芽枝霉菌Lcxs9產(chǎn)兩種耐熱β-葡萄糖苷酶的快速純化及酶學特性研究

何海燕，黃琦琦，黃智嫻，羅艷妹，覃擁靈*

（1.河池學院 化學與生物工程學院，廣西 河池 546300；2.微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點實驗室，廣西 河池 546300；3.河池學院 農(nóng)業(yè)生物技術應用研究中心，廣西 河池 546300）

木質(zhì)纖維素是由D-葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接的直鏈多糖，是地球上最豐富的可再生資源[1-3]。木質(zhì)纖維素在纖維素酶系的協(xié)同作用下最終可被降解為葡萄糖：內(nèi)切葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）隨機作用于纖維素分子內(nèi)部的非結晶區(qū)產(chǎn)生葡萄糖和短的纖維寡糖；外切葡聚糖酶（EC 3.2.1.91）沿著纖維素非還原末端由外向里水解β-1,4-糖苷鍵釋放纖維寡糖、纖維二糖或葡萄糖；β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）將纖維二糖或其他可溶性的纖維二糖和纖維寡糖水解成葡萄糖分子[4-5]，減少這些中間產(chǎn)物對葡聚糖外切酶和葡聚糖內(nèi)切酶的的抑制，提高纖維素酶系的水解糖化率，在纖維素的降解中起著非常關鍵的作用[6-10]。

目前，應用的β-葡萄糖苷酶大都產(chǎn)自于真菌[11-12]，且對霉菌的研究較多[13]。β-葡萄糖苷酶是一種重要的工業(yè)酶，在多種生物轉化中發(fā)揮重要作用，其被廣泛應用于生物燃料[14-15]、造紙工業(yè)、紡織工業(yè)[16-17]、廢棄物和食品的加工[18-20]。微生物所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性差、產(chǎn)量低，嚴重制約了β-葡萄糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應用[21-23]。因此，挖掘并純化耐熱的β-葡萄糖苷酶具有重要的意義。

本研究以前期從中國廣西原始森林腐木的土壤中篩選得到的1株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株芽枝霉菌（Cladosporium cladosporioides）Lcxs9[24]為研究對象，對其進行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，采用硫酸銨沉淀及強陰離子交換柱對其所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶進行分離純化，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對其分子質(zhì)量進行檢測，并對其酶學性質(zhì)進行研究，以期為β-葡萄糖苷酶的應用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

芽枝霉菌（Cladosporium cladosporioides）Lcxs9：分離自廣西環(huán)江縣木論自然保護區(qū)原始森林腐木的土壤，保存于微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點實驗室。

1.1.2 試劑

蛋白濃度測定試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司；蔗渣：宜州博慶制糖有限責任公司；七葉苷、水楊苷（均為分析純）：上海晶純試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：廣州化學試劑廠；正丁醇、乙酸乙酯、氨水、三氯化鐵、苯胺、丙酮、二苯胺（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：（分析純）：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[25]：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，4層紗布過濾，加20 g葡萄糖和15 g瓊脂，定容至1 000 mL。121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基[26]：蔗渣6 g，麩皮4 g，Mandels營養(yǎng)鹽液30 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

β-葡萄糖苷酶酶活快速檢測平板[27]：三氯化鐵0.03%，七葉苷0.1%，瓊脂1.5%。

1.2 儀器與設備

NGC色譜系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；ZWY-2102型立式全溫度恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；Infinite M200PRO全波長酶標儀：上海精密科學儀器有限公司；AvantiJE落地式離心機：美國貝克曼庫爾特公司；PHS-3B型pH儀：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芽枝霉菌Lcxs9的固體發(fā)酵

將芽枝霉菌Lcxs9劃線接種于PDA培養(yǎng)基，30 ℃條件下活化培養(yǎng)3 d。芽枝霉菌Lcxs9 PDA斜面菌種用10 mL生理鹽水洗下制成孢子懸液（108CFU/mL），按10%的接種量將孢子懸液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，每天翻動兩次，30 ℃培養(yǎng)4 d。

1.3.2β-葡萄糖苷酶酶活的測定

（1）DNS法

粗酶液的制備：培養(yǎng)物中加入200 mL無菌雙蒸水（ddH2O），40 ℃恒溫水浴1 h，四層紗布過濾，6 000 r/min離心10 min，取上清液，得到粗酶液[26]。

β-葡萄糖苷酶酶活的測定[27]：反應體系中添加0.05 mL適當濃度的酶液和1mL 1%水楊苷溶液底物（采用0.02 mol/L pH4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制）混勻，60 ℃條件下反應30 min，添加3 mL DNS試劑終止反應，沸水浴6 min后冷水浴，采用紫外分光光度計在波長540 nm處測定吸光度值。

β-葡萄糖苷酶酶活的定義[27]：每分鐘產(chǎn)生1 μmol葡萄糖的酶量為1個酶活單位（U）。

（2）快速檢測法[28]

取200 μL粗酶液點于β-葡萄糖苷酶酶活快速檢測平板上，如果產(chǎn)生黑色沉淀點，說明具有β-葡萄糖苷酶酶活性。

1.3.3 可溶性總蛋白含量的測定方法

使用蛋白濃度測定試劑盒測定可溶性總蛋白質(zhì)含量。

1.3.4β-葡萄糖苷酶的純化

鹽析[29]：取7份粗酶液，每份100 mL，分別用相對飽和度為30%～90%（以10%的梯度遞增）的硫酸銨進行沉淀，沉淀后于4 ℃條件下靜置12 h過夜。鹽析過夜后的酶液以8 000 r/min、4 ℃條件離心20 min，收集沉淀，并用pH 4.8的檸檬酸緩沖溶液溶解沉淀，并補足至原體積的1/5。

脫鹽：采用Sephadex G-25凝膠柱快速脫鹽，采用快速檢測法測定β-葡萄糖苷酶酶活，依據(jù)酶活確定最佳硫酸銨純化鹽析區(qū)間，初步純化酶產(chǎn)物4 ℃保存。

陰離子交換層析[30-31]：采用MonoQ10/100GL強陰離子交換層析柱，利用BioLogic Duo-Flow蛋白質(zhì)純化儀對初步純化的酶進行進一步純化，具體條件：Bio-壓力530 psi，以pH 8.3的0.01 mol/L Tris-HCl為起始緩沖液，以含1 mol/L NaCl的pH為8.3的0.01 mol/L Tris-HCl為洗脫緩沖液，流速1 mL/min，0～0.3 mol/L NaCl線性梯度洗脫分離蛋白質(zhì)，每管收集0.5 mL，純化酶4 ℃保存。采用DNS法測定β-葡萄糖苷酶酶活，采用SDS-PAGE[32]法檢測蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量及純度。

1.3.5β-葡萄糖苷酶水解活性及轉苷活性的測定

取10 mL 1%纖維二糖（采用0.02 mol/L pH 4.8的檸檬酸緩沖液配制），按體積比100∶1加入純化后的酶液，30 ℃反應3 h，采用薄層層析法（thin layer chromatography，TLC）檢測水解產(chǎn)物[33-34]。

1.3.6β-葡萄糖苷酶酶學性質(zhì)測定

（1）最適pH及pH穩(wěn)定性

將β-葡萄糖苷酶與pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的緩沖液混合，在最適溫度條件下測定酶活，并計算相對酶活力，確定β-葡萄糖苷酶的最適pH值。

將β-葡萄糖苷酶置于pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的緩沖液中，于4 ℃放置24 h后，30 ℃保持3 h，在最適pH值和最適溫度下測定酶活，并計算相對酶活力，研究pH對β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性的影響。

（2）最適溫度及溫度穩(wěn)定性

采用最適pH的緩沖液溶解β-葡萄糖苷酶，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃條件下測定酶活，并計算相對酶活力，確定β-葡萄糖苷酶的最適作用溫度。

將β-葡萄糖苷酶分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80 ℃、90 ℃條件下恒溫水浴保持60 min后，在最適pH和最適溫度下測定酶活，并計算相對酶活力，研究溫度對β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性的影響。

（3）金屬離子

純化酶液中添加不同的金屬離子Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ni+、Cu2+、Ag2+、Co2+、Hg2+，使終濃度為2 mmol/L，測定酶活，并計算相對酶活，研究不同金屬離子對β-葡萄糖苷酶活性的影響。

相對酶活的定義：以粗酶液酶活為100%，其他條件下的酶活性與粗酶液酶活性的比值為相對酶活。

酶促反應動力學參數(shù)的測定[35]：以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG）為底物，在pH4.8、30 ℃條件下測定酶活力，計算出相應的初始反應速度，利用雙倒數(shù)作圖法求得β-葡萄糖苷酶的米氏常數(shù)（Km）值和最大酶反應速率（Vmax）。

2 結果與分析

2.1 芽枝霉菌Lcxs9 β-葡萄糖苷酶的純化

通過不同相對飽和度（30%～90%）的硫酸銨鹽析后，測定β-葡萄糖苷酶酶活和可溶性蛋白含量，結果發(fā)現(xiàn)，當硫酸銨相對飽和度為70%時，β-葡萄糖苷酶酶活和可溶性蛋白含量最高。在此基礎上，進一步采用MonoQ10/100GL強陰離子交換層析柱純化β-葡萄糖苷酶，得到兩個具有β-葡萄糖苷酶酶活的洗脫成分，分別編號為BG CC1、BG CC2，其酶活力和純化情況見表1。

由表1可知，β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的比酶活力分別為6.6 U/mg和12.2 U/mg，純化回收率分別為11.4%和17.7%，純化倍數(shù)分別為10.8和15.3。采用SDS-PAGE對β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的純度和分子質(zhì)量進行測定，結果見圖1。

圖1 β-葡萄糖苷酶SDS-PAGE檢測結果Fig.1 SDS-PAGE detection results of β-glucosidase

由圖1可知，β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的分子質(zhì)量分別為41 kDa和53 kDa，條帶單一。

2.2 β-葡萄糖苷酶的水解活性及轉苷活性

以1%纖維二糖為底物，β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的水解活性及轉苷活性見圖2。由圖2可知，β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2均具有水解活性，可以水解纖維二糖得到葡萄糖；同時具有轉苷活性，可以利用低分子質(zhì)量的單糖合成纖維三糖和纖維四糖。

圖2 β-葡萄糖苷酶水解性質(zhì)和轉苷活性測定結果Fig.2 Determination results of hydrolysis properties and transglycosidation activity of β-glucosidase

2.3 β-葡萄糖苷酶酶學性質(zhì)測定結果

2.3.1β-葡萄糖苷酶最適反應pH和pH穩(wěn)定性實驗

β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的最適反應pH和pH穩(wěn)定性試驗結果見圖3。由圖3A可知，在30 ℃條件下，隨著pH值的升高，β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的酶活均呈先升高后下降的趨勢，當pH為6.0時，兩種β-葡萄糖苷酶的酶活均最高，因此，確定兩個β-葡萄糖苷酶的最適反應pH值為6.0。由圖3B可知，兩種β-葡萄糖苷酶均在pH 3.0～12.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，相對酶活均＞40%。CHRISTAKOPOULOS P等[36]研究發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶的最適pH為4.5；MATSUMOTO K等[37]研究發(fā)現(xiàn)，串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶在pH 4.0～11.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定。芽枝霉菌Lcxs9所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶有較寬的pH耐受范圍，說明具有更大的應用潛力。

圖3 β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的最適pH（A）和pH穩(wěn)定性（B）Fig.3 Optimum pH (A) and pH stability (B) of β-glucosidase BG CC1 and BG CC2

2.3.2β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度和熱穩(wěn)定性

β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的最適反應溫度和熱穩(wěn)定性試驗結果見圖4。由圖4A可知，在最適pH6.0時，隨著反應溫度的升高，β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的酶活呈先升高后下降的趨勢，當反應溫度為60 ℃時，β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的酶活力最高，因此，確定兩種β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度均為60 ℃。由圖4B可知，兩種β-葡萄糖苷酶均在20～80 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，相對酶活均＞50%。

圖4 β-葡萄糖苷酶的最適溫度（A）和熱穩(wěn)定性（B）Fig.4 Optimum temperature (A) and thermostability (B) of β-glucosidase

CHAN C S等[38]分離純化得到的β-葡萄糖苷酶DT-Bgl的最適作用溫度為70℃，可用于開發(fā)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)有效糖化的生物工藝；LIEW K J等[16]從Jeotgalibacillus malaysiensis中分離純化獲得一種新的β-葡萄糖苷酶BglD5（GH1），其在65 ℃條件下穩(wěn)定；TIWARI R等[22]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶RA10在80 ℃條件下穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性β-葡萄糖苷酶有助于纖維素生物質(zhì)有效糖化為可發(fā)酵糖；XIA W等[23]研究發(fā)現(xiàn)，熱穩(wěn)定性好的纖維素酶（60 ℃時保持穩(wěn)定）水解纖維素糖化效率顯著提高。芽枝霉菌Lcxs9所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度為60 ℃，在20～80 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，說明具有更大的應用潛力。

2.3.3 金屬離子對β-葡萄糖苷酶的影響

金屬離子在酶的催化反應中常作為活化劑或抑制劑[39-40]，不同金屬離子對β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2活力的影響見表2。由表2可知，Zn2+和Ni+對兩種β-葡萄糖苷酶均無明顯影響，Cu2+、Ag2+、Co2+、Hg2+對兩種β-葡萄糖苷酶均有強烈的抑制作用，而Mn2+、Ca2+和Mg2+對兩種β-葡萄糖苷酶均具有激活作用，分析原因可能是這些金屬離子在低濃度下可以穩(wěn)定酶的三級結構，并有助于酶活力中心與底物的親和與結合催化過程，金屬離子通過結合酶的活性中心從而影響酶的構象和活性[39-40]。

表2 金屬離子對β-葡萄糖苷酶酶活的影響Table 2 Effect of metal ions on the enzyme activity of β-glucosidase

2.3.4β-葡萄糖苷酶動力學實驗結果

利用pNPG為底物，測得芽枝霉菌Lcxs9所產(chǎn)兩種β-葡萄糖苷酶的米氏常數(shù)Km均為2.76 mg/mL，最大反應速率（Vmax）均為20.6 U/mg。

3 結論

采用硫酸銨沉淀及強陰離子交換柱從芽枝霉菌Lcxs9固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化得到兩種β-葡萄糖苷酶，分別命名為BG CC1和BG CC2，通過SDS-PAGE檢測，其分子質(zhì)量分別為41 kDa、53 kDa，比酶活力分別為8.6 U/mg、12.2 U/mg。兩種酶都具有水解活性，可以水解纖維二糖得到葡萄糖；同時具有轉苷活性，可以利用低分子質(zhì)量的單糖合成纖維三糖和纖維四糖。兩種酶的最適作用pH及溫度均分別為6.0、60 ℃，均在pH 4～10和20～80 ℃條件下較穩(wěn)定，Ag2+、Co2+、Cu2+、Hg2+對兩種酶均有抑制作用，而Mn2+、Ca2+和Mg2+均有明顯的激活作用，Zn2+和Ni+無明顯影響。利用4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）為底物，兩種酶的動力學常數(shù)Km和最大反應速率（Vmax）均分別為2.76 mg/mL、20.6 U/mg。本研究首次報道芽枝霉菌Lcxs9可以利用甘蔗蔗渣為碳源固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)耐高溫的β-葡萄糖苷酶。