單因素實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化韭菜籽中皂苷提取工藝

沈 婧

（蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇蘇州 215000）

我國的韭菜籽儲(chǔ)備十分充足，作為行氣理血、溫補(bǔ)腎陽的食材，用于食療入藥已有超過千年的傳統(tǒng)歷史。而迄今為止，民間篤信的韭菜籽滋補(bǔ)肝腎、抗疲勞功能還未有過真實(shí)可靠的書面報(bào)道，其藥效或藥理研究也是寥寥無幾[1]。高效分離出韭菜籽中有效成分對于今后研究者或是藥物研發(fā)單位都有著十分重要的意義[2]。本研究利用分光比色法探究優(yōu)化韭菜籽中皂苷的提取工藝，提純出韭菜籽中抗疲勞成分，為發(fā)揮其功能性物質(zhì)成分的作用奠定基礎(chǔ)[3]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

RE52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市榮化；WFJ UV-2000 紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯；EL204 電子分析天平，上海梅特勒-托利多。

1.2 材料與試劑

95%工業(yè)酒精；無水乙醇、冰醋酸、高氯酸和香草醛，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 韭菜籽中皂苷提取工藝

目前國內(nèi)從中草藥中提取活性成分的工藝主要有溶劑萃取法、沉淀法、鹽析法、透析法等。桑圣明等[4]用溶劑萃取法從韭菜籽中分離確認(rèn)出生物堿、皂苷類以及酰胺類化合物。溶劑萃取法中溶劑的挑選，要滿足對目標(biāo)物溶解度大、對非目標(biāo)物溶解度小的要求，依據(jù)這一點(diǎn)性質(zhì)將目標(biāo)物從中草藥中溶解出來[5]。粉碎好的中草藥泡在選好的溶劑中時(shí)，通過擴(kuò)散作用，溶劑分子透過細(xì)胞壁滲入草藥組織細(xì)胞內(nèi)，溶解目標(biāo)物，使得細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)物濃度大于細(xì)胞外，構(gòu)成了濃度差，于是細(xì)胞內(nèi)高濃度溶液不斷透過細(xì)胞壁向細(xì)胞外擴(kuò)散，同時(shí)細(xì)胞外的低濃度溶劑又滲入組織細(xì)胞內(nèi)。本研究選用酒精作為溶劑提取韭菜籽中的皂苷，并用分光比色法測定總皂苷的含量。

1.3.2 提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)探究

用破壁機(jī)將干燥的韭菜籽打成韭菜籽粉末，過4號篩，備用。

（1）酒精濃度單因素實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)備6 個(gè)150 mL 干凈的具塞玻璃錐形瓶，準(zhǔn)確稱取6 份0.2 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后4 位）的韭菜籽粉末于錐形瓶中。用量筒量取50 mL 的純凈水以及30%vol、40%vol、50%vol、55%vol 和60%vol 的酒精溶液，分別加入6 個(gè)錐形瓶中，搖勻。在20 ℃恒溫水浴中回流1 h，靜置后取上層清液過濾，重復(fù)提取3 次，將收集到的濾液采用分光比色法測定總皂苷的含量，計(jì)算皂苷提取率。

（2）料液比單因素實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)備4 個(gè)干凈的150 mL和2個(gè)500 mL具塞玻璃錐形瓶，準(zhǔn)確稱取6份0.2 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后4 位）的韭菜籽粉末于錐形瓶中。分別用移液槍和量筒準(zhǔn)確量取12.5 mL（1∶62.5 g∶mL）、25.0 mL（1 ∶125 g ∶mL）、50.0 mL（1 ∶250 g ∶mL）、100.0 mL（1∶500 g∶mL）、200.0 mL（1∶1 000 g∶mL）和400 mL（1 ∶2 000 g ∶mL）的50%vol 酒精溶液，分別加入6 個(gè)錐形瓶中，搖勻。在20 ℃恒溫水浴中回流1 h，靜置后取上層清液過濾，重復(fù)提取3 次，將收集到的濾液采用分光比色法測定總皂苷的含量，計(jì)算皂苷提取率。

（3）提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)備6 個(gè)干凈的150 mL 具塞玻璃錐形瓶，準(zhǔn)確稱取6 份0.2 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后4 位）的韭菜籽粉末于錐形瓶中。分別用量筒量取50 mL 的60%vol 酒精溶液加入錐形瓶，搖勻。分別控制在恒溫水浴溫度為20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃的條件下回流1 h，靜置后取上清液過濾，重復(fù)提取3 次，取收集到的濾液采用分光比色法測定總皂苷的含量，計(jì)算皂苷提取率。

（4）提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)備6 個(gè)干凈的150 mL 具塞玻璃錐形瓶，準(zhǔn)確稱取6 份0.2 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后4 位）的韭菜籽粉末于錐形瓶中。用量筒準(zhǔn)確加入50 mL 的60%vol 酒精溶液，分別在恒溫60 ℃水浴的條件下回流1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 和6 h，靜置后取上清液過濾，重復(fù)提取3 次，取濾液采用分光比色法測定總皂苷的含量，計(jì)算皂苷提取率。

1.3.3 分光比色法測定總皂苷的含量

（1）對照品溶液的制備。取對照品10 mg，用甲醇定容至10 mL，充分混勻使之溶解，得到對照品溶液，其濃度10 mg/mL。

（2）韭菜籽提取液的制備。將韭菜籽放入破壁機(jī)打碎后過篩得到韭菜籽粉末，精密稱量韭菜籽粉末0.200 0 g 置于錐形瓶中。用量筒量取50 mL 一定度數(shù)的乙醇溶液加入錐形瓶中進(jìn)行提取，充分振蕩錐形瓶，提取后過濾出濾液待測。

（3）測定波長的選擇。用合適量程范圍的移液槍分別準(zhǔn)確移取1.5 mL 對照品溶液、1 mL 韭菜籽預(yù)先粗提取液于干凈磨口錐形瓶中，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶液至近干的狀態(tài)。迅速用移液槍準(zhǔn)確向錐形瓶中加入0.8 mL 的高氯酸、0.2 mL 的5%香草醛-冰醋酸（不可用久置試劑，現(xiàn)用現(xiàn)配），使瓶內(nèi)物質(zhì)完全溶解，皆置于60 ℃水浴中進(jìn)行顯色反應(yīng)15 min，而后用流動(dòng)水快速冷卻旋蒸瓶。加入5 mL 冰醋酸搖晃均勻，立即（防止冰醋酸揮發(fā)產(chǎn)生較大誤差）在400 ～800 nm 波長下掃描紫外分光光度，記錄數(shù)據(jù)與曲線圖。如圖1、圖2 所示，對照品（即純品）跑出吸光度曲線中的高峰（標(biāo)記2），與韭菜籽粗提取液跑出吸光度曲線中的高峰（標(biāo)記2）是在同一波長區(qū)域的位置，則能夠確定兩個(gè)位置的物質(zhì)為同一物質(zhì)——皂苷。由此可以得到分光比色法測定韭菜籽中皂苷的波長為454 nm，為后續(xù)測定做準(zhǔn)備。

圖1 200 ～1 000 nm 韭菜籽純品中皂苷的吸光度曲線

圖2 200 ～1 000 nm 韭菜籽提取液中皂苷的吸光度曲線

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。用移液槍分別準(zhǔn)確吸取對照品溶液（1 mg/mL）0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.25 mL、0.35 mL、0.45 mL 和0.55 mL，于干凈的25 mL 圓底燒瓶中。70 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，迅速用移液槍準(zhǔn)確加入0.8 mL 的高氯酸，0.2 mL 的5%香草醛-冰醋酸，同時(shí)作一空白樣，皆置于60 ℃水浴顯色15 min 后，用流動(dòng)水迅速冷卻燒瓶。加入5 mL 冰醋酸搖晃均勻，立即在454 nm 下測定吸光度，記錄數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（5）樣品皂苷含量測定。用移液槍精密移取2 mL韭菜籽提取液于干凈磨口錐形瓶中，按（4）中步驟測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中皂苷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

由1.3.3（4）中測得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3 所示。韭菜籽中皂苷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.840 5x-0.007 7，R2=0.993 4。

圖3 皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同酒精濃度對韭菜籽中皂苷提取率的影響

在整個(gè)提取工藝中，提取劑的支出成本占總成本的比重較大，考慮到節(jié)約成本是企業(yè)獲利的一個(gè)重要方面，就要最大限度地發(fā)揮提取液的提取效果。傳統(tǒng)工藝中，草本中藥中的提取物多為簡單可取的資源，例如用酒精或者水作為溶劑來提取，選擇合適的酒精提取液濃度也可以合理有效地減少提取的成本。由圖4 可知，當(dāng)使用50%vol 酒精時(shí)，韭菜籽中皂苷的提取效果最佳，因此選取50%vol 的酒精是最為合理的。

圖4 不同酒精濃度對韭菜籽中皂苷提取率的影響

2.2.2 不同料液比對韭菜籽中皂苷提取率的影響

料液比越大，則意味著細(xì)胞內(nèi)的液體濃度與細(xì)胞外溶劑之間的濃度差越大，活性物質(zhì)分子的擴(kuò)散速率也就越快，滲透作用加速。由圖5 可知，料液比從1 ∶62.5 到1 ∶1 000，隨著溶劑體積量的增大，提取率會(huì)也隨之遞增。但超過1 ∶1 000 后的提取率出現(xiàn)異常下降，其中原因不得而知，考慮到提取后的濃縮經(jīng)濟(jì)成本及復(fù)雜的技術(shù)、不確定因素等，并且在料液比在1 ∶125 ～1 ∶250 皂苷提取率趨近于平穩(wěn)狀態(tài)，故選取料液比為1 ∶250。

圖5 不同料液比對韭菜籽中皂苷提取率的影響

2.2.3 不同提取溫度對韭菜籽中皂苷提取率的影響

由圖6 知，一定范圍內(nèi)，皂苷的提取率隨著溫度的升高而不斷提升。物質(zhì)溶解于溶劑中時(shí)會(huì)吸收溶劑中的熱量，當(dāng)物質(zhì)內(nèi)的溫度升高，根據(jù)化學(xué)平衡移動(dòng)原理，反應(yīng)條件改變，系統(tǒng)內(nèi)的平衡會(huì)向有利于吸熱的方向移動(dòng)。提取溫度升高到70 ℃后，系統(tǒng)內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生一些化學(xué)反應(yīng)變化，導(dǎo)致提取率降低。因此，提取溫度定為60 ℃最為合適。

圖6 不同提取溫度對韭菜籽中皂苷提取率的影響

2.2.4 不同提取時(shí)間對韭菜籽中皂苷提取率的影響

由圖7 可知，提取時(shí)間越長，提取率越高，因此在工業(yè)化生產(chǎn)中的提取時(shí)間有待進(jìn)一步比對確定。皂苷的提取率在2 ～4 h 達(dá)到一定的穩(wěn)定狀態(tài)，則實(shí)驗(yàn)室中的最佳提取時(shí)間可選用3 h 左右。

圖7 不同提取時(shí)間對韭菜籽中皂苷提取率的影響

2.3 工藝條件驗(yàn)證

綜合本次單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，皂苷提取的實(shí)驗(yàn)室最優(yōu)條件為50%vol 酒精、溫度60 ℃、料液比1 ∶250、提取時(shí)間3 h。取6 組該條件下提取出的平行樣品，測得韭菜籽總皂苷含量的均值為4.63%（表1）。

表1 含量測定結(jié)果表

3 結(jié)論

韭菜籽中有效物質(zhì)的分離、純化對于韭菜籽藥理作用的研究有十分重要的意義，補(bǔ)腎抗疲勞產(chǎn)品具有很大的市場應(yīng)用前景。本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)法對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到韭菜籽中提取皂苷的最優(yōu)條件為50%vol 酒精作為溶劑提取液、料液比1 ∶250（體積比）、60 ℃恒定溫度回流、提取時(shí)間設(shè)定在3 h 左右，提取3 次。由于實(shí)驗(yàn)室設(shè)備等的限制，在實(shí)際生產(chǎn)中分離、過濾等方面提取條件應(yīng)該根據(jù)具體的設(shè)備條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。