菌落總數(shù)測定結(jié)果的不確定度評定

蔡曉霞，吳家碧，陳葉蘭，蔡偉江，曹艷娟，李 露

（湯臣倍健股份有限公司，廣東珠海 519040）

隨著我國經(jīng)濟的飛速發(fā)展，人民的物質(zhì)生活水平得到了巨大的提升。食品的質(zhì)量和種類也在不斷豐富。但是，近幾年來頻繁出現(xiàn)了關(guān)于食品安全的問題，而這其中又以食品微生物安全問題最為嚴(yán)重。食品微生物導(dǎo)致的安全問題比較嚴(yán)重而且發(fā)病速度快，部分致病菌所引起的疾病還具有傳染性。正因為微生物的巨大隱患，國家相關(guān)部門將微生物檢測列為食品檢測的強制指標(biāo)。食品中菌落總數(shù)的測定則是強制檢測項目，因此對其進行研究十分必要。菌落總數(shù)可以反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求。但是，食品檢驗的工作復(fù)雜繁瑣，試驗過程中常常會受到諸多不確定因素的影響，因此檢測結(jié)果與真值之間經(jīng)常存在一定的誤差[1-3]。為了更加準(zhǔn)確地表示檢測結(jié)果，出具可靠準(zhǔn)確的檢測報告，需要引入測量不確定度。測量不確定度[4]是表征合理賦予被測量的分散性，是目前國際公認(rèn)的用來評價檢測結(jié)果質(zhì)量的參數(shù)。近年來，關(guān)于食品中菌落總數(shù)不確定度評定[5-15]的研究越來越多。依據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[16]，采用平板計數(shù)法測定加標(biāo)試驗樣品中的菌落總數(shù)，建立菌落總數(shù)測定結(jié)果不確定度評定的基本方法，分析檢測過程中影響結(jié)果的主要因素，確立了菌落總數(shù)不確定度的評定，提升檢測結(jié)果的可信度，為今后實驗室中菌落總數(shù)測定結(jié)果的準(zhǔn)確性提供有力的保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

培養(yǎng)基：PCA 瓊脂培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物有限公司提供；稀釋液：0.85%無菌氯化鈉溶液，廣州化學(xué)試劑廠提供；實驗室用水為二級純化水；對照菌：枯草芽孢桿菌ATCC6633，廣東省微生物菌種保藏中心提供；供試品：健樂多乳清蛋白營養(yǎng)強化粉固體飲料，湯臣倍健股份有限公司提供。

LT1002 E 型電子天平，常熟市天量儀器有限公司產(chǎn)品；BSC-1600ⅡA2 型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；QL-866 型振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；EZ-FitTM 型通用型實驗室過濾系統(tǒng)，德國默克公司產(chǎn)品；SPX 質(zhì)250BSH-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；BXM-30R 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；HMB-400B 型拍擊式均質(zhì)器，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 檢測依據(jù)

國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》。

1.2.2 檢測過程

菌液：接種枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至TSB液體培養(yǎng)基中，35 ℃下培養(yǎng)24 h；用0.85%無菌氯化鈉溶液稀釋并制成試驗所需濃度的菌懸液，待用。工作用菌株為第3 代。

稱取25 g 樣品至無菌均質(zhì)袋中, 加入225 mL 無菌氯化鈉溶液，然后用拍打器拍打2 min，待樣品溶解后加入適量菌液（接種菌懸液的體積不得超過樣液體積的1%），再次用拍打器進行拍打，直至菌液均勻分布于樣液中，溶液即是1∶10（g∶mL） 的樣品勻液。將上述1∶10 的樣品勻液用無菌吸頭吸取1 mL，注入盛有9 mL 無菌氯化鈉溶液的試管后，旋渦混勻，制成1∶100 的樣品勻液。吸取2 個稀釋度樣品勻液1 mL 于無菌平皿內(nèi)， 每個稀釋度做2 個平行。同時，分別取1 mL 樣品稀釋液加入2 個無菌平皿作空白對照；及時將20～25 mL 冷卻至46 ℃的平板計數(shù)瓊脂（可放置于46 ±1 ℃恒溫水浴箱中保溫） 傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻，置水平臺面待瓊脂完全凝固后，正置平板，置于36±1 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 觀察并記錄培養(yǎng)至第2 天的結(jié)果，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量， 計算結(jié)果并報告。在同一相對恒定的試驗條件下，對該樣品重復(fù)測20 次，然后對檢測結(jié)果進行不確定度評定。

2 結(jié)果與分析

2.1 識別測量不確定度的來源

根據(jù)GB 4789.2—2016 檢測加標(biāo)樣品中的菌落總數(shù)，分析檢測流程，識別該方法的不確定度來源。

菌落總數(shù)的不確定度來源見圖1。

圖1 菌落總數(shù)的不確定度來源

2.2 建立數(shù)學(xué)模型

據(jù)GB 4789.2—2016 菌落總數(shù)的計算公式為：

式中：N——樣品中菌落數(shù)；

∑C——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板） 菌落數(shù)之和；

n1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)） 平板個數(shù)；

n2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)） 平板個數(shù)；

d——稀釋因子（第一稀釋度）。

當(dāng)只有一個稀釋倍數(shù)的平板菌落數(shù)在計數(shù)范圍內(nèi)，n2=0。考慮到結(jié)果的分散性，將計算得到的菌落數(shù)轉(zhuǎn)換為對數(shù)值之后再計算其不確定度。

通過分析菌落總數(shù)檢測過程中不確定度的來源及建立數(shù)學(xué)模型可知，影響菌落總數(shù)測定結(jié)果不確定度的因素主要是樣品重復(fù)測定、樣液制備過程、樣液遞增稀釋過程、加樣體積和不同人員計數(shù)結(jié)果差異性等。

2.3 不確定度分量的評定

2.3.1 測量重復(fù)性引入的不確定度

重復(fù)性檢測引起的不確定度，主要是檢測過程中各種因素作用下隨機性所得各次菌落數(shù)值不同引起的。在同一相對恒定的試驗條件下，對該加標(biāo)樣品重復(fù)測20 次，然后對檢測結(jié)果進行不確定度評定。

樣品重復(fù)測定的結(jié)果表1。

從表1 可看出，檢測結(jié)果數(shù)值的發(fā)散性較大，所以采用統(tǒng)計學(xué)方法，以菌落數(shù)值的對數(shù)值求不確定度。按A 類評定，根據(jù)貝塞爾公式計算檢測結(jié)果對數(shù)值的樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差：

表1 樣品重復(fù)測定的結(jié)果

日常檢測工作中，樣品只做單次試驗，因此標(biāo)準(zhǔn)不確定度U（重復(fù)）==0.0255961，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（重復(fù)）=。

2.3.2 樣液制備過程引入的不確定度

樣液制備過程中，需要用500 mL 量筒量取225 mL生理鹽水，以制備成待用的稀釋液。根據(jù)該量筒的檢定證書，允許誤差為±0.7mL，屬于B 類評定，按均勻分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

試驗樣品使用電子分析天平進行稱量， 根據(jù)天平的檢定證書，當(dāng)20 g≤m≤50 g 時，示值允許誤差為±0.05 g，偏載允許誤差為±0.15 g，天平的重復(fù)性誤差引入的不確定度已包括在樣品重復(fù)測定的不確定度中，因此這里不再做進一步的考慮。示值允許誤差和偏載允許誤差采用B 類不確定度評定，區(qū)間半寬度為a1=0.05 g，a2=0.15 g，按均勻分布計算，，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度U（m）=，樣品的稱樣量m=25 g，則樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.0036515。

由于實驗室溫度在20±5 ℃的范圍內(nèi)波動， 假設(shè)溫度變化為5 ℃， 該溫度引起的不確定度可通過估算溫度范圍和體積膨脹系數(shù)計算，液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，故只考慮前者即可。設(shè)溫度為均勻分布，，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃。則：

綜合以上，樣品制備過程所引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為Urel（制備）=0.0041142。

2.3.3 樣液遞增稀釋引入的不確定度

該不確定度來源于用1 mL 無菌吸頭吸取不同稀釋級溶液1～9 mL 滅菌生理鹽水的稀釋過程。所使用的量器分別是1 mL 移液槍和10 mL 的移液管，根據(jù)該1 mL 移液槍的檢定證書，其容量允許誤差為±0.002 mL。根據(jù)10 mL 的移液管的檢定證書，其允許誤差為±0.03 mL，屬于B 類評定，按均勻分布計算，，試驗選擇的稀釋度為（10-1和10-2），即稀釋過程1 mL 移液槍和10 mL 的移液管各使用了1 次，所以稀釋過程的標(biāo)準(zhǔn)Urel（V21）不確定度為：U（V21）=相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，溫度引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。因此，樣品遞增稀釋過程所引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.4 加樣體積引入的不確定度

檢測結(jié)果以稀釋因子為10-1平板上的菌落總數(shù)進行計數(shù)和報告，每次檢測各平板上接種的稀釋液的體積均為1 mL，做2 個平行，1 mL 移液槍使用2 次，屬于B 類評定， 按均勻分布，加樣體積引起的不確定度為相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為溫度引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.0006060。因此，加樣過程引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（加樣）=

2.3.5 不同人員計數(shù)結(jié)果差異性引入的不確定度

檢測人員在計數(shù)培養(yǎng)基平板上的菌落時，因經(jīng)驗和計數(shù)平板上菌落的復(fù)雜培養(yǎng)結(jié)果等出現(xiàn)隨機誤差和識別誤差，該誤差通過對同一個培養(yǎng)基平板的菌落進行重復(fù)計數(shù)后統(tǒng)計得出，采用10 位檢驗人員對同一個平板的菌落進行計數(shù)的方法進行不確定度的計算。

不同人員計數(shù)結(jié)果見表2。

表2 不同人員計數(shù)結(jié)果

按A 類評定，根據(jù)貝塞爾公式計算檢測結(jié)果對數(shù)值的樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差：=0.0475492，標(biāo)準(zhǔn)不確定度U（計數(shù)）=0.0150364。

2.4 合成不確定度和擴展不確定度

此次研究的不確定度主要有以下4 個。

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度一覽表見表3。

表3 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度一覽表

該方法的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

試驗結(jié)果以擴展不確定度來表示，U=k×UCrel，取置信水平為95%，自由度=20，查t 分布表得t95（20）=2.086，因此U=2.086×0.0103957=0.0217。由于lgX與X 之間呈非線性關(guān)系，不能直接求擴展不確定度U 的反對數(shù)。因此，應(yīng)首先確定lgX 的取值范圍為lgX=3.23±0.0217，即3.2083≤lgX≤3.2517。再取反對數(shù)后，得檢測結(jié)果X 的分布區(qū)間為1615≤X≤1785。

2.5 結(jié)果報告

此次加標(biāo)試驗樣品的菌落總數(shù)的估計值為1600～1800 CFU/g，包含因子k=2.086。

3 結(jié)論

研究對樣品重復(fù)檢測、樣品制備、遞增稀釋、加樣體積和不同人員計數(shù)結(jié)果差異性引起的不確定度進行評估，從不確定度計算的結(jié)果來看，5 種因素對測量結(jié)果均有影響。但樣品重復(fù)測定過程引入的不確定度貢獻最大，其次是不同人員計數(shù)結(jié)果的差異性和樣液的制備過程，這與劉荔等人[17]對膨化食品中菌落總數(shù)不確定度的研究結(jié)果一致。因此，在今后檢測過程中要從多方面加強質(zhì)量控制，要求檢驗技術(shù)人員熟練掌握各個環(huán)節(jié)的技術(shù)要點，另外實驗室應(yīng)對人員進行定期培訓(xùn)和考核，嚴(yán)格按照規(guī)范統(tǒng)一的計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)進行計數(shù)，最大限度地減小不確定度引入的分量值。

除了以上列出的幾個分量之外，通過查閱文獻可知培養(yǎng)條件、不同批次的培養(yǎng)基、培養(yǎng)基的滅菌時間、溫度等因素也會影響菌落總數(shù)不確定度的結(jié)果。但由于這些因素不便計算，且對總不確定度的貢獻度比較小，所以此次評估不納入考慮[18]，但是微生物培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性對降低不確定度有著非常重要的作用[19]。因此，日常工作中，實驗室進行微生物培養(yǎng)時應(yīng)該提供相對穩(wěn)定的環(huán)境，這為實驗室出具準(zhǔn)確可靠的檢測結(jié)果提供有力的保障。