不同茶樹品種土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征

黎巷汝，陳丹妮，洪永聰*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300）

茶樹是我國廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物之一，2020年其種植面積達(dá)到316.51萬公頃［1］。茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)與品種特性、種植管理緊密聯(lián)系，如何有效利用土壤養(yǎng)分，提高茶樹的養(yǎng)分吸收效率是我國茶葉種植上亟待解決的問題［2］。植物主要通過根部吸收養(yǎng)分來滿足自身生長生理需求，其根系－土壤－微生物形成了復(fù)雜的生態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。土壤和植物的健康狀況以及土壤養(yǎng)分庫的豐富程度與土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)［3－7］，因此了解我國茶樹根際微生物群落的生態(tài)特征茶園的養(yǎng)分管理有一定指導(dǎo)意義。

目前，已有諸多研究報(bào)道了茶樹根際細(xì)菌群落的種類和作用。茶樹根際存在多種有益菌，如：圓褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）、固氮梭菌等具有固氮作用［8］；纖維素分解細(xì)菌、氨化細(xì)菌、芽孢桿菌（Baciluss）、假單胞菌（Pseudomonsadaceae）利于有機(jī)態(tài)養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，提升土壤肥力［9－10］；樹根際中特定微生物菌株也具有提高茶樹的耐脅迫性［11］及防治根腐病的能力［7］，從而促進(jìn)茶樹生長和提高生產(chǎn)力。此外，不同技術(shù)手段獲得的茶樹根際微生物菌群有所差異。利用培養(yǎng)法［12－13］獲得的優(yōu)勢菌主要為芽孢桿菌（Baciluss）和假單孢菌（Pseudomonas）。而采用高通量測序技術(shù)［14］研究發(fā)現(xiàn)茶樹根際的優(yōu)勢細(xì)菌類群為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌（Bacteroidetes）、酸桿菌（Acidobacteria）。這些研究揭示了茶樹群落的共有特征，但目前有關(guān)不同茶樹品種間的微生物群落特征研究卻較少。其中多數(shù)研究［15－16］基于平板培養(yǎng)的方法尋找不同品種的群落差異性，不同茶樹品種間微生物群落存在差異，優(yōu)良的茶樹品種具有更高的群落多樣性和豐度，且有益菌群更多。然而土壤中存在大量不可培養(yǎng)的微生物菌落，需要用新一代技術(shù)才能深入了解茶樹的土壤微生物全貌。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，Illumina高通量測序技術(shù)已被廣泛運(yùn)用于土壤微生物組的研究中［17］，通過擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA可明晰土壤樣本中的絕大部分菌落。此技術(shù)在茶樹根際微生物領(lǐng)域中的研究主要集中在樹齡［18］、施肥狀況［19］和栽培措施［20］，對于不同品種茶樹根際微生物的影響鮮有報(bào)道。顧松松［21］利用16S rRNA技術(shù)測試了5種茶樹的根際微生物，發(fā)現(xiàn)不同茶樹品種土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)存在差異。

本研究對同一種植條件的地塊中10種茶樹品種的土壤微生物群落進(jìn)行16S rRNA高通量測序測序，旨在探討不同茶樹品種土壤微生物群落特征，為茶園管理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

樣品采集于福建省武夷學(xué)院的茶樹種質(zhì)資源圃（117°99′E，27°73′N），該資源圃于2015年建成，為平地茶園。每一行栽種1個(gè)茶樹品種，每行長度為20～30 m，大行距2 m，雙行單株種植。所有茶樹為同一時(shí)間移栽，樹齡7年。茶園管理措施一致，于每年10月下旬施復(fù)合肥，3、6、9月進(jìn)行人工除草。

2021年5月，在該種質(zhì)資源圃內(nèi)，選取10個(gè)茶樹品種：尖波黃（JBH）、白雞冠（BJG）、大紅袍（DHP）、蜀永1號(hào)（SY1）、白葉1號(hào)（BY1）、中茶302（ZC302）、政和大白茶（ZHDBC）、福安大白茶（FADBC）、佛手（FS）和毛蟹（MX）為調(diào)查對象，其生物學(xué)特性見表1。分別采集10個(gè)茶樹品種的根區(qū)土壤。具體方法：種植行內(nèi)隨機(jī)選取5株茶樹，去除土壤表面凋落物及雜物，近根處采集深度為0～20 cm的土壤樣本。每5株茶樹根區(qū)土壤混合為一個(gè)樣品，每個(gè)茶樹品種土壤樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。每個(gè)樣品用無菌自封袋封裝，放入冰盒運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，-80℃冰箱儲(chǔ)存，直至檢測。

表1 10個(gè)茶樹品種的生物學(xué)特性Table 1 Biological characteristics of 10 tea cultivars

（接表1）

1.2 DNA提取和Illumina測序

使用FastDNA Spin試劑盒（MP Biomedicals，Solon，USA）提取土壤樣品中的總DNA，在1%瓊脂糖凝膠上檢測DNA的完整性，使用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific，MA，USA）測量DNA質(zhì)量和濃度。采用Illumina測序技術(shù)，測序由凌恩生物科技有限公司完成，使用引物為341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’） 和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCAAT-3’），擴(kuò)增 16S rRNA的V3-V4區(qū)。

1.3 數(shù)據(jù)處理和序列分析

QIIME 軟件包分析原始的 Illumina HiSeq測序數(shù)據(jù)，去除低20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和低于300 bp的序列長度，獲得有效序列。并生成OTU表，從該表獲得Resample OTU表以標(biāo)準(zhǔn)化總序列。使用Usearch的唯一序列來定義操作分類單元（OTUs），將相似性為97%的序列分類為同一OTU。使用SILVA數(shù)據(jù)庫和QIIME中實(shí)現(xiàn)的RDP分類器進(jìn)行物種分類注釋?；跍y序深度最低數(shù)據(jù)量對OTU表進(jìn)行抽平，利用R和Mothur程序進(jìn)行微生物種群多樣性分析。使用EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，R和R中的Vegan、ggplot2程序包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序和質(zhì)量控制

對10個(gè)茶樹品種根際土壤樣品進(jìn)行高通量測序，共獲得512504條有效序列和3566個(gè)OTU分類單元。從每個(gè)樣本中抽取一定數(shù)量OTU序列繪制稀疏曲線（圖1A）和物種累計(jì)曲線（圖1B），曲線趨于平緩，表明測序深度和抽樣量足夠，足以反應(yīng)樣品中絕大部分物種的信息，可進(jìn)行下一步分析。

圖1 10個(gè)茶樹品種土壤細(xì)菌測序的稀釋曲線（A）和物種累計(jì)曲線（B）Fig. 1 Bacterial sequencing dilution curve (A) and species accumulation curve (B) on soils planted with 10 tea cultivars

2.2 土壤樣品的細(xì)菌豐度和多樣性

在R中使用Vegan包對OTUs表進(jìn)行抽平，每個(gè)樣本抽取至34350條優(yōu)化序列，進(jìn)行α-多樣性分析。Chao、Shannon指數(shù)反應(yīng)了細(xì)菌群落的豐度和多樣性，結(jié)果如表2所示。Chao指數(shù)代表微生物群落的豐富度，指數(shù)越高群落則物種越豐富。Shannon指數(shù)反映群落多樣性，指數(shù)越高則群落多樣性越多。10個(gè)品種的物種豐度和群落多樣性有明顯差異，其中JBH的Chao和Shannon指數(shù)均為最高，為2644和6.39，具有最高的物種豐度和群落多樣性。而ZC302的物種豐度和多樣性均為最低，為 1964.59和 5.73。

表2 10個(gè)茶樹品種根際土壤樣品測序結(jié)果各分類單元數(shù)量及Alpha多樣性分析Table 2 Quantity and alpha diversity of bacteria in rhizosphere soils planted with 10 different tea cultivars

2.3 不同茶樹品種土壤細(xì)菌群落的組成結(jié)構(gòu)

為進(jìn)一步了解不同品種的細(xì)菌群落組成，根據(jù)OTU表的注釋結(jié)果，在門、屬水平上進(jìn)行分析。在門分類上（圖2A），10個(gè)茶樹品種的優(yōu)勢微生物種群結(jié)構(gòu)相似，豐度前11位分別為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteriota）、浮霉菌門（Planctomycetota）、擬桿菌門（Bacteroidota）、wps-2門、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、粘球菌門（Myxococcota）、Armatimonadota門。10個(gè)茶樹品種的組成差異表現(xiàn)在豐富度上，其中ZC302的綠彎菌門（Chloroflexi）的豐度相比最大（30.67%）；芽單胞菌門（Gemmatimonadota）的豐度最少（0.14%）。屬分類水平上，各品種群落組成相似（圖2B）。

圖2 10個(gè)茶樹品種細(xì)菌群落在不同分類（A. 門分類水平；B. 屬分類水平）上的相對豐度Fig. 2 Relative abundance of bacterial communities at phylum level (A) and genus level (B) in soils planted with 10 tea cultivars

在有注釋的優(yōu)勢菌屬中，豐度排名前的5個(gè)菌屬分別為酸桿菌屬（Acidobacteriales）、顆粒菌（Granulicella）、羅河桿菌屬（Rhodanobacter）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）。其中酸桿菌屬是JBH、MX、SY1、BY1的主要優(yōu)勢菌屬，ZHDBC的優(yōu)勢菌屬為羅河桿菌屬（10.04%），F(xiàn)S的優(yōu)勢菌屬為JG30-KF-AS9（7.51%）。

2.4 不同茶樹品種土壤細(xì)菌群落組成的相似性和差異性

為綜合比較不同茶樹品種間的組成相似性和差異性，采用花瓣圖對特有OTU和共有OTU進(jìn)行分析（圖3）。不同品種的共有和特有物種占各自群落的比例不同，10個(gè)品種共有物種為582個(gè)，其中ZC302共有OTU比例最多（37.45%），DHP、BJG、BY1、ZHDBC、FADBC、SY1、JBH、MX、FS分別占29.74%、28.20%、28.91%、32.14%、27.86%、29.83%、26.81%、34.77%、30.83%。茶樹的共有核心菌群為變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、放線菌門。進(jìn)一步挖掘不同品種間的特有菌群，對各品種的特有OTU進(jìn)行屬水平上的分析。在有注釋的屬類中，DHP的優(yōu)勢特有菌屬為Microcoleus SAG 1449-1a和Cylindrospermum PCC-7417，JBH的特有菌屬為Candidatus Solibacter。

圖3 10個(gè)茶樹品種OTUs花瓣圖分析Fig. 3 Analysis of petal map of OTUs of 10 tea cultivars

為研究不同茶樹品種細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)差異，基于屬分類水平（豐度前30）的Bray-Crutis距離，使用類平均法（average）對10個(gè)品種的物種組成進(jìn)行層級聚類分析（圖4A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BY1和SY1、ZHDBC和FADBC、DHP和BJG分別聚為一支，細(xì)菌群落組成最相似。ZC302單獨(dú)一支，與其他9個(gè)品種差異較大，9個(gè)品種歸為一個(gè)類群。酸桿菌屬（Acidobacteriales）主要分布于SY1、BY1、JBH、BJG、MX、DHP中。NMDS分析結(jié)果顯示（圖4B），stress＜0.2，其模型較可靠地能反映樣本排序的真實(shí)分布。10個(gè)茶樹品種的NMDS樣本排序分布結(jié)果與聚類分析結(jié)果相應(yīng)，ZC302與其他樣本距離較遠(yuǎn)，仍差距較大。

圖4 基于屬水平分類不同品種根際細(xì)菌的層級聚類分析和NMDS分析Fig. 4 Composition and clustering of dominant bacteria at genus level in soils planted with 10 tea cultivars

3 結(jié)論

本研究在同一地塊、管理相對一致的種質(zhì)資源圃中采集了10個(gè)不同品種茶樹的根區(qū)土壤進(jìn)行Illumina高通量測序，對不同茶樹品種的土壤細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行研究。α-多樣性指數(shù)顯示，10個(gè)茶樹品種的多樣性有所差異，JBH的菌群具有最高的多樣性，ZC302的多樣性最低。β-多樣性分析10個(gè)品種間的群落相似性和差異，基于Bray-Crutis距離的層級聚類分析和NMDS分析都顯示，10個(gè)品種根據(jù)菌屬豐度可分為兩個(gè)類群，ZC302與其他品種距離最遠(yuǎn)，差異較大；BY1、SY1和MX相似度最高。根際分泌物顯著影響跟土壤微生物的種類和數(shù)量，而植物基因型對根際分泌物的產(chǎn)生有重要影響［22］。同一生境下，遺傳背景相距較大的ZC302的細(xì)菌群落與其他品種差異較大。通過遺傳背景調(diào)查發(fā)現(xiàn)，ZC302是以‘格魯吉亞6號(hào)’為母本、‘福鼎大白茶’為父本育成的品種，而其他9個(gè)均為在我國本土生長繁育的品種。ZC302的母系來源于‘格魯吉亞6號(hào)’，這可能是造成其根系土壤細(xì)菌群落與其他9個(gè)品種差異大的主要原因。在另外一個(gè)類群中，DHP和BJG、ZHDBC和FADBC群落相似度最高。DHP和BJG均為武夷山本地品種，ZHDBC和FADBC為均生長于福建北部，起源地相近或相同的兩個(gè)品種具有相似的微生物群落結(jié)構(gòu)，這可能與植物的環(huán)境適應(yīng)相關(guān)［22］。

本研究中10個(gè)品種的細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)相似，其差異主要表現(xiàn)在群落豐度。在較大分類上，茶樹的優(yōu)勢核心菌為變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、放線菌門等，變形菌門和醋桿菌門占幅較大，與前人研究相似［14－21］。變形菌門、放線菌門、酸桿菌門是植物微生物群落的主要組成部分，只在不同物種中的表現(xiàn)不同豐度。變形菌門中包含了許多與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、光能營養(yǎng)相關(guān)的細(xì)菌種類。在所研究的茶樹品種中，該門類下的羅河桿菌（Rhodanobacter）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、醋桿菌（Acidibacter）占據(jù)優(yōu)勢（圖2B），其中羅河桿菌是反硝化菌菌群，慢生根瘤菌具有固氮作用，這兩種菌均與營養(yǎng)轉(zhuǎn)化和吸收相關(guān)［23－24］。在所有品種中酸桿菌屬（Acidobacteriales）和顆粒菌屬（Granulicella）占很大比例，兩者均與植物凋零物的碳降解相關(guān)［25－26］，說明茶樹菌群功能偏向營養(yǎng)吸收和轉(zhuǎn)化方面。各品種的特有菌屬占各自總菌群的比例極低，且多為稀有菌群。

在同一生境下，來自不同地區(qū)的茶樹品種根際細(xì)菌群落呈現(xiàn)出一定差異，地理起源及特征相近的品種群落多樣性和豐度相似，茶樹品種對根際細(xì)菌的組成結(jié)構(gòu)和豐度有一定影響，但造成這些差異的原因還需要結(jié)合根系代謝組及基因組等其他信息進(jìn)一步深入研究。