福建苦茶資源不同葉位兒茶素及嘌呤生物堿組分分析

曾珊珊，陳瀟敏，邵淑賢，廖龍華，吳文晞，趙 峰，葉乃興*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建詠甘華茶業(yè)有限公司，福建 福州 350011；3.福建恒正檢測技術(shù)有限公司，福建 福州 350100；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

茶樹種質(zhì)篩選對特異茶樹種質(zhì)資源的搜集、保存和利用有重要意義［1］。兒茶素、生物堿是茶樹芽葉的主要生化成分，其組分構(gòu)成及含量在很大程度上決定了茶葉品質(zhì)的優(yōu)劣以及適制性［2］，從而決定了茶樹資源的開發(fā)利用價值，因此生化成分特異茶樹品種是今后茶樹育種的主要目標(biāo)之一。茶葉中的兒茶素是茶葉中多酚類物質(zhì)主體成分，也是茶葉品質(zhì)形成的關(guān)鍵成分［3］。兒茶素主要分為含沒食子酸基（EGCG和ECG）和不含沒食子酸基（C、EC和EGC）兩大類，EGCG、ECG和總兒茶素含量隨著茶梢成熟顯著下降, C、EC和EGC含量變化趨勢相反［4］。在一般茶種植物中，嘌呤生物堿的分布模式主要是以咖啡堿為主，含有少量的可可堿和微量的茶葉堿,苦茶堿僅在部分苦茶中含有［5］。咖啡堿（Caffeine）在茶樹芽葉幼嫩部位含量較高，其含量隨著茶樹葉片的成熟而降低，是一類重要的生物活性物質(zhì)，也是茶湯中重要的呈味物質(zhì)。福建野生茶樹資源豐富，相關(guān)研究較多，近年來，在福建省境內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了同時富含甲基化EGCG和苦茶堿的特異茶樹種質(zhì)資源［6－8］。劉玉飛［9］、段志芬［10］等對云南茶樹種質(zhì)資源的生化成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)云南地方茶樹種質(zhì)資源的生化成分具有遺傳多樣性，篩選到高兒茶素指數(shù)CI、高苦茶堿、低咖啡堿等特異種質(zhì)17份。陳瀟敏等［11］對福建野生茶樹資源嘌呤生物堿的組分構(gòu)成進(jìn)行測定，篩選出14份嘌呤生物堿特異的茶樹種質(zhì)資源。陳曉嵐［12］、樊曉靜［13］及王澤涵［14］等分別對福建壽寧、云霄、詔安地區(qū)野生茶樹種質(zhì)資源的微形態(tài)和生物學(xué)性狀進(jìn)行調(diào)查研究，首次在福建發(fā)現(xiàn)了野生禿房茶樹群體種質(zhì)資源,研究表明野生茶樹和栽培種的葉片和花粉微形態(tài)特征存在一定的共性和特異性。

前人的研究大多是對野生苦茶資源種質(zhì)的發(fā)掘及其生化成分和生物學(xué)性狀的鑒定與評價［6－11］，尚未對這些苦茶資源不同葉位生化組分的分布規(guī)律進(jìn)行研究，由于茶樹新梢不同葉齡的葉片在發(fā)育進(jìn)程中存在形態(tài)特征和生理生化方面的差異，為此，本研究以福建不同茶區(qū)的苦茶種質(zhì)資源為研究材料，探究福建苦茶資源不同葉位兒茶素和嘌呤生物堿的分布規(guī)律以及不同種質(zhì)間的含量差異，以期為這些特異種質(zhì)資源的深入研究與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2021年4月上旬分別采集來源于福建安溪、云霄、大田等3份苦茶資源的春季第1輪新梢的第一至第四葉，以‘福鼎大白茶’為對照，采自福建農(nóng)林大學(xué)南山實(shí)驗(yàn)茶園。采用液氮固樣，以干冰保存并轉(zhuǎn)運(yùn)至茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，冷凍干燥后粉碎過60目篩。

1.2 主要儀器與試劑

UltiMate 3000 高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Nexera X2 LC-30A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），串聯(lián)Sciex 4500 Q-Trap質(zhì)譜儀（美國Sciex公司）；C18反相色譜柱（5μm、4.6×250 mm，2.6 μm、2.1×100 mm；廣州菲羅門公司)；超純水系統(tǒng)（Medium Touch，上海和泰儀器有限公司）。

9種兒茶素標(biāo)品：表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基)沒食子酸酯（EGCG3"Me）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、沒食子兒茶素（GC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、兒茶素沒食子酸酯（CG）。4種嘌呤生物堿標(biāo)品：咖啡堿（Caffeine，CAF）、可可堿（Theobromine，TB）、苦茶堿（Theacrine，TC）、茶葉堿（Theophylline，TP）。色譜純甲醇（安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；色譜純乙腈（上海默克化工技術(shù)有限公司）；色譜純甲酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸銨（安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 兒茶素組分測定方法

采用高效液相色譜法，參照王麗麗等［15］方法稍作修改。色譜條件：C18反相色譜柱(5 μm，4.6×250 mm)；流動相A為0.2%甲酸水溶液（v:v），流動相B為甲醇；流速1.00 mL·min-1；柱溫40℃；進(jìn)樣量10 μL；梯度洗脫條件：0～2 min，88% A；2～ 10 min，88% ～ 75% A；10～15 min，75%～73% A；15～25 min，73%～68% A；25～30 min，68% A；30～32 min, 68%～88% A。

樣品前處理方法：稱取0.200 g樣品，加入30 mL甲醇，渦旋，超聲提取30 min，冷卻后于4℃、10000 r·min-1離心5 min，上清液過0.22μm有機(jī)相微孔濾膜，上機(jī)待測。

1.3.2 生物堿組分測定方法

采用液質(zhì)聯(lián)用方法測定，色譜柱為：C18反相色譜柱（2.6 μm，2.1×100 mm），參照陳瀟敏［11］等方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個供試樣品各采集3次重復(fù)，測定后，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示其含量；使用SPSS19.0軟件（美國，IBM公司）和Microsoft Excel 2019（美國，Microsoft公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及表格制作；以O(shè)rigin 2018（美國，OriginLab公司）制作折線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 福建苦茶資源不同葉位兒茶素總量及嘌呤生物堿總量分析

本研究對供試苦茶資源春梢不同葉位兒茶素總量和嘌呤生物堿總量進(jìn)行了測定。3份福建苦茶資源及對照品種福鼎大白茶的不同葉位兒茶素總量和嘌呤生物堿總量如表1所示。結(jié)果表明，安溪、云霄、大田等苦茶芽葉的兒茶素總量和嘌呤生物堿總量差異明顯，其中安溪苦茶兒茶素總量最高，其第二葉位含量為244.18 mg·g-1；安溪苦茶和云霄苦茶不同葉位兒茶素總量差異未達(dá)到顯著水平。大田苦茶兒茶素總量較低，其不同葉位變化趨勢與對照品種福鼎大白茶相似，均表現(xiàn)為第二葉與第三葉含量較高，第一葉含量顯著低于第二葉與第三葉。云霄苦茶嘌呤生物堿總量最高，屬于高嘌呤生物堿茶樹種質(zhì)，其春梢第二葉位嘌呤生物堿含量達(dá)到79.44 mg·g-1，但不同葉位之間嘌呤生物堿總量的差異未達(dá)到顯著水平。大田苦茶、安溪苦茶與對照品種福鼎大白茶的嘌呤生物堿總量接近，且變化趨勢一致，均表現(xiàn)為第一葉至第二葉呈上升趨勢，而從第二葉開始遞減，第二葉的嘌呤生物堿總量與第四葉的嘌呤生物堿總量均存在顯著差異。

表1 福建苦茶資源不同葉位兒茶素和生物堿總含量Table 1 Contents of catechins and alkaloids in leaves located differently on Fujian bitter tea plants （單位：mg·g-1）

（接表1）

對3份福建苦茶資源及對照品種福鼎大白茶的兒茶素總量和嘌呤生物堿總量進(jìn)行了雙因素方差分析，結(jié)果如表2所示，不同種質(zhì)間的兒茶素總量和嘌呤生物堿總量的差異達(dá)到極顯著水平，不同葉位間的嘌呤生物堿總量的差異達(dá)到顯著水平，而不同葉位間的兒茶素總量的差異未達(dá)到顯著水平。

表2 參試種質(zhì)、葉位間的方差分析檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Analysis of variance on germplasms and leaf position

2.2 福建苦茶資源不同葉位兒茶素組分含量分析

本研究測定了9種主要兒茶素（色譜圖見圖1），其中GC、GCG和CG在3份苦茶資源和對照品種福鼎大白茶中均未檢出（圖2）。根據(jù)圖2可知，供試茶樹資源在所檢測出的6種主要兒茶素組分含量配比上存在差異，兒茶素組分含量中最高的是EGCG，在3份苦茶資源的不同葉位中均檢測出EGCG3"Me，而在對照品種福鼎大白茶僅在第一葉中檢出EGCG3"Me。

圖1 兒茶素組分標(biāo)品色譜圖（濃度為400 μg·mL-1）Fig. 1 Chromatogram of catechin standards（STD400）

圖2 福建苦茶資源不同葉位兒茶素組分色譜圖Fig. 2 Chromatogram of catechins in leaves located differently on Fujian bitter tea plants

供試茶樹資源兒茶素組分在不同品種不同葉位的含量如表3所示。就不同葉位而言，EGCG和EGC含量隨著葉位的增加大致呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，EGCG3"Me和EC含量在不同葉位呈遞增趨勢，而ECG和C含量則相反，呈遞減趨勢。就不同苦茶資源而言，云霄苦茶與安溪苦茶的兒茶素組分含量變化趨勢與對照品種福鼎大白茶相似，表現(xiàn)為EGC和EC含量遞增，C、EGCG和ECG含量遞減，EGCG3"Me、C含量在云霄苦茶和安溪苦茶中呈遞增趨勢。而大田苦茶的兒茶素組分含量變化趨勢無明顯規(guī)律。

表3 福建苦茶資源及對照品種兒茶素組分含量Table 3 Catechins in leaves of Fujian bitter tea plants and control variety （單位：mg·g-1）

2.3 福建苦茶資源不同葉位嘌呤生物堿組分含量分析

本研究測定了4種主要嘌呤生物堿，即咖啡堿（CAF）、可可堿（TC）、茶葉堿（TP）和苦茶堿（TC），總離子流圖見圖4。其中茶葉堿（TP）在3份苦茶資源和對照品種福鼎大白茶中均未檢出。云霄苦茶和大田苦茶的苦茶堿含量超過30 mg·g-1，屬于高苦茶堿茶樹種質(zhì)。供試茶樹資源在所檢測出的3種主要嘌呤生物堿組分含量配比上存在差異，云霄苦茶、安溪苦茶和對照品種福鼎大白茶均是以咖啡堿為主要嘌呤生物堿，而大田苦茶的嘌呤生物堿分布模式異于其它3份茶樹資源，其苦茶堿含量高于咖啡堿含量。在3份苦茶資源的不同葉位中均檢測出苦茶堿，而在對照品種福鼎大白茶中未檢出。就不同茶樹種質(zhì)而言，3份苦茶資源的嘌呤生物堿含量變化趨勢與對照品種福鼎大白茶相似，表現(xiàn)為咖啡堿和可可堿含量遞減，而苦茶堿在苦茶資源中表現(xiàn)為遞增趨勢。

圖4 福建苦茶資源不同葉位嘌呤生物堿組分總離子流圖Fig. 4 TIC of purine alkaloid in leaves located differently on Fujian bitter tea plants

參試茶樹資源不同葉位的嘌呤生物堿組分含量如表4所示。咖啡堿含量在4份茶樹資源中均呈遞減趨勢，且第一葉含量顯著高于第四葉含量?？嗖鑹A含量在云霄苦茶和安溪苦茶中表現(xiàn)為遞增趨勢，而在大田苦茶中表現(xiàn)為先增后減。除云霄苦茶外，可可堿含量在其他3份茶樹資源中呈遞減趨勢，而云霄苦茶的不同葉位間的可可堿含量差異很小。

圖3 嘌呤生物堿組分標(biāo)品總離子流圖（濃度為500 μg·mL-1）Fig. 3 TIC of purine alkaloid standards (STD500)

表4 3份福建苦茶資源及對照品種嘌呤生物堿組分含量Table 4 Purine alkaloids contents in leaves of 3 bitter tea rescources of Fujian and control varirety （單位：mg·g-1）

（接表4）

3 討論與結(jié)論

福建地處我國東南沿海，東經(jīng)115°51′～120°43′，北緯 23°33′～ 28°19′之間，屬于中亞熱帶和南亞熱帶氣候，雨量充沛，茶樹種質(zhì)資源豐富，不僅擁有優(yōu)異的紅、綠茶和烏龍茶品種，還有大量野生茶樹種質(zhì)資源［16］。茶葉中的兒茶素屬于黃烷醇類化合物，是茶葉的主要品質(zhì)成分，對提高茶湯滋味品質(zhì)有積極作用［17］。茶葉生物堿是茶樹芽葉中的一類擁有共同嘌呤環(huán)結(jié)構(gòu)的有機(jī)物，具苦味，與茶黃素以氫鍵締合后形成的復(fù)合物呈現(xiàn)鮮爽味［18］，因此生物堿含量被認(rèn)為是影響茶葉品質(zhì)的重要因素。本研究中，安溪苦茶和云霄苦茶的兒茶素總量顯著高于福鼎大白茶，屬于高兒茶素茶樹種質(zhì)資源。云霄苦茶各葉位的嘌呤生物堿總量顯著高于對照種和其他兩份苦茶資源，4個葉位的嘌呤生物堿總量都高達(dá)70 mg·g-1以上，屬高生物堿特異茶樹種質(zhì)資源。

不同茶樹品種的生化成分存在差異［19］，本研究中的苦茶資源兒茶素和嘌呤生物堿含量和組成以及它們在不同葉位的分布也存在差異。本研究供試苦茶資源在所檢測出的6種主要兒茶素組分含量配比上存在差異，兒茶素組分含量中最高的是EGCG，總體趨勢為EGCG＞ECG＞EGC＞EGCG3"Me＞EC＞C，這與前人的研究結(jié)果一致［15］。而安溪苦茶和云霄苦茶不同葉位間兒茶素總量差異未達(dá)到顯著水平，其原因是EGCG、ECG含量隨著葉位遞增呈現(xiàn)下降趨勢，而EGCG3"Me、EGC含量是呈現(xiàn)上升趨勢。值得注意的是，3份苦茶資源的不同葉位中均檢測出較高含量的EGCG3"Me（＞1%），EGCG3"Me是茶葉中甲基化兒茶素化合物，具有抗過敏、改善腸道、預(yù)防糖尿病、防肥胖、降血壓、保護(hù)肝臟等保健功效［20－25］，與其他類型的兒茶素相比具有更強(qiáng)的抗過敏作用，且在動物血液中更加穩(wěn)定，口服吸收率比EGCG高9倍［26］，前人研究表明，隨著葉片成熟度的增加，茶葉中EGCG3"Me的含量有增加趨勢，一般來說，茶樹新梢的第三葉或者第四葉含量達(dá)到最高水平［27］,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究篩選獲得的高EGCG3"Me茶樹種質(zhì)資源，為其之后的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

在現(xiàn)有生產(chǎn)上的茶樹栽培品種中，茶樹嘌呤生物堿的分布模式主要是以咖啡堿為主，含有少量的可可堿和微量的茶葉堿。前人研究發(fā)現(xiàn)含有苦茶堿的野生茶樹或者茶樹野生近緣種資源研究主要集中于廣東、江西、貴州、云南等地區(qū)，近年來福建地區(qū)含苦茶堿的野生資源被挖掘，陳瀟敏等首次發(fā)現(xiàn)了福建含有苦茶堿的特異資源——蕉城苦茶，并初步探究了其苦茶堿形成的分子機(jī)理［29］。云霄苦茶和安溪苦茶春梢隨葉位增加，其苦茶堿含量呈遞增趨勢，與滕杰等［30］關(guān)于禿房茶的研究結(jié)果一致。然而大田苦茶不同葉位苦茶堿含量的變化趨勢有別于云霄苦茶和大田苦茶，表現(xiàn)為先增后減的趨勢，與李紅建等［31］關(guān)于廣東苦茶資源的研究結(jié)果類似，可能是茶樹種質(zhì)間的基因型造成的差異。本研究的福建苦茶資源在所檢測出的3種主要嘌呤生物堿組分含量配比上存在差異，云霄苦茶、安溪苦茶和對照品種福鼎大白茶均是以咖啡堿為主要嘌呤生物堿，而大田苦茶的苦茶堿含量顯著高于咖啡堿含量，屬于高苦茶堿低咖啡堿的特異茶樹種質(zhì)，該種質(zhì)的品質(zhì)化學(xué)特征有待進(jìn)一步深入研究。