MTNR1a和MTNR1b基因在繁殖期與非繁殖期雄性高原鼢鼠HPG軸上的表達(dá)

安康 包明芳 姚寶輝 康宇坤 譚宇塵 王艷莉 蘇軍虎*

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070）（2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)—新西蘭梅西大學(xué)草地生物多樣性研究中心，蘭州 730070）（3甘肅省祁連山草原生態(tài)系統(tǒng)野外科學(xué)觀測研究站，天祝 733200）

季節(jié)性繁殖是動(dòng)物適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境所采取的一種策略，受光照、溫度、降水和食物等多種因素的影響。其中光照的周期性變化被認(rèn)為是影響動(dòng)物繁殖的主要因素(Shinomiyaet al.,2014)。光信號(hào)通過視網(wǎng)膜傳到大腦調(diào)節(jié)褪黑素(Melatonin)的分泌(Dardenteet al.,2016)，進(jìn)而影響繁殖激素的合成與分泌。作為感知光周期變化的神經(jīng)激素，褪黑素主要由松果體分泌(Ceconet al.,2019)，血液循環(huán)中的色氨酸是其生物合成前體，經(jīng)過芳香胺-N-乙?；D(zhuǎn)移酶(Arylalkylamine-N-acetyl transferase)和羥基吲哚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Hydroxyindole-O-methyl transferase)最終合成為褪黑素(Axelrod and Wurtman,1968;Pandi-Perumalet al.,2008)。褪黑素還在胃、心臟、肝臟、卵巢等組織器官中合成和分泌(Reiteret al.,2015)，但周期性分泌僅存在于松果體和視網(wǎng)膜中(姚蔚等，2017)。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素的周期性分泌主要受下丘腦視交叉上核(Suprachiasmatic nucleus,SCN)的晝夜節(jié)律振蕩器控制，其激素分泌水平與夜間長度呈正相關(guān)(Simonneaux and Ribelayga,2003)，呈現(xiàn)出晝低夜高的特點(diǎn)(Wurtman and Ozaki,1978)；隨著一年中光周期的變化，褪黑素又表現(xiàn)出季節(jié)性分泌規(guī)律(陳玉林和張小輝，2005)，促使動(dòng)物在行為和生理上與季節(jié)變化同步，進(jìn)而調(diào)整其繁殖狀態(tài)。因此，褪黑素在動(dòng)物的季節(jié)性繁殖調(diào)控中具有重要作用，通過與下丘腦—垂體—性腺(Hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)軸上的受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能(Aleandriet al.,1996)。

在哺乳動(dòng)物中，褪黑素的生理功能主要通過兩種高親和力的膜受體介導(dǎo)，即褪黑素受體1a(Melatonin receptor 1a,MTNR1a)和褪黑素受體1b(Melatonin receptor 1b,MTNR1b)，兩者均屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，參與多種功能調(diào)節(jié)(Jockerset al.,2008;Wuet al.,2013)。MTNR1a 和 MTNR1b已證實(shí)存在于小鼠(Mus musculus)下丘腦SCN中，共同調(diào)節(jié)其晝夜節(jié)律(Liuet al.,1997;Jinet al.,2003)。陳健楠等 (2020)采用qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)技術(shù)檢測到MTNR1a和MTNR1b基因在牦牛(Bos grunniens)垂體中表達(dá)。MTNR1a和MTNR1b除了在下丘腦和垂體中發(fā)揮作用外，在動(dòng)物睪丸中也有作用(Frungieriet al.,2005)。Izzo等(2010)發(fā)現(xiàn)大鼠(Rattus norvegicus)睪丸中存在MTNR1a和MTNR1b；Yang等(2014)發(fā)現(xiàn)褪黑素通過與MTNR1a和MTNR1b結(jié)合調(diào)節(jié)荷斯坦牛(B.taurus)睪丸支持細(xì)胞的發(fā)育與功能發(fā)揮。這表明褪黑素與受體結(jié)合，可獨(dú)立于下丘腦和垂體，直接影響動(dòng)物睪丸的生長和發(fā)育。現(xiàn)已證實(shí)，褪黑素與垂體中MTNR1a結(jié)合，一方面通過中間信使分子調(diào)節(jié)垂體遠(yuǎn)側(cè)催乳激素(Prolactin,PL)的分泌和門脈血管的發(fā)生，調(diào)控繁殖(Lincoln and Clarke,1994)；另一方面通過促甲狀腺激素—甲狀腺激素(Thyroid stimulating hormone-thyroid hormone)通路誘導(dǎo)促性腺激素釋放激素神經(jīng)元活性，分泌促性腺激素釋放激素(Gonadotropin releasing hormone,GnRH)調(diào)節(jié)垂體合成、分泌卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone)和黃體生成素(Luteinizing hormone)，參與調(diào)控繁殖(Nishiwaki-Ohkawa and Yoshimura,2016)。褪黑素參與繁殖作用的研究，豐富了動(dòng)物季節(jié)性繁殖調(diào)控理論，探明了更多動(dòng)物類群褪黑素繁殖調(diào)控作用機(jī)理，對(duì)完善動(dòng)物繁殖理論具有重要意義。

高原鼢鼠(Eospalax baileyi)是青藏高原特有的地下嚙齒動(dòng)物(張堰銘和劉季科，2002)，主要棲息在高寒草甸、高寒草原和高山灌叢等地帶，受到氣候、地形、食物和土壤等因素的制約(Keinathet al.,2014)，繁殖期為每年的4月中旬到6月中旬(鄭生武，1980)，是典型的季節(jié)性繁殖動(dòng)物。近年來，由于人類活動(dòng)和氣候變化等影響，高原鼢鼠種群數(shù)量急劇增加，加劇了對(duì)草原環(huán)境的破壞。繁殖是嚙齒動(dòng)物種群數(shù)量發(fā)生及其危害的重要生物學(xué)基礎(chǔ)，掌握其繁殖調(diào)控機(jī)理對(duì)其種群進(jìn)行有效管理至關(guān)重要。長期營地下生活的嚙齒動(dòng)物視覺系統(tǒng)嚴(yán)重退化，但是感受光周期的“非成像”視覺通路仍高度發(fā)達(dá)，能夠感光和感知外界光周期的變化，并產(chǎn)生與外界晝夜循環(huán)同步的生物節(jié)律(孟衫衫等，2010)。安曉宇等(2020)發(fā)現(xiàn)，高原鼢鼠褪黑素水平在繁殖期和非繁殖期存在顯著差異，暗示了褪黑素在高原鼢鼠季節(jié)性繁殖調(diào)控中的潛在作用，然而褪黑素受體基因表達(dá)模式和組織特異性等未知。基于此，本研究通過分析MTNR1a和MTNR1b基因在繁殖期與非繁殖期雄性高原鼢鼠HPG軸上的表達(dá)模式，探究褪黑素在高原鼢鼠繁殖調(diào)控中的作用機(jī)理，旨在豐富光周期誘導(dǎo)地下嚙齒動(dòng)物季節(jié)性繁殖調(diào)控的理論，為高原鼢鼠有效管理提供參考。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于2020年5月(繁殖期)和9月(非繁殖期)在甘肅省天祝藏族自治縣甘肅省祁連山草原生態(tài)系統(tǒng)野外科學(xué)觀測研究站進(jìn)行高原鼢鼠樣本采集，依據(jù)其胴體重判斷是否成年(蘇軍虎等，2018)，在兩個(gè)時(shí)期分別非損傷活捕10只成年健康雄性個(gè)體。為避免褪黑素的晝夜節(jié)律性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，將兩個(gè)時(shí)期所有實(shí)驗(yàn)樣品的采集工作控制在同一天的2 h內(nèi)完成(20:00—22:00)。取出每只個(gè)體的睪丸、附睪和精囊腺稱重記錄，下丘腦、垂體以及一側(cè)睪丸于-80℃冷凍保存，用于RNA的提?。涣硪粋?cè)睪丸保存于4%多聚甲醛組織固定液中，用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取及引物設(shè)計(jì)

將兩個(gè)時(shí)期各10只成年雄性高原鼢鼠個(gè)體的下丘腦、垂體及睪丸在同等條件下，按照RNAiso Plus Total RNA提取試劑盒(TaKaRa)的操作說明進(jìn)行總RNA的提取，于-80℃儲(chǔ)存。所有樣品的ODA260/A280值均為1.8～2.0，說明RNA質(zhì)量高(Huoet al.,2017)。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)布大鼠和小鼠MTNR1a(NM_001100641.1)和MTNR1b(NM_145712.2)的堿基序列，使用Primer3 Input 0.4.0軟件設(shè)計(jì)高原鼢鼠MTNR1a和MTNR1b引物，引物序列由西安擎科有限責(zé)任公司進(jìn)行合成 (表1)。

表1 雄性高原鼢鼠MTNR1a和MTNR1b引物序列Table 1 Primers sequence for MTNR1a and MTNR1b of male plateau zokor

1.2.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定

使用PrimeScript 1st Strand(Takara)試劑盒將所有樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用TB Green?Premix Ex TaqTM II(Takara)在實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Light Cycler 96 System)中通過實(shí)時(shí)熒光定量(q-PCR)擴(kuò)增cDNA。

1.2.3 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

將保存在4%多聚甲醛溶液中的睪丸(繁殖期和非繁殖期各10個(gè))同批進(jìn)行沖洗、脫水、浸蠟和包埋處理，5 μm切片在60℃恒溫6 h，然后常規(guī)脫蠟、蒸餾水沖洗，按照免疫組化染色試劑盒(SP-0032，北京博奧森?)的操作說明進(jìn)行。其中，實(shí)驗(yàn)組用兔抗羊MTNR1a(bs-0027R)和MTNR1b(bs-0963R)多克隆抗體(1∶250)作為第一抗體進(jìn)行陽性反應(yīng)，陰性對(duì)照組用PBS代替第一抗體進(jìn)行處理，所有樣品4℃過夜(12 h)，后加山羊抗兔IgG，加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，最后用DAB顯色劑顯色。借助Motic Images Plus 3.0軟件拍照。進(jìn)一步對(duì)免疫組化陽性進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)效果，選擇兩個(gè)時(shí)期每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1張切片(每張重復(fù)3個(gè)視野)，利用Image Pro Plus軟件進(jìn)行平均光密度值(Average optical density)測定，用IP圖像處理技術(shù)計(jì)算：平均光密度值=累計(jì)光密度/有效測量區(qū)面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用相對(duì)定量法(2-ΔΔCq)計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量均以內(nèi)參基因?yàn)榛鶞?zhǔn)進(jìn)行校正。以上所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 26.0軟件，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)作圖。

2 結(jié)果

2.1 高原鼢鼠繁殖期和非繁殖期性腺器官重量變化

高原鼢鼠體重在繁殖期與非繁殖期無顯著變化(P＞0.05)，但非繁殖期的睪丸、附睪以及精囊腺的重量較繁殖期分別下降了87.98%、89.95%和97.02%，表現(xiàn)出顯著的季節(jié)性變化(P＜0.05)(表2)。

表2 高原鼢鼠繁殖期和非繁殖期性腺器官重量變化Table 2 Weight changes of gonad organs during the breeding and non-breeding seasons of plateau zokor

2.2 MTNR1a和MTNR1b mRNA在高原鼢鼠中的表達(dá)

高原鼢鼠繁殖期和非繁殖期下丘腦、垂體和睪丸中均檢測到MTNR1amRNA的表達(dá)。在繁殖期，高原鼢鼠下丘腦和垂體中MTNR1amRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于非繁殖期(P＜0.05)，但繁殖期睪丸中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于非繁殖期(P＜0.01)(圖1A)。

圖1 MTNR1a和MTNR1b mRNA在繁殖期與非繁殖期高原鼢鼠下丘腦、垂體和睪丸中的表達(dá).A：MTNR1a mRNA的相對(duì)表達(dá)量；B：MTNR1b mRNA的相對(duì)表達(dá)量.*P＜0.05；**P＜0.01Fig.1 MTNR1a and MTNR1b mRNA in the hypothalamus,pituitary,and testis of plateau zokor during the breeding and non-breeding seasons.A:relative expression level of MTNR1a mRNA;B:relative expression level of MTNR1b mRNA.*P＜0.05;**P＜0.01

高原鼢鼠下丘腦和垂體中，繁殖期與非繁殖期的MTNR1b基因相對(duì)表達(dá)量無顯著差異(P＞0.05)，但在睪丸中MTNR1b基因在繁殖期的相對(duì)表達(dá)量顯著低于非繁殖期(P＜0.01)(圖1B)。

2.3 MTNR1a和MTNR1b在高原鼢鼠中的定位

高原鼢鼠繁殖期MTNR1a在睪丸間質(zhì)細(xì)胞的胞漿中具有免疫陽性信號(hào)，在曲細(xì)精管內(nèi)的支持細(xì)胞以及除長形精子細(xì)胞以外的各級(jí)生殖細(xì)胞中均有陽性表達(dá)，其中包括精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞；但非繁殖期MTNR1a在高原鼢鼠睪丸的間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞和精原細(xì)胞中均有陽性表達(dá)(圖2A、D)。

MTNR1b在高原鼢鼠繁殖期多種細(xì)胞的胞漿中存在免疫陽性信號(hào)，包括支持細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，但在細(xì)胞核中無表達(dá)，在精原細(xì)胞和長形精子細(xì)胞中也無免疫信號(hào)；在非繁殖期睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中均檢測到MTNR1b的陽性信號(hào)，但在精原細(xì)胞中無表達(dá)(圖2B、E)。

2.4 高原鼢鼠睪丸中MTNR1a和MTNR1b的免疫組化陽性評(píng)價(jià)

高原鼢鼠非繁殖期睪丸中MTNR1a的陽性信號(hào)的平均光密度值顯著高于繁殖期(P＜0.01)(圖3A)。與MTNR1a相似，繁殖期睪丸中MTNR1b的平均光密度值顯著低于非繁殖期(P＜0.01)(圖 3B)。

3 討論

伴隨著高原鼢鼠性腺的季節(jié)性發(fā)育，褪黑素受體基因在其下丘腦、垂體和睪丸中也呈現(xiàn)出季節(jié)性變化，但MTNR1a基因表達(dá)量在下丘腦、垂體和睪丸中有顯著季節(jié)性差異，MTNR1b基因僅在睪丸中有季節(jié)性差異。免疫定位和表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，褪黑素通過與不同細(xì)胞上的受體結(jié)合，影響高原鼢鼠睪丸的生長發(fā)育，揭示了褪黑素在高原鼢鼠季節(jié)性繁殖調(diào)控中的重要作用，對(duì)豐富高原鼢鼠繁殖調(diào)控理論具有重要意義。

季節(jié)性繁殖動(dòng)物的性腺活性在全年中出現(xiàn)周期性變化，包括睪丸大小、精子發(fā)生以及生殖激素的合成和分泌等(郝偉麗等，2016;Wanget al.,2017)。本研究發(fā)現(xiàn)，高原鼢鼠性腺發(fā)育在非繁殖期出現(xiàn)明顯退化，具有季節(jié)性繁殖特征。高原鼢鼠屬于地下嚙齒動(dòng)物，感光受洞道限制，安曉宇等(2020)發(fā)現(xiàn)高原鼢鼠褪黑素水平在繁殖期和非繁殖期有顯著差異，說明褪黑素可能參與了高原鼢鼠的季節(jié)性繁殖調(diào)控，但有關(guān)機(jī)理未知。本研究發(fā)現(xiàn)MTNR1a和MTNR1b基因在雄性高原鼢鼠下丘腦、垂體和睪丸中顯著表達(dá)。相似的研究也在其他物種中報(bào)道，如甘加藏羊(Ovis aries)整個(gè)發(fā)情周期下丘腦、垂體和卵巢中MTNR1a基因均有表達(dá)，且不同時(shí)期存在差異(楊大鵬等，2019)。MTNR1a和MTNR1b基因在牦牛下丘腦、垂體以及睪丸中明顯表達(dá) (陳健楠等，2020)。王玉軍等(2020)通過對(duì)高原鼠兔(Ochotona curzoniae)繁殖期注射褪黑素處理，發(fā)現(xiàn)其睪丸重量下降，精子發(fā)生停止，而在非繁殖期注射褪黑素受體拮抗劑，發(fā)現(xiàn)睪丸重量顯著增加，各級(jí)生殖細(xì)胞重新出現(xiàn)，精子發(fā)生恢復(fù)。這提示光周期誘導(dǎo)的褪黑素是引起季節(jié)性繁殖動(dòng)物性腺周期性變化的潛在原因。作為相同高原環(huán)境下生存的高原鼢鼠，褪黑素可能有類似的作用，推測褪黑素通過與HPG軸上受體結(jié)合調(diào)控高原鼢鼠的季節(jié)性繁殖，但這還需后續(xù)通過注射褪黑素處理等研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。

利用原位雜交組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，MTNR1a和MTNR1bmRNA在小鼠下丘腦SCN中表達(dá)(Dubocovichet al.,1998)。這與本研究在下丘腦不同時(shí)期檢測到MTNR1a和MTNR1b基因的表達(dá)相似。下丘腦SCN是控制行為、代謝和生理節(jié)律的主時(shí)鐘(Reppert and Weaver,2001;Gillette and Mitchell,2002)，包括光信號(hào)調(diào)節(jié)松果體褪黑素的合成與分泌(Moore,1995)。研究發(fā)現(xiàn)，松果體產(chǎn)生的內(nèi)源性褪黑素可通過反饋機(jī)制影響MTNR1a和MTNR1b基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)SCN神經(jīng)元活性和晝夜節(jié)律(Gillette and Mitchell,2002)。本研究中，MTNR1a和MTNR1bmRNA在高原鼢鼠下丘腦中表達(dá)，暗示其在SCN中轉(zhuǎn)錄翻譯的受體可能與褪黑素結(jié)合，調(diào)節(jié)神經(jīng)元活性和晝夜節(jié)律，使之在行為上與一天中光周期的變化同步，進(jìn)而適應(yīng)一年中的季節(jié)變化。研究發(fā)現(xiàn)，位于下丘腦弓狀核中的親吻素(kisspeptins,Kp)是一種調(diào)節(jié)生殖功能的激活劑(Anselet al.,2010)。Simonneaux等 (2013)將金色中倉鼠(Mesocricetus auratus)暴露在短日照條件下，手術(shù)切除松果體去除內(nèi)源性褪黑素影響，發(fā)現(xiàn)弓狀核中Kp蛋白表達(dá)增加，并在幾周內(nèi)金色中倉鼠恢復(fù)到繁殖期狀態(tài)；Fischer等(2017)證實(shí)下丘腦弓狀核中也存在MTNR1a，這說明褪黑素通過與MTNR1a結(jié)合參與調(diào)節(jié)Kp蛋白的表達(dá)水平，間接調(diào)控動(dòng)物繁殖。本研究中，MTNR1a基因表達(dá)量在高原鼢鼠下丘腦中存在明顯的季節(jié)差異，說明MTNR1a基因轉(zhuǎn)錄翻譯出不同水平的受體與褪黑素結(jié)合，但具體的通路，如是否參與調(diào)節(jié)下丘腦弓狀核中Kp蛋白的表達(dá)，間接調(diào)控高原鼢鼠的繁殖狀態(tài)，還需要進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

在綿羊垂體結(jié)節(jié)部體外培養(yǎng)細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，佛司可林(Forskolin)能誘導(dǎo)MTNR1a基因表達(dá)增加，但這種增加又被褪黑素本身所抑制(Barrettet al.,1996)；同樣，給處于黑暗環(huán)境中的大鼠施加光照，發(fā)現(xiàn)MTNR1a基因的表達(dá)在1 h內(nèi)顯著增加，相反在施加光照前15 min注射外源褪黑素可以逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，說明褪黑素對(duì)大鼠垂體結(jié)節(jié)部MTNR1a基因的表達(dá)具有抑制作用(Guerreroet al.,2000)。這些研究說明垂體中MTNR1a基因的表達(dá)受褪黑素本身抑制，而高原鼢鼠內(nèi)源性褪黑素水平在繁殖期顯著低于非繁殖期(安曉宇等，2020)。本研究發(fā)現(xiàn)高原鼢鼠繁殖期垂體中MTNR1a基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于非繁殖期，基因的表達(dá)量與激素水平呈負(fù)相關(guān)，這與以上結(jié)果相似。垂體結(jié)節(jié)部是褪黑激素受體密度最高的部位(Masson-Pévet and Gauer,1994)。在原倉鼠 (Cricetus cricetus)垂體結(jié)節(jié)部產(chǎn)生促甲狀腺素(Hyroid stimulating hormone,TSH)的細(xì)胞上，發(fā)現(xiàn)MTNR1a高表達(dá)(Dardenteet al.,2003)，說明褪黑素影響TSH的合成和分泌。TSH通過調(diào)控2型甲狀腺素脫碘酶(Type 2 thyroid hormone deiodinase)和3型甲狀腺素脫碘酶(Type 3 thyroid hormone deiodinase)的轉(zhuǎn)換，調(diào)節(jié)甲狀腺素(Thyroid hormone)水平(Hanonet al.,2008;Klosenet al.,2013)，進(jìn)而誘導(dǎo)GnRH神經(jīng)元活化促進(jìn)動(dòng)物繁殖(Nishiwaki-Ohkawa and Yoshimura,2016)。此外，褪黑素與受體結(jié)合還可調(diào)節(jié)垂體遠(yuǎn)側(cè)PL的分泌和門脈血管的發(fā)生，從而影響動(dòng)物繁殖(Lincoln and Clarke,1994)，證明垂體的MTNR1a在動(dòng)物的繁殖調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。綜上可推斷，繁殖期MTNR1a基因轉(zhuǎn)錄翻譯的受體與低水平褪黑素結(jié)合，可能對(duì)高原鼢鼠繁殖活動(dòng)的發(fā)生具有促進(jìn)作用；相反，非繁殖期高水平的褪黑素抑制MTNR1a基因的表達(dá)，從而可能限制其繁殖活動(dòng)的進(jìn)行。陳健楠等(2020)在牦牛的垂體中檢測到MTNR1bmRNA的表達(dá)，說明MTNR1b存在于牦牛垂體中，但對(duì)其在繁殖功能性狀的研究較少，在本研究中同樣檢測到不同時(shí)期高原鼢鼠垂體中MTNR1b基因的表達(dá)，而繁殖期與非繁殖期表達(dá)差異不顯著。

HPG軸上除了下丘腦和垂體外，性腺組織中也存在褪黑素受體結(jié)合位點(diǎn)(Clemenset al.,2001;Ku?et al.,2002)。本研究中，MTNR1a和MTNR1bmRNA在高原鼢鼠不同時(shí)期睪丸中均存在明顯表達(dá)，表明褪黑素與受體結(jié)合直接影響高原鼢鼠睪丸的生長發(fā)育。外源褪黑素綿羊體外共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，褪黑素能促進(jìn)綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞分泌睪酮，并檢測到MTNR1a基因的表達(dá)(Denget al.,2018)。而通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，雄性狍(Capreolus capreolus)睪丸中MTNR1a和MTNR1b的表達(dá)在發(fā)情期前(5月)和發(fā)情期(7—8月)均高于發(fā)情期后(9月)，表明褪黑素通過與不同受體結(jié)合對(duì)雄性狍睪丸(即類固醇生成和精子發(fā)生)發(fā)育具有促進(jìn)作用(Kozio?et al.,2020)。與之相反，在歐洲雄性野牛(Bison bonasus)中發(fā)現(xiàn)，與發(fā)情期前(6月)相比，發(fā)情期后 (12月)檢測到睪丸中MTNR1a和MTNR1b基因高水平表達(dá)，證明發(fā)情期后褪黑素與不同受體結(jié)合對(duì)歐洲野牛睪丸精子發(fā)生的抑制作用增強(qiáng)(Tabecka-Lonczynskaet al.,2017)；同樣將金色中倉鼠(Mesocricetus auratus)暴露在3種不同的光照條件下，發(fā)現(xiàn)睪丸類固醇合成減少，MTNR1a基因的表達(dá)增加并且伴隨局部褪黑素水平的升高(Mukherjee and Haldar,2014)，與本研究結(jié)果相似，褪黑素與MTNR1a和MTNR1b結(jié)合對(duì)睪丸組織發(fā)育具有抑制作用，這也表明MTNR1a和MTNR1b基因在睪丸中的功能性狀存在物種差異。本研究在非繁殖期高原鼢鼠睪丸中檢測到MTNR1a和MTNR1b基因高表達(dá)，推測在這一時(shí)期褪黑素與受體結(jié)合可能最大限度地抑制高原鼢鼠繁殖，從而減少能量損失來度過寒冷的冬季。為進(jìn)一步探究褪黑素與睪丸間的關(guān)系，本研究利用免疫組化技術(shù)檢測到睪丸的多種細(xì)胞類型中存在MTNR1a和MTNR1b的陽性信號(hào)，并存有差異，這表明褪黑素對(duì)高原鼢鼠睪丸的調(diào)控作用是在不同類型細(xì)胞上完成的。

綜上所述，高原鼢鼠褪黑素受體基因在HPG軸上存在明顯表達(dá)，且MTNR1a和MTNR1bmRNA在繁殖期與非繁殖期高原鼢鼠下丘腦、垂體和睪丸中的表達(dá)模式不同，推測褪黑素通過與不同類型細(xì)胞上的受體結(jié)合，直接調(diào)節(jié)高原鼢鼠睪丸的生長發(fā)育和精子發(fā)生。本研究為理解光周期調(diào)控高原鼢鼠季節(jié)性繁殖的機(jī)理提供了參考，同時(shí)對(duì)豐富地下物種季節(jié)性繁殖調(diào)控理論具有重要意義。然而，針對(duì)褪黑素對(duì)高原鼢鼠睪丸發(fā)育、精子發(fā)生的影響，后續(xù)仍需進(jìn)一步研究。