HPLC-MS/MS 內標法測定液體乳中的三聚氰胺

周慧敏

（大連市檢驗檢測認證技術服務中心，遼寧大連 116630）

三聚氰胺，簡稱三胺，學名三氨三嗪，是一種氮雜環(huán)有機化工原料，廣泛用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣和醫(yī)藥等行業(yè)。由于具有毒性，不可用于食品加工或食品添加物[1]。三聚氰胺進入人體后難以代謝和排出，過量攝入三聚氰胺會促使體內形成結石，從而誘發(fā)泌尿系統(tǒng)疾病，甚至導致腎衰竭和死亡[2]。2008 年三聚氰胺事件后，三聚氰胺的檢測對乳品企業(yè)非常重要，是乳品企業(yè)質量控制部門日常工作的重要監(jiān)測項目，也是各級市場監(jiān)督管理部門重點監(jiān)管項目[3]。嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg，高于上述限量的食品一律不得銷售。

目前三聚氰胺檢測一般采用國家推薦標準《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》（GB/T 22388—2008）[4]， 該 標 準 包 括 高 效 液 相 色 譜 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、液相色譜-質譜/質譜法（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）和氣相色譜-質譜聯(lián) 用 法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）。GB/T 22388—2008 中HPLC、LC-MS/MS前處理均采用陽離子交換固相萃取柱凈化，基質加標外標法定量，方法操作煩瑣，檢測成本高。GC-MS（GC-MS/MS）采用陽離子交換固相萃取柱凈化后，進行硅烷化衍生，外標法定量，前處理方法更加復雜。目前有文獻報道使用HPLC-外標法進行定量分析，測定食品中含乳飲料的三聚氰胺非法添加劑的含量，但HPLC 方法相對于LC-MS/MS 靈敏度偏低，對低含量樣品不適宜[5]。

本方法采用LC-MS/MS，以三氯乙酸和甲醇作為萃取試劑，經(jīng)亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白后，用三聚氰胺13C3為內標進行測定。由于液體乳蛋白含量高，前處理過程中用蛋白沉淀劑取代了陽離子交換固相萃取柱凈化，簡化了實驗步驟，用三聚氰胺13C3為內標定量減少了基質效應對實驗結果的影響，與《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》（GB/T 22388—2008）相比，本方法更為簡便，準確度更高。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Agilent 6460 液相質譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；XW280A 旋渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司）；Z 32HK 型高速離心機（德國HERMLE 公司）。

1.2 材料與試劑

三氯乙酸（分析純，天津科密歐公司）；亞鐵氰化鉀（分析純，天津科密歐公司）；乙酸鋅（分析純，天津科密歐公司）；乙酸（分析純，天津科密歐公司）；乙酸銨（分析純，天津科密歐公司）；乙腈（色譜純，天津科密歐公司）；三聚氰胺（標準品，LGC 公司）；三聚氰胺13C3（標準品，LGC 公司）；微孔濾膜（13 mm 0.22 μm GHP，美國Waters 公司）。

三氯乙酸溶液：將10 g 三氯乙酸溶于1 000 mL水中，配制成1%的三氯乙酸溶液。

亞鐵氰化鉀溶液：稱取106 g 亞鐵氰化鉀，用水定容至1 000 mL，配制成92 g/L 的亞鐵氰化鉀溶液。

乙酸鋅溶液：稱取220 g 乙酸鋅酸，用水定容至1 000 mL，配制成183 g/L 的乙酸鋅溶液。

三聚氰胺標準儲備液：稱取50 mg 三聚氰胺于50 mL 容量瓶中，50% 甲醇定容至刻度，得1 000 mg/L 的三聚氰胺標準溶液。

三聚氰胺13C3標準儲備液：稱取50 mg 三聚氰胺13C3于50 mL 容量瓶中，50%甲醇定容至刻度，得1 000 mg/L 的三聚氰胺13C3標準儲備液，再用50%甲醇稀釋得到10 mg/L 的三聚氰胺13C3標準中間液。

標準工作液：三聚氰胺、三聚氰胺13C3標準儲備液用50%甲醇溶液逐級稀釋得到2.5 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL 和100.0 ng/mL的三聚氰胺以及20 ng/mL 的三聚氰胺13C3標準工作液。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

稱取樣品約5 g 置于50 mL 帶刻度離心管中，分別加入10 mg/L 的三聚氰胺13C340.0 μL，旋渦混合使內標完全溶于樣品，再向樣品中分別加入7 mL三氯乙酸溶液、0.5 mL 亞鐵氰化鉀溶液、0.5 mL 乙酸鋅溶液，用甲醇溶液定容至20 mL，旋渦混合2 min，10 000 r/min 離 心5 min， 過0.22 μm 濾 膜后收集于進樣瓶中，待上液質聯(lián)用儀檢測，進樣量1 μL。

1.3.2 配制標準曲線

分 別 取2.5 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL 和100.0 ng/mL 的三聚氰胺以及20 ng/mL的三聚氰胺13C3標準工作液，直接進樣，進樣量1 μL。

1.3.3 樣品測定

（1）色譜條件。色譜柱：Agilent Rx-SiL 4.6 mm×150 mm×5 μm；流動相乙酸銨溶液配制：準確稱取0.385 g 乙酸銨，加入1 mL 乙酸，加水定容至500 mL；流動相：乙腈∶乙酸銨溶液=50 ∶50；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃。

（2）質譜條件。電離方式：ESI+；監(jiān)測模式：MRM；離子源溫度：350 ℃；離子噴霧電壓：4 000V；各組分定性定量離子對等參數(shù)見表1。

表1 目標組分質譜檢測參數(shù)

2 結果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

先將目標組分配制成1 000 ng/mL 的溶液，利用針泵進樣，找到母離子和子離子以確定MRM 離子對，優(yōu)化碰撞能，結果見表1。確定最優(yōu)質譜檢測條件后進一步優(yōu)化液相色譜條件，采用安捷倫Rx-SiL （4.6 mm×150 mm, 5 μm）色譜柱，流動相為乙腈∶乙酸銨溶液=50 ∶50，流速為0.4 mL/min，柱溫為40 ℃。同時，選擇三聚氰胺13C3作為內標（添加濃度為20 ng/mL），能夠滿足大多數(shù)樣品的檢測。

2.2 標準曲線及定量限

2.2.1 標準曲線

以目標物測定濃度為橫坐標，目標物與對應同位素內標峰面積比為縱坐標，繪制三聚氰胺標準曲線，在2.5 ～100.0 ng/mL 線性關系良好，回歸方程為y=0.998 266x+0.041 23，相關系數(shù)r為0.999 3，符合檢驗對標準曲線的要求。

2.2.2 方法定量限

選一空白樣品，按1.3.1 實驗步驟做加標回收實驗，添加濃度從0.1 mg/kg 逐漸稀釋，當添加水平至0.01 mg/kg 時，回收率均值為82.8%，相對標準偏差（RSD）為5.6%，滿足實驗要求，再降低添加濃度得到回收率均值，相對標準偏差（RSD）不符合實驗要求。因此，確定0.01 mg/kg 為定量限。

2.3 回收率實驗

分別向空白樣本中添加標準工作液、同位素內標工作液，按照1.3.1 步驟處理并檢測。添加水平為0.01 mg/kg、0.03 mg/kg、0.10 mg/kg 3 個水平，每個濃度6 份平行樣本，檢測結果見表2。方法回收率為82.8%～102.3%，相對標準偏差為3.2%～5.6%，回收率和精密度良好，符合檢測方法要求，適合液體乳中三聚氰胺的檢測。

表2 試樣回收率實驗結果

2.4 討論

2.4.1 沉淀劑的選擇

亞鐵氰化鉀和乙酸鋅是實驗室常用的蛋白沉淀劑，在多個檢測標準中都有應用，價格便宜容易獲得，是常用的前處理手段，凈化去除效果良好。在市場上采集20 份液體乳樣本按1.3.1 實驗步驟處理并檢測，在質譜上均未發(fā)現(xiàn)有明顯干擾組分，因此本方法選擇亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為沉淀劑進行沉淀凈化。

2.4.2 與標準方法對比

為比較本方法與國家推薦標準《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》（GB/T 22388—2008）[4]的檢測結果的一致性，設計實驗如下。

向空白樣本中添加標液，添加水平為0.04 mg/kg，分別采用GB/T 22388—2008 第二法液相色譜-質譜/質譜法[4]和本方法進行檢測，每種方法測定6份平行樣本。GB/T 22388—2008 檢測結果平均值為0.035 mg/kg，本方法檢測結果平均值為0.037 mg/kg。實驗表明，兩種方法測定的結果無顯著性差異，本方法適合液體乳中三聚氰胺的檢測。

3 結論

我國乳制品產(chǎn)量中，液體乳產(chǎn)量占比較大，達93.32%，其次為乳粉，占比達3.87%。乳制品檢測在各級抽查中占比較高，液體乳中的三聚氰胺的檢測更是監(jiān)管的重點。因此，尋找更加準確、快捷的液體乳中三聚氰胺檢測方法對于節(jié)省成本、提高工作效率有著重要的意義。

本方法以三氯乙酸和甲醇作為萃取試劑，經(jīng)亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白，通過高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀，采用電噴霧正離子化模式（ESI+）和多反應檢測（MRM），以三聚氰胺13C3內標法測定液體乳中的三聚氰胺。結果表明，該方法可準確測定液體乳中的三聚氰胺含量，且有很好的線性關系，相關系數(shù)大于0.99，定量限為0.01 mg/kg，加標回收率在82.8%～102.3%，從而確認本方法可準確、快捷測定液體乳中的三聚氰胺。