miRNA 在心房顫動發(fā)病機制中的作用

劉弟世聞 趙慶彥

武漢大學人民醫(yī)院心內科/武漢大學心血管病研究所/心血管病湖北重點實驗室 湖北 武漢 430060

心房顫動（房顫；atrial fibrillation，AF）的機制復雜，與心房和心室心肌結構和電重構密切有關。AF的電生理機制包括：①觸發(fā)活動（早后除極）引起的局灶性放電；②動作電位時程（action potential duration，APD）縮短導致的折返；③心房纖維化引起沖動傳導的異質性。心房纖維化的發(fā)生和發(fā)展是AF結構重塑的重要標志，是AF 向持續(xù)性方向發(fā)展的基礎，并降低抗心律失常藥物治療的有效性。心肌纖維組織的逐步積累是心肌重塑的重要原因。纖維結締組織的形成和再分布調節(jié)心房的幾何形狀，以適應病理性應力、化學和電刺激的影響。這種適應過程涉及心肌的細胞成分和細胞外基質的改變。電重構和纖維化相互影響，共同維持著AF 的發(fā)生和發(fā)展。miRNA 通過作用于靶基因在轉錄后水平進行調控，近二十年來關于miRNA 對AF 纖維化和電重構的研究已經有了長足的進展。

1 心肌細胞與心肌成纖維細胞的通訊

心肌成纖維細胞在細胞外基質的形成中起關鍵作用，它占心肌組織的60%。成纖維細胞本質上是不可興奮細胞，但可以通過纖維連接蛋白在心肌細胞之間傳導電流。這種作用可能導致電流傳導的異質性，縮短心肌細胞APD，使靜息心肌細胞自動去極等。肌成纖維細胞源于心肌成纖維細胞，但合成膠原蛋白的能力是后者的2 倍，并且對促炎和促纖維化刺激反應更強，能夠合成多種細胞因子和趨化因子。肌成纖維細胞含有α-平滑肌肌動蛋白和黏附復合物，后者將肌成纖維細胞內部微絲與細胞外基質蛋白結合，從而為細胞外基質提供收縮力。一系列生長因子、細胞因子、激素、機械性應力和缺氧等，調節(jié)著細胞外基質和心肌成纖維細胞活性。這些因素決定了成纖維細胞分化、基因表達以及膠原蛋白的合成，對心肌重塑起著重要作用。

心肌細胞和心?。。┏衫w維細胞之間存在緊密聯系，它們通過自分泌和旁分泌的方式進行信號轉導。心肌細胞和心?。。┏衫w維細胞之間有許多共同的信號通路，如血管緊張素（Ang）Ⅱ、轉化生長因子β1（TGF-β）、內皮素（ET）等。然而，它們對信號分子的響應程度依據細胞類型而定，成纖維細胞通過AngⅡ誘導釋放TGF-β 和ET-1 來調控心肌細胞肥大和凋亡，而心肌細胞通過AngⅡ誘導釋放TGF-β 和ET-1 刺激成纖維細胞增殖、分化和細胞外基質的形成［1］。敲除AngⅡ受體基因的成纖維細胞增殖不明顯［2］。心肌細胞和心肌成纖維細胞之間在受體密度和受體激酶活性也存在差異，這可能會干擾效應分子的最終作用。如成纖維細胞AngⅡ受體密度更高［2］。除此之外，一些刺激因子主要對成纖維細胞起作用，如血小板源性生長因子（PDGF）、成纖維細胞生長因子2 等。

2 促纖維化信號通路

2.1 TGF-β1 和Ang Ⅱ在眾多的調節(jié)因子中，AngⅡ和TGF-β1是心肌成纖維細胞分泌膠原蛋白最為有效的刺激物。在細胞外，TGF-β1通過結合二聚化的受體而發(fā)揮作用。配體-受體結合導致磷酸化級聯反應，最終導致無活性的Smad2/3/4 形成Smad 復合體。Smad 復合體易位至靶細胞核，參與纖維化基因的表達。

Ang 是一種引起血管收縮和血壓升高的寡肽。研究表明，AngⅡ和TGF-β1并非彼此獨立發(fā)揮作用，而是作為心肌重構和纖維化的整合信號通路的一部分。AngⅡ通過心肌細胞和成纖維細胞中的1型Ang 受體上調TGF-β1表達，進一步激活ERK 誘導心臟成纖維細胞中的膠原蛋白形成［3］。在缺乏TGF-β 的情況下，AngⅡ不能在體內誘導心肌肥大和 纖 維 化［4］，但 它 可 以 上 調TGF-β1合 成，促 進Smad2 磷酸化和Smad 復合物的核轉位并且增加Smad 復合體與DNA 結合。而TGF-β1可以直接刺激Ang 受 體 的 表 達［5］。這 些 結 果 表 明Ang Ⅱ和TGF-β 在體內共同誘導纖維化形成。

2.2 結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)CTGF 是促進血管生成的細胞基質蛋白，它能促進細胞黏附并增強細胞外配體的黏附。CTGF 可由TGF-β、AngⅡ和ET-1 誘導產生，并且可能是這些蛋白的下游信號通路。CTGF 不是TGF-β 發(fā)揮作用所必需，但它可以作為TGF-β的輔因子來誘導纖維化［6］。但就其本身而言，CTGF 促纖維化能力較弱，它更可能是創(chuàng)造一個有利于纖維化的環(huán)境。在健康的心肌中，CTGF 主要在成纖維細胞中表達，但是，在心肌重塑過程中，心肌細胞也會分泌CTGF。

2.3 PDGFPDGF 包 含α 和β 兩 種 不 同 的 受 體。體外實驗證明PGDF 可以促進成纖維細胞向成肌成纖維細胞轉化［7］。PDGF-β 受體抑制劑甲磺酸伊馬替尼能延遲傷口愈合，并減少肌成纖維細胞數量、纖連蛋白和Ⅰ型膠原蛋白的表達［8］。在博來霉素誘導皮膚纖維化的小鼠模型中，達沙替尼和尼洛替尼能以劑量依賴性的方式降低皮膚厚度、肌成纖維細胞數量和皮膚膠原蛋白含量［9］。通過腺病毒將PDGF 基因轉染至小鼠心臟，能顯著上調TGF-β1并加速心臟纖維化和動脈硬化，表明PDGF 可以通過升高TGF-β 水平來促進纖維化［10］。與此相反的是，注射PDGF-α 受體特異性抗體可減輕心房纖維化［11］。

2.4 ET-1ET 是一種強大的血管收縮劑，具有促有絲分裂特性，ET 有3 種亞型，其中，ET-1 是人類重要的亞型。TGF-β 可以通過JNK 誘導ET-1，表明ET-1 是成纖維細胞中TGF-β 誘導纖維化下游信號通路產物［12］。AngⅡ也可以通過激活ERK 和活性氧（ROS）的方式誘導ET-1 產生［13］。而ET-1 可以促進細胞外基質形成和成纖維細胞的分化［14］。這些研究表明，ET 是TGF-β/AngⅡ下游信號通路。

2.5 基質金屬蛋白酶(MMP)和金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)細胞外基質的重塑不僅包括合成，還包括協同降解。心肌細胞和心肌成纖維細胞合成的MMP 及TIMP 與細胞外基質穩(wěn)態(tài)維持密切相關。MMP1 的過表達早期可引起心肌代償性肥厚和膠原蛋白沉積，隨著時間延長，細胞外基質的過度降解會引起心肌舒張和收縮功能障礙［15］。此外，MMP1 作用產生的膠原蛋白和基質片段本身會形成生物活性分子，并促進細胞外基質炎性因子和纖維化因子釋放。這些炎癥因子能促進成纖維細胞活化為肌成纖維細胞，通過作為配體刺激結締組織合成白細胞整合素和激活其他細胞受體。盡管MMP 主要功能是針對基質降解，但其活性產物也解釋了MMP 活性高時纖維化進展快。MMP 活性主要由TIMP 和富含半胱氨酸的Kazal 回文序列的蛋白來調節(jié)［16］。

2.6 氧化應激和炎癥較低水平的氧化應激就能誘導細胞產生超微結構變化，導致細胞結構和功能受損。 活性氧簇（ROS）可來源于線粒體、NAD（P）H、NADPH 氧化酶（NOX）、黃嘌呤氧化酶和未偶聯的一氧化氮合酶。NOX 在心肌氧化還原信號轉導中占重要地位，并在多種細胞中表達，包括心肌細胞、成纖維細胞、內皮細胞和炎性細胞等。線粒體中ROS 的長期增加會導致線粒體DNA 損傷和細胞凋亡。此外，ROS 能激活多種肥大信號激酶和轉錄因子。它還可以刺激成纖維細胞增殖并激活MMP，從而導致細胞外基質重塑［17］。

在心肌炎、心包炎、冠心病、肺炎和炎癥性腸病的患者中，AF 發(fā)生率較高，可能與炎性細胞浸潤心肌引起氧化應激有關［18］。炎癥激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，進而激活NADPH 和NOX。這些劣性刺激最終會激活TGF-β1信號轉導，導致心肌結構重構和電重構。炎性因子和趨化因子可能與陣發(fā)性AF 向持續(xù)性AF 方向發(fā)展有關［18］（圖1）。

圖1 纖維化所涉及的主要信號通路

3 miRNA

miRNA 是一種內源性、單鏈、短（17-22nt）、非編碼核糖核苷酸。miRNA 在物種之間具有高度保守性，目前在植物、昆蟲和哺乳動物中發(fā)現了數萬種miRNA。根據miRBase（22.0 version）記載，已在人類鑒定出2 654 個成熟miRNA。

Dicer 酶是miRNA 合成過程中的關鍵酶之一，基因敲除小鼠和斑馬魚編碼Dicer 的基因，發(fā)現具有胚胎致死性。而特異性敲除小鼠心肌中的Dicer基因會導致小鼠在幼年時期心力衰竭而死。在成年動物中，Dicer 酶活性降低會導致猝死和心肌肥厚［19］。因此，miRNA 對心血管病理生理過程起著重要作用，而miRNA 在AF 纖維化和電生理機制中已經有大量研究。

3.1 促纖維化miRNA

3.1.1miR-21 miR-21 作為纖維化研究最為廣泛的miRNA 之一，在巨噬細胞中高度表達，它能促進巨噬細胞向M1 極化，而巨噬細胞通過旁分泌的方式作用于成纖維細胞，促進纖維化［20］。單細胞測序結果也顯示antimiR-21 能減少心衰組織中成纖維細胞和巨噬細胞［21］。miR-21 的主要機制是通過抑制SPRY1 的表達，激活ERK/MAP 信號通路，導致成纖維細胞增殖［22］。miR-21 的過表達降低CADM1的表達，通過STAT3 信號通路促進心肌纖維化［23］。此 外，miR-21 的過表達也顯著增強TGF-β1誘導的Smad7 下 調［24］。PTEN 已 被 證 明 是miR-21 的 靶 基因［25］。

3.1.2miR-23b-3p 和miR-27b-3p miR-23b-3p 和miR-27b-3p 位于人類9 號染色體上的miRNA 簇的單個轉錄單元內。通過靶向TGIF1 和PTEN 分別激活心臟成纖維細胞中的TGF-β1/Smad2/3 和AKT/N-鈣黏蛋白信號通路，抑制miR-23b 可以緩解盲腸結扎誘導的晚期膿毒癥模型中的心臟纖維化［26］。在心肌細胞中miR-27b 過表達可通過靶向PPAR-γ 促進心肌纖維化［27］。有研究表明TGFβR3抑制心臟成纖維細胞中TGF-β1表達、Smad2/3 激活以及膠原蛋白的沉積［28］。而TGFβR3 是miR-23b-3p 和miR-27b-3p 共同標靶［29］。

3.1.3其他促纖維化miRNA miR-10a 能通過TGF-β1/Smad 軸來調節(jié)成纖維細胞的增殖和分化［30］。在心肌特異性表達的miR-208 過表達會導致心肌纖維化，且miR-208a 表達上調僅限于心肌纖維化區(qū)域［31］。此外有研究發(fā)現miR-146b-5p 靶向作用于TIMP4 促進心肌纖維化[32]。

3.2 抗纖維化miRNA

3.2.1miR-29 miR-29 家族由兩個雙順反子miRNA 簇合成的三個成員（miR-29a、miR-29b、miR-29c）組成。所有家族成員共享一個保守種子區(qū)，它們之間序列僅相差一個堿基。miR-29 是與纖維化相關性最強的miRNA 之一，并且優(yōu)先在成纖維細胞中表達。彈性蛋白、原纖維蛋白1、Ⅰ型和Ⅲ型膠原都包含一個或多個miR-29 保守的潛在種子序列。在AngⅡ誘導的小鼠心肌纖維化模型中，miR-29b/c-3p 降低，而研究證實miR-29b/c-3p 靶向作用于TGF-β2和MMP-2［33］。此外，還有研究報道稱miR-29 可 以 調 控DNMT3A［34］和VEGF/MAPK［35］來 抑制纖維化。但Sassi 等［36］得出相反結論，在病理性左室肥大的小鼠模型中，過表達miR-29 會促進心肌肥厚和纖維化，并且它能通過激活Wnt 信號通路促進心臟的病理性重塑。

3.2.2miR-30 miR-30 家族成員在大腦中高度表達，但miR-30c 除外，它在心臟成纖維細胞中含量豐富，并參與心肌纖維化［37］。在四氯化碳誘導的肝纖維化模型中，miR-30c 能調節(jié)肝星狀細胞中TGF-β依賴性的細胞外基質相關基因的表達［38］。Wang等［39］提出miR-30c 可抑制腎纖維化并改善腎功能。在病理性左室肥大的模型中，miR-30c 能抑制心室膠原合成［37］。miR-30c 可能通過降低α-平滑肌肌動蛋白和波形蛋白的表達來抑制TGF-β1誘導的成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，miR-30c 過表達會降低細胞增殖和遷移，miR-30c 可能通過靶向作用于TGFβR2 來減少心房纖維化［40］。

3.2.3miR-133 miR-133 在人類心肌中含量豐富。在大鼠心肌肥厚模型中，CTGF 的表達是對照組的5 倍，而靶標CTGF 的miR-133 和miR-30c 都 下調［41］。在成纖維細胞中過表達miR-133 可以通過抑制CTGF、降低膠原蛋白的產生［42］。基因敲除miR-133 小鼠會出現嚴重的纖維化和心力衰竭，并且增加猝死的概率［43］。熒光素酶報告基因檢測證實TGF-β1和TGFβR2 是miR-133 和miR-590 的 靶標［44］。但最近的研究顯示，缺氧/再灌注處理的人內皮祖細胞外泌體中miR-133 表達增加，并且促進心肌成纖維細胞的血管生成和內皮-間質轉化［45］。

3.3 其他抗纖維化miRNAShan 等［44］通過尼古丁給藥和建立快速起搏犬AF 模型中，發(fā)現尼古丁能夠顯著上調TGF-β1和TGFβR2 表達，降低miR-590 的水平。將miR-590 轉染到犬心房成纖維細胞中會降低TGF-β1和TGFβR2 水平以及膠原蛋白含量，而antimiR-590 則消除這種保護作用。miR-132可能靶向作用于CTGF 表現出抗纖維化作用［46］。miR-499 下調會增加膠原蛋白沉積和心肌肥大［47］。

4 miRNA 與電生理重塑

AF 發(fā)生數小時內，就會發(fā)生離子通道的重構。其特征在于L 型鈣離子通道電流（ICaL）和瞬時外向電流（Ito）顯著下調，內向整流K+電流（IK）和乙酰膽堿依賴性K+電流（IKAch）上調。這些變化會縮短APD 和 有 效 不 應 期（effective refractory period，ERP），促進AF 的維持和發(fā)展。

4.1 miRNA 與鈣穩(wěn)態(tài)失衡L 型鈣離子通道亞基α1（Cav1.2；CACNA1C）和L 型鈣離子通道亞基β1和β2（Cavβ1/2；CACNB1/2）表達減少會導致ICaL降低和APD 縮短。當前研究顯示miR-328 在AF 心房組織中變化存在爭議。但體內轉染miR-328 腺病毒的犬和過表達miR-328 的轉基因小鼠中，Cav1.2，Cavβ1 和ICaL降低，APD 縮短并 增強AF 易感性，而antimiR-328 可逆轉這一變化［48］。miR-21也能促進電重構，體外過表達miR-21 能降低ICaL密度，熒光素酶檢測證實miR -21 靶向作用于CACNA1C 和CACNB2［49］。

較高的心房率會導致Ca2+超負荷和細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，從而導致AF 向持續(xù)性方向發(fā)展。舒張期Ca2+通過雷諾定受體2（ryanodine receptor，RYR2）從肌漿網泄漏會增加Na+/Ca2+轉運，使細胞膜去極化，縮短ERP。miR-106b-25 能抑制RYR2翻譯，熒光素酶基因報告證實該簇的miR-93 直接靶向RyR2。此外，在miR-106b-25 基因敲除小鼠中，肌漿網Ca2+釋放增加，AF 易感性明顯增加［50］。胞質中的Ca2+通過2a 型肌漿/內質網鈣離子三磷酸腺苷 酶（sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2a，SERCA2a）轉運，從而調節(jié)肌漿和胞質中Ca2+濃度。Ca?ón 等［51］發(fā)現AF 患者中miR-208b與SERCA2 表達呈負相關，而體外過表達miR-208b能降低SERCA2 蛋白的表達，增加AF 易感性。

4.2 miRNA 與K+通道IK對于AF 的發(fā)生發(fā)展起重要作用，編碼內向整流K+通道的基因表達增加會增加IK，并且縮短APD，增加AF 易感性，但由于AF發(fā)生時所涉及的K+通道特別復雜，因此還需要進行進一步的深入研究。研究發(fā)現miR-30d 在AF 患者中高表達，而KCNJ3/Kir3.1 下調，通過熒光素酶報告基因發(fā)現miR-30d 直接靶向KCNJ3［52］。miR-1 是一種肌肉表達豐富的特異性miRNA。在兔心房快速起搏模型中，miR-1 靶向作用于KCNE1 和KCNB2，導 致ERP 縮 短，IK增 加，AF 易 感 性 增 加［53］。然而，Girmatsion 等[54]報道AF 患者心房組織中和離體人心房組織切片心動過速模型中miR-1 的水平顯著降低，而IK上調。在犬和小鼠快速起搏模型中，心房組織和成纖維細胞中miR-26a/b 都降低［55］。在犬成纖維細胞中使用antimiR-26a 可導致IK增加、靜息膜電位超極化并促進成纖維細胞增殖［55］。AF 患者心房中miR-26 與IK呈負相關，熒光素酶報告基因證實miR-26 直 接 靶 向KCNJ2[56]。此 外，miR-499 在AF 患者心房組織中上調，而KCNN3 表達下調，通過功能缺失和獲得實驗顯示miR-499 與KCNN3 表達呈負相關。熒光素酶報告基因顯示KCNN3 是miR-499 的標靶［57］。

5 miRNA 介導自主神經重塑

心肌電活動與自主神經和乙酰膽堿釋放密切相關，它們功能失調對AF 的發(fā)生起著重要作用。在持續(xù)性AF 患者中，miR-30d 上調與IKAch下調有關［58］。miR-206 通過直接靶向超氧化物歧化酶的表達促進自主神經的重塑，從而增加ROS 的產生并縮短ERP。在miR-206 重組慢病毒轉染的犬中，證實ROS 過量產生會增加AF 易感性［59］。在犬心房快速起搏模型中，miR-206 還可以通過靶向GCH1 促進自主神經重塑，從而增加AF 敏感性［60］。

6 miRNA 治療局限性與展望

與傳統(tǒng)療法相比，miRNA 療法優(yōu)勢之一是能夠調節(jié)AF 纖維化和電生理重構過程中相關的多個靶基因或網絡。在miRNA 表達降低的心血管疾病中，可以使用過表達策略來提高miRNA 水平。mimics-miRNA 是人工合成的編碼成熟的miRNA序列，它是包含有引導鏈和互補過客鏈的雙鏈寡核苷酸，能夠形成RNA 誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)。對于那些上調并導致疾病的miRNA，可以設計反義寡核苷酸，它與靶標miRNA 完全互補并降低其活性。由于天然核酸在生物環(huán)境中會被酶活性迅速降解，因此通過設計促進細胞滲透的膽固醇部分可以與反義寡核苷酸結合形成antago-miRNA，從而增強其穩(wěn)定性。然而使用常規(guī)的lipofectamine、腺病毒或慢病毒將miRNA 轉染至人體可能遭受未知的風險。因此，開發(fā)特殊的載體裝載miRNA 顯得尤為重要。

外泌體是直徑為40～100 nm 的囊泡，幾乎所有細胞都能分泌。外泌體納米級的尺寸使得它們能夠逃脫單核吞噬細胞的快速吞噬作用、通過血管內皮、穿越血腦屏障和胎盤屏障［61，62］。同時，由于它由特定的細胞分泌可作用于特定細胞，具有良好的靶向性。在生理狀態(tài)下，miR-23/27b-3p/29/30/133都能包裹在外泌體中。但人工提取天然外泌體靜脈注射可能面臨全身過敏反應，以及外泌體聚集在肝臟組織中而失去效能等問題。輝瑞公司的新型冠狀病毒mRNA 疫苗通過納米脂質顆粒封裝mRNA 似乎提供了部分解決方案。此外，類似外泌體的納米脂質顆粒表面可以用識別靶細胞特定抗原的抗體包被，以此提高靶向性（圖2）。

圖2 裝載mimics-miRNA 的外泌體和內源性miRNA發(fā)揮功能示意圖

7 總結

大量數據表明，miRNA 對AF 的發(fā)病機理具有重要作用。隨著高通量測序和單細胞測序的普及，miRNA 在AF 不同類型細胞中表達差異及作用機制將得到深入研究。各細胞間外泌體表面特異性配體的發(fā)現將會提高人工合成納米脂質體的靶向性。它們?yōu)閙iRNA 抗心律失常治療應用于臨床提供了新的途徑。