肺泡灌洗液mNGS及傳統(tǒng)檢測(cè)方法病原學(xué)結(jié)果并進(jìn)行回顧性分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者一般情況

32例患者中，女性25例(78.13%)，男性7例(21.87%)，年齡25歲～78歲，平均年齡(56.72±11.75)歲，有吸煙史者9例，BMI(21.23±3.45)kg/m2。32例患者中系統(tǒng)性紅斑狼瘡9例(28.12%)，干燥綜合征6例(18.75%)，硬皮病5例(15.63%)，皮肌炎5例(15.63%)，變應(yīng)性血管炎4例(12.50%)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎3例(9.37%)。32例患者中僅使用激素治療者23例，同時(shí)使用激素和其他免疫抑制劑者9例；激素、免疫抑制劑使用時(shí)間1～3個(gè)月的11例，3個(gè)月以上的21例?；颊遅BC(15.63±4.53)×109/L，N%(87.87±8.63)%，CRP(93.68±10.26)mg/L，PCT(1.83±0.73)ng/mL，PO2(85.21±7.97)mmHg，PSI評(píng)分(63.58±9.76)。32例患者中病變?yōu)閷?shí)變影9例(28.12%)，磨玻璃樣影6例(18.75%)，斑片影6例(18.75%)，混合改變11例(34.38%)。

二、患者mNGS與傳統(tǒng)檢測(cè)方法病原學(xué)結(jié)果比較

32例患者中有28例肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)陽性(檢出率87.50%，95%CI為1.354～16.936)，其中細(xì)菌15例(46.88%，陰性菌12例、陽性菌3例)；真菌13例(40.63%，其中耶氏肺孢子菌6例、曲霉菌3例、白色念珠菌2例、光滑念珠菌2例)，均為激素或免疫抑制劑使用時(shí)間3個(gè)月以上的患者；病毒7例(21.88%，其中巨細(xì)胞病毒4例、人類皰疹病毒2例、呼吸道合胞病毒1例)，均為激素或免疫抑制劑使用時(shí)間3個(gè)月以上的患者，該7例病毒感染均為與其他細(xì)菌或真菌的混合感染(見表1)。

32例患者中有19例患者傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)陽性(檢出率59.37%，95%CI為0.303～2.829)，其中培養(yǎng)出細(xì)菌11例(34.37%)，培養(yǎng)出真菌8例(25%)，G實(shí)驗(yàn)和(或)GM實(shí)驗(yàn)8例陽性(25%)，病毒核酸或病毒抗體檢測(cè)6例陽性(18.75%)(見表1)。

表1 患者病原學(xué)檢查結(jié)果

肺泡灌洗液mNGS病原學(xué)檢測(cè)陽性率明顯高于傳統(tǒng)檢測(cè)方法(87.50% vs 59.37%，χ2=6.488，P=0.01)(見表2)。

表2 兩組患者病原學(xué)檢測(cè)陽性率比較

討 論

結(jié)締組織病(CTD)是一組系統(tǒng)性自身免疫性疾病，糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑是其常規(guī)治療藥物，該類藥物長(zhǎng)期使用不同程度抑制了患者的免疫力，增加感染風(fēng)險(xiǎn)，肺部感染最為常見[4-5]。合并免疫抑制宿主肺炎患者感染病原體往往為罕見或特殊病原體，部分患者存在混合感染，這類患者往往經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療效果不佳，病原學(xué)診斷困難[6]。傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法陽性率低、培養(yǎng)周期長(zhǎng)，難以指導(dǎo)臨床抗感染治療，宏基因二代測(cè)序(mNGS)作為一種新的病原學(xué)檢測(cè)方法逐漸應(yīng)用于臨床。

mNGS能一次性并行對(duì)幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，能夠檢測(cè)出可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物的基因序列，繞過了微生物的分離和培養(yǎng)過程，具有病原體檢出陽性率高、靈敏性及特異性高等特點(diǎn)，且不受宿主因素、激素使用的影響[7-10]。因此，我們?cè)噲D探討mNGS技術(shù)對(duì)結(jié)締組織病合并免疫抑制肺炎病原體檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值

本研究中肺泡灌洗液mNGS病原體檢測(cè)陽性率達(dá)87.5%，明顯高于傳統(tǒng)檢測(cè)方法陽性率59.37%(χ2=6.488，P=0.01)。林明珍等[11]報(bào)道m(xù)NGS對(duì)初治失敗的社區(qū)獲得性肺炎病原體檢測(cè)陽性率明顯高于傳統(tǒng)檢測(cè)(85.06% vs 8.04%，P<0.05)。鈕月英等[12]報(bào)道肺泡灌洗液mNGS對(duì)下呼吸道感染病原體檢測(cè)的陽性率高于傳統(tǒng)培養(yǎng)(69.6%vs25.0%，P<0.05)，mNGS陽性結(jié)果調(diào)整抗感染藥物后治療效果，明顯好于經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療(88.0%vs40.0%，P<0.05)。據(jù)謝栓栓等[13]報(bào)道m(xù)NGS診斷病原體陽性預(yù)測(cè)值(91.23%)和陰性預(yù)測(cè)值(30.56%),顯著高于培養(yǎng)法診斷病原體的陽性預(yù)測(cè)值(87.50%)和陰性預(yù)測(cè)值(18.84%)。對(duì)于mNSG檢測(cè)病原體陰性的患者，可盡早開始肺活檢排除其他疾病可能。

本研究mNGS檢測(cè)結(jié)果顯示免疫抑制宿主肺炎患者感染病原體占比由高到低，依次為細(xì)菌、真菌、病毒。細(xì)菌中以革蘭陰性菌為主，占比80%，與郭嬌等[6]報(bào)道的88.89%相似，革蘭陰性菌中又以銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌為主，革蘭陽性菌以金黃色葡萄球菌為主。因此，這類肺炎患者經(jīng)驗(yàn)性調(diào)整抗感染時(shí)，可考慮抗銅綠假單胞菌的β-內(nèi)酰胺類藥物、氟喹諾酮類藥物，必要時(shí)加用覆蓋金黃色葡萄球菌的萬古霉素或替考拉寧、利奈唑胺。本研究中所有真菌感染者激素、免疫抑制使用時(shí)間，均超過3個(gè)月，F(xiàn)ord E.S.等報(bào)道[14]潑尼松15～20mg/d使用超過3周的患者發(fā)生耶氏肺孢子菌肺炎的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，本研究中耶氏肺孢子菌占真菌感染比例高達(dá)46%(6例)，曲霉菌15%(3例)；賈建超等[15]報(bào)道20例重癥真菌肺炎患者mNGS檢測(cè)檢出肺孢子菌55%(11例),曲霉菌30%(6例)，與我們的研究結(jié)果相似。因此，對(duì)于激素和(或)免疫抑制劑使用時(shí)間超過3個(gè)月的患者，應(yīng)當(dāng)常規(guī)檢測(cè)G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)，并考慮是否開始抗真菌治療，臨床上可予伏立康唑聯(lián)用復(fù)方磺胺甲噁唑，經(jīng)驗(yàn)性覆蓋肺孢子菌、曲霉等真菌。免疫功能受損患者易合并病毒感染，本研究中檢出病毒感染7例，巨細(xì)胞病毒占檢出病毒比例達(dá)57%，這些患者激素或免疫抑制劑使用時(shí)間均超過3個(gè)月，且胸部CT均存在磨玻璃樣陰影；對(duì)這些患者經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療效果欠佳時(shí)，應(yīng)考慮巨細(xì)胞病毒、人類皰疹病毒感染可能；對(duì)此類患者應(yīng)常規(guī)行病毒核酸或抗體檢測(cè)，若結(jié)果陽性，應(yīng)予更昔洛韋抗病毒治療。本研究中7例病毒感染均為與細(xì)菌或真菌的混合感染；姚仲偉等[16]報(bào)道在復(fù)合感染中mNGS對(duì)病原體的診斷效能明顯高于傳統(tǒng)培養(yǎng)(58.6%vs.27.6%，P=0.017)。

綜上所述，結(jié)締組織病合并免疫抑制宿主肺炎患者，病情復(fù)雜，早期進(jìn)行肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)，可快速明確致病病原體，從而針對(duì)性選擇抗感染藥物，以便提高患者治療成功率、減少抗感染藥物使用種類。我們也期待大樣本量的前瞻性研究能夠?yàn)檫@類患者的抗感染治療提供更多證據(jù)。