TNF-α對(duì)三種牙源性干細(xì)胞增殖分化能力影響的比較研究

趙 琦 齊 霞 李 雅 魯曉琪 李淑娟

牙周炎是累及牙周支持組織的破壞性疾病，通常伴有牙槽骨吸收，目前修復(fù)缺失軟硬組織的有效方法是牙周組織再生，而選取合適的種子細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)再生的關(guān)鍵。牙源性干細(xì)胞取材方便、來源普遍，體外增殖能力強(qiáng)，免疫原性低，無致瘤反應(yīng)[1～3]。其中，牙齦干細(xì)胞（gingival mesenchymal stem cells，GMSCs）、牙髓干 細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）和牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）已被證實(shí)在特定的誘導(dǎo)環(huán)境下可分化成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞等[4]，諸多特性使得它們?cè)谘乐芙M織再生研究中受到廣泛關(guān)注，但關(guān)于三者特性的比較鮮有報(bào)道。

牙周炎最主要的臨床表現(xiàn)是牙槽骨吸收，在骨吸收過程中炎性介質(zhì)起重要作用。腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）是一種具有先導(dǎo)性、多向性的炎癥因子，其主要由巨噬細(xì)胞分泌釋放，被認(rèn)為是牙槽骨吸收過程中典型炎癥因子之一[5，6]。有研究表明，牙周炎患者體內(nèi)的TNF-α 含量明顯高于牙周健康者，而調(diào)節(jié)患者齦溝液內(nèi)TNF-α水平，可促進(jìn)牙周狀態(tài)的修復(fù)[7]，證實(shí)TNF-α 與牙周炎發(fā)病及疾病進(jìn)展密切相關(guān)。

因此，本實(shí)驗(yàn)在體外分離培養(yǎng)同一供體來源的人牙齦干細(xì)胞（human gingival mesenchymal stem cells，hGMSCs）、人牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs） 和人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs），對(duì)三種干細(xì)胞的增殖、成骨及成脂能力進(jìn)行綜合對(duì)比，并探究特定濃度的TNF-α 對(duì)三種干細(xì)胞性能的影響，從而為牙周組織再生中種子細(xì)胞的選取和優(yōu)化提供理論依據(jù)。

資料和方法

1.標(biāo)本來源

本實(shí)驗(yàn)獲得河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2019-036），收集河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院患者年齡在18 歲到25 歲之間因正畸或阻生等原因拔除的健康第三磨牙及阻生齒拔除術(shù)中切取的少量廢棄牙齦組織，患者知情同意。所有收集的牙齒保證牙體完整，無齲壞、牙髓炎、根尖周炎、牙周炎等疾病，牙齦組織正常無炎癥。牙齒及牙齦收集過程中保證無菌操作，標(biāo)本離體后迅速置于樣本收集液中，并迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)操作。

2.主要試劑及儀器

胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco 公司）；DMEM 培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone 公司）；TNF-α、細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒（CCK-8）、茜素紅S 染色液（0.2%）、油紅O 染色液（細(xì)胞專用）、堿性磷酸酶染色試劑盒（北京索萊寶公司）；成骨誘導(dǎo)分化試劑盒、成脂誘導(dǎo)分化試劑盒（廣州賽業(yè)公司）；堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒、BCA 蛋白濃度試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)NUNR 公司）；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)EPPENDORF 公司）；Bio-tek 酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）。

3.hGMSCs、hDPSCs 和hPDLSCs 的分離培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化

在超凈工作臺(tái)下分離牙齦組織、牙髓組織及牙周膜組織（為了避免供體不同導(dǎo)致的差異性，選擇同一供體來源的牙齒），用PBS 沖洗2～3次，將其剪至1.0 mm3；將組織塊貼于25 cm2的培養(yǎng)瓶底部，瓶?jī)?nèi)添加含10%FBS、2%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每2～3 d 換液一次，期間在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀況。細(xì)胞生長(zhǎng)80%后，用0.25%胰酶消化傳代，并接種到6孔板中，分別加入正常和含10 ng/mL TNF-α 的成骨、成脂誘導(dǎo)液連續(xù)培養(yǎng)21 d。

4.檢測(cè)指標(biāo)

表面標(biāo)記物檢測(cè)：取第3 代的hGMSCs、hDPSCs和hPDLSCs 用胰酶消化，置于分別加入適量FITC標(biāo)記的CD29、CD34、CD45、CD105 抗體EP 管中，避光孵育20min 后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)記物。CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：同時(shí)將第3 代細(xì)胞接種于96 孔板（2.5×103個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁后分別加入正常和含10 ng/mL TNF-α 的DMEM 培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、168 h，PBS 沖洗后加10 μL CCK-8 檢測(cè)液，避光孵育3 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)下的吸光度。成骨分化情況：成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 天后進(jìn)行ALP 染色，ALP 檢測(cè)試劑盒和BCA 蛋白濃度試劑盒檢測(cè)ALP 活性；21 天后進(jìn)行茜素紅染色，棄原液，多聚甲醛固定10 min，吸干加入茜素紅S 染色液20 min，加蒸餾水鏡檢（每個(gè)步驟之間均用PBS 沖洗3次）。成脂分化情況：成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)21 天后進(jìn)行油紅O 染色，棄原液，加入ORO 固定20 min，60%異丙醇浸洗5 min，吸去后加ORO 染色液15 min，Mayer 蘇木素染色液復(fù)染2 min，加入ORO 緩沖液1 min，棄去后加入PBS 鏡檢（每步之間用PBS 沖洗3次）。然后用異丙醇將脂滴溶解，檢測(cè)酶標(biāo)儀下波長(zhǎng)520 nm 時(shí)的吸光度，檢測(cè)脂滴形成量。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示，單因素方差分析用于組間比較；如方差齊，運(yùn)用Bonferroni’s檢驗(yàn)，如方差不齊，則運(yùn)用Tamhane’s T2檢驗(yàn)，P＜0.05 時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.hGMSCs、hDPSCs 和hPDLSCs 的分離培養(yǎng)

三種干細(xì)胞在正常和10 ng/mL TNF-α 條件下均能貼壁生長(zhǎng)，顯微鏡下形態(tài)為多角形或長(zhǎng)梭形，兩組細(xì)胞形態(tài)類似，無明顯差異（圖1）。

圖1 正常和TNF-α 條件下三種干細(xì)胞的形態(tài)（ ×200）

2.hGMSCs、hDPSCs 和hPDLSCs 表面標(biāo)記物的鑒定

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，三種干細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物均表達(dá)為陽(yáng)性，造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)為陰性（圖2、表1）。

表1 hGMSCs、hDPSCs、hPDLSCs 的抗體表達(dá)量

圖2 hGMSCs、hDPSCs、hPDLSCs 表面標(biāo)記物檢測(cè)

3.hGMSCs、hDPSCs 和hPDLSCs 的增殖情況

48 h 以內(nèi)，對(duì)照組和TNF-α 組的增殖情況差異不明顯（P＞0.05）；干預(yù)48 h 后，相比于對(duì)照組，TNF-α 組三種干細(xì)胞增殖速率呈下降趨勢(shì)，其中hGMSCs 的增殖速率在三種干細(xì)胞中仍最高，hPDLSCs 增殖速率顯著降低（P＜0.05）。因此，10 ng/mL TNF-α 對(duì)hGMSCs 增殖產(chǎn)生的抑制作用最小，對(duì)hPDLSCs 的抑制作用最明顯（圖3）。

圖3 三種干細(xì)胞在不同環(huán)境下的生長(zhǎng)曲線

4.hGMSCs、hDPSCs 和hPDLSCs 的ALP 表達(dá)量比較

ALP 染色顯示，染色深度如下：hPDLSCs＞hDPSCs＞hGMSCs；與單純成骨誘導(dǎo)組（Osteo 組）相比，成骨誘導(dǎo)+TNF-α 組（Osteo+TNF-α 組）染色較淺，空白對(duì)照組（Control 組）染色最淺，染色深淺即代表ALP 活性的高低（圖4A）。ALP 活性檢測(cè)顯示，10 ng/mL TNF-α 條件下hGMSCs、hDPSCs 和hPDLSCs 的ALP 活性均降低（P＜0.05），其中hPDLSCs 在正常成骨誘導(dǎo)和TNF-α 的成骨誘導(dǎo)環(huán)境下的ALP 活性均高于hGMSCs、hDPSCs（P＜0.01），hDPSCs 的ALP 活性稍高于hGMSCs（P＜0.05），而hPDLSCs 的ALP 活性下降受TNF-α 影響相對(duì)明顯（P＜0.01），此結(jié)果與ALP 染色結(jié)果相一致（圖4B）。

圖4 A：體外成骨誘導(dǎo)7 天時(shí)ALP 染色。B：hGMSCs、hDPSCs、hPDLSCs 的ALP 活性（注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

5.hGMSCs、hDPSCs 和hPDLSCs 的成骨能力比較

茜素紅染色發(fā)現(xiàn)，正常和含10 ng/mL TNF-α的成骨培養(yǎng)液中均有明顯的鈣化結(jié)節(jié)產(chǎn)生，單純成骨誘導(dǎo)組（Osteo 組）的鈣化結(jié)節(jié)明顯多于成骨誘導(dǎo)+TNF-α 組（Osteo+TNF-α 組）（P＜0.05），三種干細(xì)胞成骨能力比較：hPDLSCs＞hDPSCs＞hGMSCs（圖5）。

圖5 體外成骨誘導(dǎo)21 天時(shí)茜素紅染色（ ×200）

6.hGMSCs、hDPSCs 和hPDLSCs 的成脂能力比較

油紅O 染色發(fā)現(xiàn)，正常和含10 ng/mL TNF-α的成脂誘導(dǎo)液中均有脂滴形成，單純成脂誘導(dǎo)組（Adipo 組）脂滴明顯多于誘導(dǎo)+TNF-α 組（Adipo+TNF-α 組）（P＜0.05），成脂能力比較：hGMSCs＞hDPSCs＞hPDLSCs（圖6A）；三種干細(xì)胞的脂滴形成量比較，10 ng/mL TNF-α 環(huán)境下三種干細(xì)胞的脂滴形成量均減少，其中hGMSCs 脂滴形成量多于hDPSCs，hDPSCs 脂滴形成量略多于hPDLSCs（P＞0.05），hGMSCs 脂滴形成量顯著多于hPDLSCs（P＜0.01）（圖6B）。

圖6 A：體外成脂誘導(dǎo)21 天時(shí)油紅O 染色（ ×200），B：脂滴定量比較（注：*P＜0.05，**P＜0.01，NS P＞0.05）

討 論

牙槽骨缺損的修復(fù)是牙周炎治療中的難點(diǎn)所在，隨著牙周組織再生工程技術(shù)的發(fā)展，將干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）應(yīng)用于牙周軟硬組織缺損的治療逐漸成為研究熱點(diǎn)。但在MSCs 修復(fù)牙周組織缺損的過程中，不可避免地接觸炎癥微環(huán)境，在炎癥刺激下，來自正常組織的MSCs 的生物學(xué)特性會(huì)發(fā)生怎樣的變化，是否會(huì)影響牙周軟硬組織的修復(fù)，以及理想種子細(xì)胞的選取與優(yōu)化是我們需要解決的問題。與其他組織來源的MSCs 相比，牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖分化能力和優(yōu)異的多向分化潛能，在特定誘導(dǎo)條件下可分化為骨、軟骨及脂肪等細(xì)胞。因其來源廣泛、易于存活、多次傳代后性能穩(wěn)定、免疫原性低以及對(duì)患者造成創(chuàng)傷小的特性[8]，現(xiàn)已成為牙周再生研究的種子細(xì)胞，目前常用于實(shí)驗(yàn)及臨床研究的牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞主要包括GMSCs、DPSCs 和PDLSCs。因此，本實(shí)驗(yàn)選取這三種MSCs 進(jìn)行研究，同時(shí)為了避免供體差異性，我們采用同一供體來源的GMSCs、DPSCs 和PDLSCs，進(jìn)而得出更為準(zhǔn)確可靠的比較結(jié)果。

ALP 是一種廣泛分布于人體內(nèi)的磷酸單酯水解酶，是牙周組織中成骨細(xì)胞的重要標(biāo)志物，在骨組織礦化過程中起重要作用，同時(shí)可以準(zhǔn)確反應(yīng)成骨細(xì)胞的代謝水平[9]。當(dāng)成骨細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞開始分化時(shí)ALP 活性最高，在礦化結(jié)束時(shí)活性處于最低水平[10，11]。隨干細(xì)胞體外擴(kuò)增代數(shù)增加細(xì)胞增殖能力和ALP 分泌量呈逐漸下降趨勢(shì)，表明ALP 含量的多少對(duì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨的能力有重要影響，同時(shí)成骨細(xì)胞增殖能力與ALP 水平呈正相關(guān)[12]。因此，檢測(cè)ALP 表達(dá)情況對(duì)于評(píng)價(jià)干細(xì)胞的成骨代謝水平具有重要意義。

TNF-α 是牙周炎中主要炎癥因子，與牙周炎的活動(dòng)性密切相關(guān)，其主要由激活的巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生[13]。在炎癥牙周組織中，TNF-α 可直接抑制成骨細(xì)胞生成分化，并干擾成骨基因及蛋白表達(dá)；同時(shí)可促進(jìn)IL-6（interleukin-6）和IL-1β（interleukin-1β）等炎癥因子侵入牙周組織，產(chǎn)生金屬蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，間接激活免疫反應(yīng)，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)并加速骨破壞[14～16]。此外，TNF-α也可通過抑制前脂肪細(xì)胞分化或已定型的脂肪細(xì)胞去分化，從而抑制成熟脂肪細(xì)胞的形成[17]。骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）對(duì)誘導(dǎo)MSCs成骨分化具有重要作用。有研究表明[13]，TNF-α 可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（nuclear transcription factor kappa B，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/c-Jun 氨基 末 端 激 酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、P38/MAPK 等信號(hào)通路間接抑制BMP 的表達(dá)，進(jìn)而抑制MSCs 成骨分化；也有學(xué)者[18]認(rèn)為TNF-α 可通過上述途徑促進(jìn)BMP 表達(dá)和成骨分化。TNF-α 對(duì)BMP 不同的調(diào)控作用主要取決于TNF-α 干預(yù)的濃度及時(shí)間。低濃度TNF-α（0.1～10 ng/mL）在干預(yù)較短時(shí)間（48 h 以內(nèi)）時(shí)， TNF-α 會(huì)促進(jìn)BMP 表達(dá)及MSCs 成骨分化，但對(duì)MSCs 的增殖能力影響不大；隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，MSCs 的增殖及成骨分化均受到明顯抑制；較高濃度TNF-α（20～200 ng/mL）干預(yù)時(shí)，BMP 表達(dá)增強(qiáng)，但MSCs 的成骨分化受到明顯抑制[19，20]。其原因可能是較高濃度的TNF-α 及其活化的NF-κB 信號(hào)通路提升BMP 抑制因子的表達(dá)水平，從而使細(xì)胞對(duì)BMP 刺激的反應(yīng)性降低[21]。此外，較高濃度TNF-α 可誘導(dǎo)部分MSCs 發(fā)生凋亡[22]。有學(xué)者[23]采用不同濃度的TNF-α 對(duì)人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于其他濃度的TNF-α，10 ng/mL 的TNF-α 對(duì)人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞成骨分化抑制作用顯著，且破骨相關(guān)蛋白明顯增高。而陳小燕[24]利用含10 ng/mL TNF-α 的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)hPDLSCs，發(fā)現(xiàn)hPDLSCs 成骨分化能力同樣顯著降低。因此，本實(shí)驗(yàn)選用對(duì)MSCs 增殖分化有抑制作用，又不會(huì)使其發(fā)生凋亡的10 ng/mL TNF-α 進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在48 h 內(nèi)，10 ng/mL的TNF-α 對(duì)hGMSCs、hDPSCs、hPDLSCs 的增殖均無明顯影響，在48 h 以后，三種干細(xì)胞的增殖能力受到不同程度的抑制作用；此外，在10 ng/mL TNF-α 的成骨、成脂誘導(dǎo)液中培養(yǎng)21 天后，三種干細(xì)胞的成骨、成脂能力均受到不同程度抑制。其中hPDLSCs 的增殖及成骨成脂能力受抑制作用最明顯，hGMSCs 受抑制影響最小。

從牙周組織再生的臨床應(yīng)用出發(fā)，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中重點(diǎn)關(guān)注三種干細(xì)胞在炎癥刺激下的成骨能力，其中hGMSCs 的成骨能力受TNF-α 的影響小，這可能與GMSCs 強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力有關(guān)。有研究表明[25]，利用GMSCs 的免疫調(diào)節(jié)可促進(jìn)組織再生和傷口愈合，并抑制過敏反應(yīng)，也為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病提供了一種新型治療策略。也有學(xué)者[26]發(fā)現(xiàn)，正常牙齦組織和炎癥牙齦組織來源的GMSCs 生物學(xué)特性基本相同，均具有自我更新和多向分化潛能，進(jìn)一步證實(shí)了GMSCs 強(qiáng)大的抵御炎癥能力。而PDLSCs 的成骨能力受TNF-α 的抑制作用相對(duì)明顯，這可能與成骨相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)，TNF-α 不僅可以直接作用于NF-κB、Wnt、MAPK、BMP、PI3K/AKT 等成骨相關(guān)信號(hào)通路，還能夠通過信號(hào)通路之間的相互干擾影響PDLSCs 成骨。有研究發(fā)現(xiàn)[27，28]，在牙周炎癥微環(huán)境會(huì)激活NF-κB 通路，可促進(jìn)β 連環(huán)蛋白（β-catenin）降解，同時(shí)，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路使β-catenin 高表達(dá)，從而抑制PDLSCs 的成骨分化并促進(jìn)其向破骨細(xì)胞分化。有學(xué)者[29]利用顆粒蛋白前體抑制TNF-α 激活的NF-κB 信號(hào)通路，從而促進(jìn)了PDLSCs 成骨分化。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10 ng/mL TNF-α 對(duì)hGMSCs、hDPSCs、hPDLSCs 的增殖和成骨成脂分化能力均具有抑制作用，其中hGMSCs 表現(xiàn)出的增殖能力和抵御TNF-α 刺激的能力最強(qiáng)，提示在應(yīng)用過程中應(yīng)盡量誘導(dǎo)提高其分化能力；hPDLSCs 的成骨分化能力最強(qiáng)，但提高其對(duì)TNF-α 的抵抗能力至關(guān)重要，本研究為后續(xù)牙周組織再生過程中種子細(xì)胞的選取及優(yōu)化提供了實(shí)驗(yàn)參考。