生駝乳中大腸桿菌的污染情況調(diào)查

文│張耀文（新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心）

蔡擴(kuò)軍（新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院）

徐敏*（新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心、烏魯木齊市奶業(yè)協(xié)會(huì)）

新疆是我國(guó)第一大駱駝養(yǎng)殖基地，現(xiàn)有駱駝25萬峰，現(xiàn)代科學(xué)研究表明，駝乳不但營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，且富含不飽和脂肪酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，易被消化吸收，而且含有天然胰島素、胰島素蛋白質(zhì)等降血糖因子，對(duì)糖尿病治療有一定功效。另外，駝奶中的乳鐵傳遞蛋白、溶解酵素、免疫球蛋白可提高人體免疫力，是免疫力低下者的理想飲品。由于駝乳的價(jià)值逐漸被廣大消費(fèi)者認(rèn)可，使得駝乳行業(yè)飛速發(fā)展，供不應(yīng)求。但駝乳的質(zhì)量安全應(yīng)引起廣大科研工作者的重視。

Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌，又叫大腸埃希氏菌。大腸桿菌是常在的條件性人畜共患病致病菌，又是重要的食源性細(xì)菌，在一定條件下可以引起人和動(dòng)物局部組織器官感染。動(dòng)物產(chǎn)品中大腸桿菌的污染給消費(fèi)者帶來了安全隱患，其中乳源性大腸桿菌的危害已引起人們的極大關(guān)注，牛乳中大腸桿菌污染較多，而駝乳中大腸桿菌的污染報(bào)道極少。鑒于此，為調(diào)查本地生駝乳中大腸桿菌的污染情況，本研究利用熒光PCR快速檢測(cè)方法對(duì)生駝乳中大腸桿菌的污染情況開展調(diào)查，為保障駝乳質(zhì)量安全，促進(jìn)駝乳產(chǎn)業(yè)的健康快速發(fā)展提供技術(shù)支撐。

一、材料與方法

1.主要試劑。大腸桿菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳澳東檢驗(yàn)檢測(cè)科技有限公司；EC肉湯購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

2.主要儀器。熒光PCR儀（ABI 7500型）購(gòu)自美國(guó)ABI公司；生物安全柜；細(xì)菌培養(yǎng)箱。

3.大腸桿菌的分離、檢測(cè)。

（1）樣品采集。采集生鮮駝奶90份，樣品放入含有冰袋的運(yùn)輸箱內(nèi)低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

（2）檢驗(yàn)程序。

（3）操作步驟，見圖1。

增菌：無菌取25毫升生駝奶樣品放入三角瓶，再加入225毫升的EC肉湯，36±1℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。

提取樣品DNA：取1毫升菌液加到1.5毫升無菌離心管中，13000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清，加入50微升DNA提取液懸浮沉淀，充分混勻后沸水浴10分鐘，13000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，離心后取上清作為DNA模板檢測(cè)或保存于-20℃待檢測(cè)。陰性對(duì)照參與提取，以對(duì)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。陽(yáng)性對(duì)照無需提取，直接使用。

反應(yīng)組份配制：按照大腸桿菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒的說明書將樣品DNA、核酸擴(kuò)增反應(yīng)液、反應(yīng)液、HS-Taq酶加至反應(yīng)管內(nèi)，反應(yīng)總體積為25微升，同時(shí)設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

PCR擴(kuò)增：將配置好反應(yīng)液的反應(yīng)管置于熒光PCR儀器中，擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性95℃ 3分鐘、變性95℃5秒、退火/延伸60℃ 40秒，40個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)采集設(shè)定在退火/延伸時(shí)。對(duì)于多通道熒光PCR儀，選擇熒光素FAM為信號(hào)采集通道，淬滅基團(tuán)選None，染料校正選None。

（4）結(jié)果描述及判定。

陰性：無Ct值并且無擴(kuò)增曲線，表示樣本陰性或者被檢測(cè)樣本核酸濃度含量低于1×102copies/毫升。

陽(yáng)性：Ct值≤30，且出現(xiàn)明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，表示樣本陽(yáng)性。

可疑：檢測(cè)樣本30＜Ct＜35時(shí)重復(fù)一次。如果Ct值仍小于35，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，可報(bào)告樣本陽(yáng)性，否則報(bào)告樣本陰性或被檢測(cè)樣本核酸濃度含量低于1×102copies/毫升。

對(duì)照：陰陽(yáng)性對(duì)照必須成立，否則此次實(shí)驗(yàn)視為無效。

二、結(jié)果

根據(jù)大腸桿菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果判定，結(jié)果顯示，該試驗(yàn)陰陽(yáng)性對(duì)照成立，本批次一共檢測(cè)樣品90份，其中18份陽(yáng)性，72份陰性，陽(yáng)性率20%。

三、討論

近年來，駝乳在疾病輔助治療、營(yíng)養(yǎng)保健、提高免疫力等方面的研究不斷深入，越來越受到廣大消費(fèi)者的認(rèn)可，同時(shí)駝乳的質(zhì)量安全也引起了廣泛關(guān)注。駝乳中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌等微生物污染是影響質(zhì)量安全的重要因素，大腸桿菌是環(huán)境中常在的條件性致病菌，駝乳可通過外源性污染和駱駝的內(nèi)源性感染造成其攜帶大腸桿菌，對(duì)消費(fèi)者身體健康造成影響，具有一定的公共衛(wèi)生安全隱患。本研究結(jié)果顯示，駝乳中大腸桿菌的陽(yáng)性率為20%，雖然檢出率顯著低于全國(guó)牛乳中大腸桿菌檢出率的平均水平，但應(yīng)引起相關(guān)部門的重視。由于駱駝一般采取傳統(tǒng)手工擠奶方式，易造成大腸桿菌的污染，建議相關(guān)部門制定駱駝擠奶技術(shù)規(guī)范，降低因擠奶不衛(wèi)生而造成的外源性污染。

大腸桿菌的檢測(cè)技術(shù)主要包括對(duì)核酸、繁殖代謝產(chǎn)物、特異性抗體等進(jìn)行檢測(cè)，其中針對(duì)核酸DNA的PCR技術(shù)在檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。熒光PCR方法是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比增加，最后通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。本研究利用熒光PCR技術(shù)，其操作方便快捷，具有較強(qiáng)的特異性和較高的靈敏度，實(shí)現(xiàn)了對(duì)生駝奶中大腸桿菌的快速檢測(cè)，為生駝乳中大腸桿菌的污染調(diào)查提供了技術(shù)支持。