過(guò)敏性紫癜患兒外周血miR-223 NLRP3表達(dá)及臨床意義

黃麗芳 劉景珍 徐江維 饒 媚 謝 根

過(guò)敏性紫癜(henoch-schonlein purpura，HSP)也稱為免疫球蛋白A(immanoglobulin A,IgA)血管炎[1]，是一種IgA介導(dǎo)的疾病，該病在2～6歲的兒童中最常見(jiàn)，最顯著的特征是紫色皮疹，通常出現(xiàn)在小腿和臀部，還可引起腹痛和關(guān)節(jié)疼痛[2]。如不能及時(shí)診斷并治療可出現(xiàn)持續(xù)性紫癜或關(guān)節(jié)炎及進(jìn)行性腎損傷等[3]。目前HSP的確切病因尚不清楚，因此了解HSP的相關(guān)重要因素進(jìn)行早期診斷、加強(qiáng)防治，對(duì)臨床工作具有重要意義。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)是一種炎性相關(guān)因子，可以誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的形成，NLRP3炎癥小體不僅在先天免疫中起關(guān)鍵效應(yīng)器的作用，還會(huì)引發(fā)炎癥疾病中相關(guān)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[4]。miR-223首次在造血系統(tǒng)中被識(shí)別，在骨髓體系中特異性表達(dá)，目前認(rèn)為其在多種炎癥疾病中發(fā)揮作用。有研究[5]表明，NLRP3的表達(dá)可被miR-223調(diào)控，但二者在HSP患兒中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在通過(guò)檢測(cè)HSP患兒外周血中NLRP3、miR-223的水平變化，探討二者在HSP中的關(guān)系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年7月至2020年5月在恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院就診并確診為HSP的患兒60例，其中男性患兒28例，女性患兒32例，年齡5～10歲，平均(8.60±3.50)歲。選取60例同期來(lái)本院體檢的健康兒童為對(duì)照組，其中男性患兒30例，女性患兒30例，年齡5～12歲，平均(8.65±2.70)歲。HSP組和對(duì)照組的性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.133，t=0.088，P>0.05)，具有可比性。HSP組納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患兒符合諸福棠主編第8版《實(shí)用兒科學(xué)》[6]中小兒HSP診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首次發(fā)??；③入院前未使用激素、免疫抑制劑等相關(guān)藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有紅斑狼瘡或其他自身免疫性疾病者；②有凝血功能障礙者；③臨床資料不完整。本研究所有樣品采集均取得受試者知情同意，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 實(shí)時(shí)熒光定量(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號(hào)：MA-5000，蘇州雅睿生物技術(shù)股份有限公司)；全自動(dòng)高速分析分選流式細(xì)胞儀(貨號(hào)：DLK0002866，美國(guó)BD公司)；全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)：CH930，上海聚慕醫(yī)療器械有限公司)；RNA提取試劑盒(貨號(hào)：YT9197，北京伊塔生物科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：YT9036，北京伊塔生物科技有限公司)；AceQ qPCR SYBR?Green Mix(貨號(hào)：Q511-02/03，南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；miScript SYBR? Green qPCR Kit(貨號(hào)：QP071，美國(guó)GeneCopoeia)；人NLRP3 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(貨號(hào)：EH4202，武漢菲恩生物科技有限公司)。

1.2.2 標(biāo)本采集 兩組研究對(duì)象均空腹采集外周血5 mL，放至室溫靜置15 min后，一部分將其放入離心機(jī)，采用3 000 r/min離心處理30 min，取上層血清置于-80℃保存?zhèn)溆?。另一部分采用Ficoll分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)外周血中NLRP3測(cè)定 采用ELISA法檢測(cè)各組外周血中NLRP3的表達(dá)水平，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 qRT-PCR法檢測(cè)外周血中miR-223水平 取上層血清標(biāo)本200 μL，Tizol法提取總RNA，再取1 μg總RNA作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。反應(yīng)體系為：正、反向引物各1 μL，無(wú)RNA酶的滅菌水3 μL，Mix 10 μL，50 ng/μL的cDNA模板1 μL。反應(yīng)步驟：95℃下預(yù)變性3 min，然后95℃，30 s；95℃，10 s；60℃，30 s的條件進(jìn)行，共設(shè)40個(gè)循環(huán)，所有條件均按照檢測(cè)系統(tǒng)嚴(yán)格進(jìn)行。采用2-ΔΔCT法對(duì)血清miR-223表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。miR-223及內(nèi)參U6的引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 觀察指標(biāo) 采用免疫比濁法檢測(cè)外周血中IgA、IgG、IgM免疫球蛋白水平；采用流式細(xì)胞儀對(duì)T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算CD4+/CD8+。檢測(cè)并比較兩組對(duì)象外周血免疫球蛋白和T細(xì)胞亞群水平差異。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象免疫學(xué)指標(biāo)水平比較 HSP組與對(duì)照組CD3+表達(dá)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HSP組患兒外周血中IgA、IgG、IgM、CD8+水平均高于對(duì)照組，CD4+、CD4+/CD8+水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組研究對(duì)象一般資料及免疫學(xué)指標(biāo)水平比較

2.2 兩組研究對(duì)象外周血中NLRP3和miR-223水平比較 HSP組NLRP3表達(dá)水平低于對(duì)照組， miR-223水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組研究對(duì)象外周血中NLRP3、miR-223表達(dá)水平

2.3 NLRP3和miR-223表達(dá)與免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性分析 NLRP3和miR-223分別與IgA、IgG、IgM、CD8+、CD4+、CD4+/CD8+進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，外周血NLRP3與IgA、IgG、IgM、CD8+均呈正相關(guān)(P<0.05)，與CD4+、CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；miR-223與CD4+、CD4+/CD8+均呈正相關(guān)(P<0.05)，與IgA、IgG、IgM、CD8+呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 HSP組NLRP3和miR-223表達(dá)水平與免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 HSP患兒外周血中NLRP3、miR-223表達(dá)的相關(guān)性 Pearson法分析結(jié)果顯示，HSP患兒外周血中NLRP3、miR-223表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.340，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 HSP患兒外周血中NLRP3、miR-223表達(dá)相關(guān)性分析

2.5 外周血中NLRP3、miR-223水平對(duì)HSP發(fā)生的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，外周血miR-223、NLRP3水平預(yù)測(cè)HSP患兒的AUC分別為0.974(95%CI：0.928～0.995)、0.956(95%CI：0.902～0.985)，對(duì)應(yīng)的敏感度分別為98.33%、83.33%，特異度分別為88.33%、96.67%，外周血miR-223、NLRP3水平聯(lián)合預(yù)測(cè)HSP患兒的AUC為0.987(95%CI：0.947～0.999)，敏感度為98.33%，特異度為90.00%。見(jiàn)圖2。

圖2 NLRP3、miR-223單獨(dú)及聯(lián)合診斷HSP疾病的ROC曲線

3 討論

HSP是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的全身性血管炎，它的特點(diǎn)是在小血管中存在IgA為主的免疫沉積物[7-8]。這些免疫沉積物可以激活中性粒細(xì)胞并增加炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而引起皮膚、腸道和腎臟的變化[9]。HSP的發(fā)病誘因涉及免疫紊亂、感染以及藥物反應(yīng)等多個(gè)方面，該病早期實(shí)驗(yàn)室檢查對(duì)HSP的診斷特異性較低，對(duì)癥狀不明顯的患兒容易出現(xiàn)漏診、誤診[10]，嚴(yán)重威脅患兒的生命安全。

miRNA是長(zhǎng)度約為21～25 nt的內(nèi)源性非編碼RNA小分子。據(jù)報(bào)道[11]，miRNA在多種自身免疫性疾病中表達(dá)失調(diào)，在維持免疫穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。miR-223定位于Xq12，參與造血系統(tǒng)分化過(guò)程，研究[12]表明，miR-223與機(jī)體免疫反應(yīng)、造血功能等過(guò)程密切相關(guān)，參與了多種疾病發(fā)展進(jìn)程，包括癌癥、炎癥以及自身免疫性疾病等。本研究中HSP患兒外周血中miR-223水平明顯低于對(duì)照組，HSP患兒的免疫功能指標(biāo)IgA、IgG、IgM、CD8+表達(dá)水平均高于健康兒童，CD4+、CD4+/CD8+表達(dá)均低于健康兒童，miR-223與IgA、IgG、IgM、CD8+呈負(fù)相關(guān)，與CD4+、CD4+/CD8+呈正相關(guān)，提示HSP患兒體內(nèi)免疫功能發(fā)生紊亂，miR-223表達(dá)降低與HSP的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。ROC結(jié)果顯示，miR-223水平預(yù)測(cè)HSP的AUC為0.974，對(duì)應(yīng)的敏感度為98.33%，特異度為88.33%，表明miR-223可能參與HSP疾病的發(fā)生，且可在一定程度上評(píng)估HSP的發(fā)生。

NLRP3是體內(nèi)固有免疫的重要組分，由細(xì)胞內(nèi)多種蛋白復(fù)合物組成，在炎癥反應(yīng)中有重要作用[13-15]。譚之能等[16]研究的表明，NLRP3在慢性阻塞性肺病患者外周血中的水平升高，其水平變化與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。王瑾等[17]報(bào)道了miR-223可靶向作用NLRP3，減輕大鼠腎臟損傷。本研究中HSP患兒外周血中NLRP3表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，外周血NLRP3水平與IgA、IgG、IgM、CD8+呈正相關(guān)，與CD4+、CD4+/CD8+、miR-223表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與既往研究文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示NLRP3可能通過(guò)調(diào)控miR-223參與HSP的病理過(guò)程。ROC結(jié)果顯示，NLRP3水平預(yù)測(cè)HSP的AUC為0.956，對(duì)應(yīng)的敏感度為83.33%，特異度為96.67%， miR-223、NLRP3二者聯(lián)合預(yù)測(cè)HSP患兒的AUC為0.987(95%CI：0.947～0.999)，敏感度為98.33%，特異度為90.00%，二者聯(lián)合聯(lián)測(cè)高于單一指標(biāo)。推測(cè)二者在HSP病情進(jìn)展中的可能作用為：miR-223在病理作用下表達(dá)水平降低，減弱了NLRP3炎性體的抑制作用，并使其表達(dá)水平升高，二者之間存在某種負(fù)反饋機(jī)制，與以往研究結(jié)果相符合[18-19]。而NLRP3是免疫應(yīng)答的重要組成部分，其異常高表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)多種炎性因子分泌，尤其是IgA的升高，進(jìn)而引起小血管炎癥，導(dǎo)致皮膚、腸道和腎臟的變化，最終發(fā)生HSP。

綜上所述，NLRP3在HSP患兒外周血中高表達(dá)，miR-223低表達(dá)，二者呈顯著負(fù)相關(guān)，參與兒童HSP的發(fā)生，還可作為HSP疾病的早期診斷指標(biāo)，具有重要的臨床意義。但NLRP3、miR-223在HSP的發(fā)生的機(jī)制有待進(jìn)一步研究，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。