mRNA疫苗研究進展及其在傳染病防控中的應用

尼 博，李月華，劉拂曉，魏 榮*

(1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東 青島 266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，山東 青島 266109)

1796年，英國醫(yī)生愛德華·詹納將牛痘液接種男童并成功預防天花，第1支疫苗誕生[1]。19世紀中葉，巴斯德創(chuàng)造性地運用物理、化學、微生物手段滅活、致弱病原，創(chuàng)造出了真正意義上的疫苗[2]。

從此人類擁有了能主動防御傳染病的武器，全世界30多種人、畜烈性傳染病因疫苗的推廣使用而被根除或控制。

目前，已開發(fā)出的疫苗包括滅活疫苗、弱毒疫苗、亞單位疫苗、病毒載體疫苗、核酸疫苗等，他們各有優(yōu)缺點。滅活疫苗、亞單位疫苗的安全性高，但是免疫原性差，能誘導體液免疫和較弱的細胞免疫；弱毒疫苗、載體疫苗的免疫原性較強，能夠誘導較強的體液免疫與細胞免疫，但是安全性較差，存在核酸整合進宿主基因組中的風險，同時弱毒疫苗還存在使用后散毒、毒力返強的風險；核酸疫苗中，DNA疫苗能夠誘導體液免疫與細胞免疫，但是保護效率較低，且存在核酸整合進宿主基因中的風險[3-4]。

mRNA疫苗是近年興起的一種新型的疫苗，其屬于核酸疫苗[5]。1989年MALONE等[6]將mRNA用陽離子包裹后，轉染進入多種細胞系并成功表達目的蛋白。1990年，WOLFF等[7]將包含目的基因的mRNA表達載體，注射進小鼠骨骼肌內(nèi)，首次證明mRNA疫苗能夠在體內(nèi)長時間大量表達。以后的30年中，研究人員從遞呈載體、核酸鏈穩(wěn)定性、抗原表達效率、降低過敏反應等多個方面對mRNA疫苗進行改進，克服了大量使用瓶頸[8]。現(xiàn)在mRNA疫苗已經(jīng)具有諸多優(yōu)勢，如：抗原表達效率高，因無需進入細胞核即可完成翻譯，其翻譯效率是DNA疫苗的數(shù)倍；安全性強，生產(chǎn)過程無病原及抗生素的使用，提高了生物安全性，同時mRNA疫苗不存在整合進入宿主基因組的風險；免疫原性強，能夠同時激活體液免疫與細胞免疫，滿足抵御各類病原體的需要；編譯性強，可根據(jù)需要進行目的抗原編譯，實現(xiàn)交叉保護與鑒別診斷等性能。本文對mRNA疫苗的研究進展及其在傳染病防控中的應用實例進行總結，旨在為新型疫苗研發(fā)提供參考。

1 mRNA疫苗分類

mRNA疫苗可分為常規(guī)mRNA疫苗(conventional mRNA vaccine)與自擴增型mRNA疫苗(self-amplifying mRNA vaccine,SAM vaccine) (圖1)[6]。兩種mRNA疫苗都可以通過cDNA、線性化的質(zhì)粒DNA體外轉錄而成，經(jīng)遞呈系統(tǒng)轉導進入細胞，表達目的抗原[9]。

A..常規(guī)mRNA疫苗結構；B.自擴增型mRNA疫苗結構

1.1 常規(guī)mRNA疫苗其結構與真核細胞mRNA一致，從5′→3′末端依次為5′帽子結構(5′Cap m7Gp3N)，5′非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)，目的抗原基因(gene of interest,GOI)，3′UTR，poly A 尾巴等元件。在GOI處插入目的抗原基因即可完成常規(guī)mRNA疫苗構建，這種疫苗相對分子質(zhì)量較小(2～10 kb)，易被RNA酶降解，需要較大的接種劑量才能達到保護效果。體內(nèi)研究實驗表明，BALB/c小鼠肌肉注射編碼H1N1流感病毒血凝素蛋白(hemagglutinin,HA)的mRNA疫苗6 h后小鼠體內(nèi)開始出現(xiàn)HA蛋白，24 h后達到表達峰值并持續(xù)6 d。當注射劑量為80 μg時能夠誘導小鼠產(chǎn)生足量的中和抗體，保護小鼠免受病毒攻擊[10]。使用遞呈系統(tǒng)能夠提升mRNA的遞呈效率并防止疫苗核酸鏈被RNA酶降解，經(jīng)遞呈系統(tǒng)包裹的常規(guī)mRNA疫苗表達效率顯著提升，使用5 μg mRNA劑量即可表達較高水平的抗原。采用皮下注射的方式接種，抗原表達可延長至10 d[11]。

1.2 自擴增型mRNA疫苗自擴增型mRNA疫苗即SAM或sa-RNA[12-13]，是一種以甲病毒為基礎，在細胞內(nèi)能夠自行復制表達的疫苗。除含有5′Cap、5′UTR、3′UTR、poly A 尾等基礎元件外，還含有2個開放閱讀框(open reading frame,ORF)、26S亞基因啟動子原件。ORF1靠近5′UTR，編碼甲病毒的4個非結構蛋白(non-structural protein,NSP1- NSP4)，輔助mRNA疫苗分子自行復制擴增。NSP1具有鳥嘌呤-7-甲基轉移酶(guanine-7-methyltransferase，MTAse)和鳥苷?；D移酶(guanylyl transferase)活性，能為mRNA添加5′Cap[14]，同時還能鉚定在細胞膜上與NSP3一起輔助形成復制復合體(replication complex，RC)。NSP2能將ORF1編碼的多肽切割成蛋白單體，同時具有5′→3′解螺旋酶活性，輔助RNA復制[15]。NSP4是一種RNA依賴的RNA聚合酶，負責RNA鏈復制[12]。ORF2中編碼目的抗原基因(GOI)[16]。亞基因啟動子26S位于ORF1、ORF2之間，其能夠啟動ORF2核酸鏈在亞基因水平擴增，擴增出的基因能夠直接翻譯成蛋白，顯著提升抗原表達量[17]。

與常規(guī)mRNA疫苗相比，自擴增型mRNA疫苗誘導抗原產(chǎn)量顯著提升，抗原持續(xù)時間、免疫應答時間大大延長。同樣是編碼H1N1 HA蛋白mRNA，1.25 μg SAM即可達到與80 μg常規(guī)mRNA疫苗相同的效果[10]。當遞呈系統(tǒng)包裹SAM后，疫苗使用劑量可降低10倍，即0.1 μg劑量可誘導小鼠產(chǎn)生免疫保護[18]。

2 mRNA疫苗的免疫機理

經(jīng)注射后，mRNA疫苗能被抗原遞呈細胞(antigen presenting cell,APC)捕獲，啟動先天免疫應答與適應性免疫應答，全面激活體液免疫與細胞免疫(圖2)。

2.1 mRNA疫苗誘導先天免疫應答mRNA疫苗核酸鏈能夠被模式型識別受體(如Toll樣受體、RIG-I樣受體等)識別，啟動先天免疫應答。據(jù)報道至少有3種Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)參與識別外源mRNA分子，分別為TLR3、TLR7、TLR8[19-20]。剛被細胞吞入時，疫苗核酸鏈能夠激活內(nèi)體(endosome)膜表面的TLR7、TLR8，其中TLR8能夠被單鏈mRNA分子激活，TLR7能夠被單鏈、雙鏈mRNA分子激活[21]，在細胞質(zhì)內(nèi)TLR3能夠識別mRNA疫苗分子。TLR被激活后，能夠將信號通過接頭蛋白傳遞給下游信號通路，激活先天免疫應答(圖2)。除TLR外，模式型識別受體RIG-I、MD5、PKR、OAS也能夠在細胞質(zhì)內(nèi)識別mRNA疫苗分子，激活先天免疫應答。

2.2 mRNA疫苗誘導適應性免疫應答mRNA疫苗在APC中表達的抗原蛋白，經(jīng)溶酶體處理后成為抗原肽，這些肽段被主要組織相容復合體(major histocompatibility complex,MHC)遞呈給CD4+、CD8+T細胞或者通過釋放被B細胞識別，激活細胞免疫與體液免疫(圖2)。先天免疫應答對于激活適應性免疫應答，特別是細胞免疫應答十分關鍵。亞單位疫苗與滅活疫苗激活細胞免疫能力很弱，主要是因為它們無法被模式型識別受體識別而激活宿主的先天免疫應答[8]。先天免疫應答能夠從幾個方面促進細胞免疫反應：首先，先天免疫應答誘導促炎性因子產(chǎn)生，能夠招募更多的APC、殺傷性細胞招到疫苗注射位點附近，確保mRNA疫苗的遞呈效率與覆蓋范圍；其次促炎性因子的釋放也能夠誘導APC活化，而活化的APC是確保正確誘導適應性免疫應答的核心環(huán)節(jié)；最后先天免疫通路激活能夠誘導Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)產(chǎn)生，IFN-I能夠促進APC激活、促進CD8+T細胞群擴增、促進CD8+T細胞毒性，但當IFN-Ⅰ過多產(chǎn)生時，能夠抑制抗原蛋白質(zhì)表達造成CD8+T細胞耗竭[22]。

圖2 mRNA疫苗的免疫機理

3 mRNA疫苗的改進措施

在工業(yè)生產(chǎn)中，要圍繞提高mRNA核酸鏈穩(wěn)定性、提高抗原蛋白翻譯量、降低副作用3個關鍵點，以mRNA疫苗免疫機理為理論基礎，定向改進mRNA疫苗，提高其經(jīng)濟適用性。

3.1 對mRNA疫苗5′端進行加帽修飾5′Cap是真核細胞mRNA 5′端的修飾，對提高mRNA疫苗翻譯效率，增強mRNA疫苗核酸鏈穩(wěn)定性有著至關重要的作用。首先5′Cap是真核細胞翻譯起始因子4A(eukaryotic translation initiation factor 4A，eIF4A)與mRNA結合位點，當5′Cap與eIF4A結合后能夠起始mRNA翻譯，因此5′Cap結構對于真核細胞mRNA的翻譯效率至關重要[23]。其次，5′Cap還可以防止5′→3′RNA限制性內(nèi)切酶對mRNA的酶切作用，防止mRNA疫苗降解，提升抗原表達量。因此需要對mRNA疫苗進行5′Cap修飾。

3.2 非編碼區(qū)改造在真核生物mRNA中，非編碼區(qū)位于編碼區(qū)的上游與下游，可以調(diào)控mRNA的半衰期與翻譯效率[24]，所以需要對mRNA疫苗的非編碼區(qū)進行優(yōu)化。

3.2.15′UTR的優(yōu)化 在5′UTR中需要添加一些序列，來提升序列翻譯效率。如Kozak序列能夠通過與eIF結合啟動mRNA翻譯，在mRNA疫苗的5′UTR中增加Kozak序列(GCCACCAUGG)，能夠增強核糖體對翻譯起始位點識別的準確性，增強mRNA疫苗翻譯效率，提高抗原蛋白的翻譯量[25]。除此之外，5′UTR中的二級結構會阻礙核糖體翻譯效率，將5′UTR設計成為短、松的結構有利于翻譯效率提升[26]。

3.2.23′UTR的優(yōu)化 3′UTR是microRNA和RNA結合蛋白(RNA-binding proteins， RBP)調(diào)控的重點區(qū)域，其序列能夠影響mRNA的穩(wěn)定性、定位和翻譯效率[27]，如：將非編碼區(qū)替換成人β-球蛋白的5′、3′UTR就顯著提高了mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率[28-29]；3′UTR中的富含AU堿基能夠介導mRNA降解[29-30]，而將3′UTR中AU堿基改造能夠提高mRNA的穩(wěn)定性。因此對3′UTR進行改造也具有十分重要的意義。

3.3 假尿嘧啶修飾與mRNA疫苗純化核酸鏈中的尿嘧啶在激活TLR過程中起著十分重要的作用，而TLR過度激活會誘導IFN-Ⅰ過量產(chǎn)生，抑制抗原蛋白表達并且引起過敏反應。將mRNA疫苗上的尿嘧啶替換為假尿嘧啶能夠減少這種過量刺激，使抗原蛋白表達量提高10倍以上，同時減少副作用，提高疫苗免疫活性[31-32]。除此之外，mRNA疫苗轉錄過程會產(chǎn)生副產(chǎn)物雙鏈mRNA，雙鏈mRNA能夠刺激IFN-Ⅰ過量產(chǎn)生，利用液相色譜將其清除后，抗原蛋白表達量顯著提升[33]。

3.4 polyA尾巴添加多聚腺苷酸尾(即polyA尾巴)位于真核生物mRNA的3′端，長度為20～300 bp，其長短與mRNA的半衰期、翻譯效率有關。首先polyA能夠降低RNA核酸外切酶的切割速度，提高mRNA在體內(nèi)的半衰期，提升抗原表達效率[8]。其次polyA結合蛋白能夠與5′Cap通過eIF相連，與5′Cap一起調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性與翻譯效率。因此需要在mRNA疫苗尾部添加polyA尾巴，提升mRNA穩(wěn)定性與翻譯效率。除此之外添加polyA尾巴的長度也需要十分考究，LINARES-FERNANDEZ等[34]研究表明，120 bp的polyA尾巴能夠提高mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，而在人T細胞中大于300 bp的polyA尾巴能夠提高mRNA的翻譯效率，因此添加polyA尾巴的具體長度需要視具體情況而定。

3.5 密碼子改造各類生物在編碼氨基酸方面都有不同的密碼子編碼偏好性，而mRNA疫苗編碼抗原的密碼子可能在宿主內(nèi)很少使用，當將密碼子改造成為宿主偏好的密碼子后，抗原蛋白產(chǎn)量能夠提升[35]。除此之外，mRNA編碼區(qū)中如果富含GC堿基，容易產(chǎn)生二級結構阻礙抗原翻譯，因此減少GC含量及二級結構后能夠提升抗原產(chǎn)量[34]。

4 mRNA疫苗應用示例

4.1 新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)2020年初，SARS-CoV-2開始在世界范圍內(nèi)流行。2020年1月11日我國向全世界分享了SARS-CoV-2全基因組序列，就在這一刻疫苗研發(fā)競賽正式開始。僅2 d后mRNA疫苗巨頭Moderna 公司宣布與美國國立衛(wèi)生研究院開始合作創(chuàng)制SARS-CoV-2 mRNA疫苗。2020年3月11日Moderna 公司mRNA-1273獲批臨床試驗，成為全球首個獲批臨床試驗的SARS-CoV-2疫苗。2020年12月2日英國緊急批準使用輝瑞和BioNTech公司聯(lián)合研發(fā)的mRNA疫苗(BNT162b2)，成為首個批準緊急使用mRNA疫苗的國家[36]。隨后mRNA-1273也開始被各國授權使用，BNT162b2、mRNA-1273的有效率分別為95.0%和94.1%，效果相當。這是疫苗史中的里程碑的事件，標志著mRNA疫苗正式登上了歷史舞臺，在抗擊疫病過程中發(fā)揮作用。值得一提的是，我國軍事醫(yī)學研究院也完成了mRNA疫苗的創(chuàng)制，該疫苗免疫保護性、穩(wěn)定性均良好，現(xiàn)已進入臨床試驗階段[37]。

4.2 流感病毒流感病毒具有持續(xù)變異、進化的特性，難以被防控。mRNA疫苗具有的可編譯性強、無毒株分離依賴性、免疫活性強等優(yōu)勢，非常適用于應對流感病毒。對甲型流感病毒HA蛋白進行編碼，mRNA疫苗注射小鼠后能夠充分誘導體液與細胞免疫，為小鼠提供持久有力的保護。而當mRNA疫苗編碼較為保守的核衣殼蛋白時，可以對不同的毒株提供交叉保護[38]。據(jù)報道，2種分別編碼H10N8、H7N9型禽流感病毒HA蛋白的mRNA疫苗，已經(jīng)完成I期臨床試驗。結果表明，這2種疫苗的安全性良好，副作用較小。并且2種疫苗在沒有使用佐劑的情況下，都能夠誘導人體產(chǎn)生強烈的免疫反應，顯示出了很高的應用價值[39]。

4.3 人類免疫缺陷病毒(HIV)HIV又稱艾滋病病毒,艾滋病是一種嚴重威脅人類健康的傳染病，自1981年首次被發(fā)現(xiàn)以來，一直沒有有效的治療手段?，F(xiàn)在有幾項研究，正將mRNA疫苗應用于艾滋病的預防與治療之中。2016年，GANDHI等[40]領銜的一項研究是在體外純化志愿者的樹突狀細胞，并將編碼HIV特異性抗原mRNA疫苗轉染、激活樹突狀細胞，將激活后的樹突狀細胞輸回志愿者體內(nèi)，觀察免疫應答情況。遺憾的是這項研究并沒有獲得成功，試驗組與對照組之間的細胞免疫激活程度沒有顯著性差異。另外一項研究中，基于mRNA編碼一種針對HIV的廣譜高效中和抗體的重鏈，mRNA經(jīng)LNP遞呈系統(tǒng)轉導進入小鼠體內(nèi)后能夠翻譯產(chǎn)生大量中和抗體，阻斷HIV感染[41]。而通過LNP遞呈系統(tǒng)，遞呈編碼HIV表面抗原蛋白ENV、GP120的mRNA疫苗，能夠誘導CD4+、CD8+T細胞細胞免疫應答，并產(chǎn)生高效中和抗體[42]。另外，在一項研究中通過陽離子納米乳劑系統(tǒng)，遞呈編碼CLADE C 囊膜糖蛋白的自復制型HIV mRNA 疫苗，能夠誘導產(chǎn)生較強的細胞免疫并產(chǎn)生較高滴度的中和抗體[43]。

4.4 狂犬病病毒(rabies virus,RV)SCHNEE等[44]將編碼RV蛋白的mRNA疫苗免疫小鼠與家豬。結果表明，所有疫苗劑量組均能夠誘導小鼠與家豬產(chǎn)生中和抗體，中和抗體在小鼠持續(xù)存在長達1年以上并且抗體滴度在觀察期內(nèi)保持穩(wěn)定。接種疫苗動物體內(nèi)CD4+、CD8+T細胞均被激活，mRNA疫苗能夠誘導小鼠產(chǎn)生比對照商品化疫苗株更高的CD4+T細胞活性。攻毒保護試驗表明，mRNA疫苗能夠保護實驗動物免受強毒株攻擊。這種mRNA疫苗能在-80℃至70℃環(huán)境下保存數(shù)月，不影響疫苗的免疫活性。同時利用4～56℃ 溫度不斷變換20個循環(huán)，來模擬運輸途中冷鏈中斷等極端情形，結果為儲存條件改變對疫苗的免疫活原性并沒有影響[45]。一項狂犬病mRNA疫苗(CV7202)多中心臨床I期試驗結果表明，接種1，2 μg 2種劑量(各接種2針)，都能夠誘導受試人員體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體，且安全性合格，誘導的中和抗體水平能夠符合WHO標準。5 μg劑量組，因副反應過強而不被采納[46]。

5 討論

mRNA疫苗作為一種新型疫苗形式，具有安全性好、免疫原性強、可編譯性強、設計速度快、產(chǎn)量大、成本低、易于儲存等優(yōu)點，在新冠疫情防控過程中首次登臺便一戰(zhàn)成名，被視作一種革命性的疫苗技術。除疫病防控外，mRNA疫苗正在被用于越來越多的醫(yī)療領域，如腫瘤的防治、罕見疾病的治療等?，F(xiàn)在，mRNA疫苗技術仍需在特異高效遞呈、減少副反應、降低成本、提高疫苗穩(wěn)定性等方面進行改進。相信不遠的將來，mRNA疫苗技術終將會具有更廣泛的適用空間，成為人類對抗眾多疾病的有力武器，保障人類及動物健康，促進社會和諧健康發(fā)展。