膽酸對LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺炎的保護(hù)作用及其機(jī)制

郝浩揚(yáng),趙才軍，何兆祺，張乃生，胡曉宇，付云賀

(吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

乳腺炎(mastitis)是奶牛養(yǎng)殖過程中最為常見且高發(fā)的疾病之一。不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重阻礙了畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1-2]。乳腺炎是由多種因素引起的乳腺組織的炎癥反應(yīng)，主要臨床癥狀為紅、腫、熱、痛以及患病乳區(qū)發(fā)生機(jī)能障礙[3]。奶牛乳腺炎的發(fā)病原因十分復(fù)雜，除了跟養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)管理、以及奶牛的年齡與胎次、所處的泌乳階段、自身遺傳因素等相關(guān)外[1]，主要原因是由細(xì)菌、病毒、支原體、真菌致病性微生物感染所致，其中主要的致病菌是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌等[4-5]。脂多糖(LPS)是大腸桿菌等革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要組成成分[6]。當(dāng)大腸桿菌進(jìn)入乳腺組織后可釋放LPS 誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)[6-7]。目前，對于奶牛乳腺炎的治療，臨床上主要以抗生素為主，但抗生素的濫用很容易導(dǎo)致抗生素殘留，對公共衛(wèi)生安全造成威脅[8]；另外用藥期間和休藥期，牛奶的浪費(fèi)及人工成本的增加，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，尋找安全有效的藥物或制劑來代替抗生素防治乳腺炎，具有至關(guān)重要的意義。

膽汁酸是由肝臟合成的一類氮烷酸衍生物，是肝細(xì)胞中膽固醇分解代謝的終產(chǎn)物[9]。膽汁酸根據(jù)存在形式可以分為游離型膽汁酸和結(jié)合型膽汁酸，膽酸(CA)廣泛存在于多種動物膽汁酸，由肝臟中的膽固醇直接合成，屬于游離型膽汁酸[10]。CA參與肝腸循環(huán)，是肝臟疾病診斷的一個(gè)重要依據(jù)[11]。在過去的研究中，CA被證實(shí)具有抑菌、抗炎的作用[10]。CA還具有乳化脂肪的作用，通過使脂肪與胰脂酶接觸的表面積增大，促進(jìn)脂肪消化[12]。在不同的組織器官中，CA也發(fā)揮著不同作用，在神經(jīng)系統(tǒng)中CA可以起到鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛的作用；在呼吸系統(tǒng)中CA具有鎮(zhèn)咳平喘、舒張平滑肌的作用[13]；在肌肉組織中CA具有解痙的作用；在循壞系統(tǒng)中CA具有降血壓、調(diào)節(jié)心臟搏動的作用。同時(shí)CA還具有抗病毒活性、抗真菌活性、解熱的作用[9,14]。然而，關(guān)于CA對乳腺炎的作用及潛在機(jī)制尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型探索CA對乳腺炎的防治作用及潛在機(jī)制。

1 材料方法

1.1 主要試劑LPS(大腸桿菌，血清型O55：B5)和CA購自Sigma公司；髓過氧化物酶(MPO)測定試劑盒購自南京建成科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)；白介素-1β (IL-1β)ELISA試劑盒購自Biolegend公司；p65、IκB、p-p65、p-p38、p-IκB、β-actin、法尼醇X受體(FXR)抗體購自Immunoway公司；羊抗兔、羊抗鼠二抗購自愛必信公司。

1.2 主要儀器電子天平購自德國Sartonus公司；電泳儀購自北京六一儀器廠；100 μL微量注射器購自上海高鴿公司；高速離心機(jī)購自長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；酶標(biāo)儀購自美國Tecan公司；金屬恒溫加熱器購自上海一恒科技有限公司；顯影儀購自上海天能科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物6～8周齡BALB/c小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，適應(yīng)環(huán)境1周后以雌性∶雄性比例為3∶1合籠飼養(yǎng)，每天給予充足的飲食飲水，分娩后的母鼠用于構(gòu)建乳腺炎動物模型。所有實(shí)驗(yàn)動物的飼養(yǎng)及操作均通過吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理與使用委員會的批準(zhǔn)，符合動物福利要求。

1.4 小鼠乳腺炎模型建立分娩5～7 d的母鼠用于構(gòu)建小鼠乳腺炎動物模型。提前3 h將仔鼠與母鼠分離，用10%烏拉坦將母鼠麻醉，并將母鼠仰臥保定在操作臺上，消毒并暴露第4對乳腺及周圍皮膚。左手持無菌眼科鑷夾取乳頭并固定，右手用滅菌眼科剪剪除1 mm左右乳頭尖端，暴露乳導(dǎo)管。用微量注射器吸取 0.2 g/L的LPS 100 μL，沿乳頭導(dǎo)管緩慢灌注到乳腺內(nèi)，左右各50 μL。對照組灌注相同體積PBS。LPS刺激24 h后，斷頸法處死小鼠，75%酒精消毒腹部皮膚后，沿腹中線剪開腹部皮膚，暴露第4對乳腺并收集乳腺組織。取適量乳腺組織浸泡在4%多聚甲醛中固定，用于HE染色觀察乳腺組織病理學(xué)變化，其余組織-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理將40只分娩5～7 d的母鼠隨機(jī)分為5組：空白對照組、LPS組、LPS+CA(10 mg/kg)組、LPS+CA(20 mg/kg)組和LPS+CA(30 mg/kg)組，在LPS造模前3 h腹腔注射CA，空白對照組、LPS組腹腔注射等量PBS。

1.6 乳腺組織病理學(xué)觀察及炎癥評分LPS處理24 h后，收集小鼠乳腺組織固定于4%多聚甲醛溶液中，通過脫水透明、浸蠟包埋、切片、貼片、脫蠟、蘇木精和曙紅染色、脫水透明和封固完成切片制備，并在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.7 MPO檢測稱取小鼠乳腺組織，研磨，制備組織勻漿。根據(jù)MPO檢測試劑盒說明書配制試劑，完成組織樣品MPO測定。最后通過測量在460 nm 處的D值，計(jì)算酶活力。

1.8 細(xì)胞炎性因子檢測稱取小鼠乳腺組織，以(1∶9)的比例用PBS制備組織勻漿，將制備好的組織勻漿于4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，并根據(jù)ELISA試劑盒說明書對細(xì)胞因子濃度進(jìn)行檢測。

1.9 Western blot檢測提取乳腺組織中的總蛋白。進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠制備，完成電泳，然后將攜帶蛋白質(zhì)的PVDF膜在室溫下用5%脫脂乳封閉3 h，將小鼠 NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB、p-IκB、FXR抗體按1∶1 000比例稀釋，β-actin抗體按1∶4 000稀釋，4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，最后用顯影儀讀取圖像。

2 結(jié)果

2.1 CA緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺組織病理損傷通過在光學(xué)顯微鏡下觀察，空白對照組乳腺組織腺泡壁完整，腺泡內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤(圖1A)。與對照組相比，LPS組小鼠乳腺腺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞，腺泡內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(圖1B)。然而，與LPS組相比，隨著CA濃度的增加乳腺組織結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常，炎性細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖1C～E)。結(jié)果表明，補(bǔ)充CA可以有效改善LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺組織病理性損傷。

2.2 CA降低LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺組織MPO活性對MPO活性檢測結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，LPS組小鼠乳腺組織中MPO活性顯著增加。CA呈劑量依賴性降低LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺組織中MPO活性。

2.3 CA降低LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺組織炎性細(xì)胞因子的表達(dá)利用ELISA試劑盒檢測小鼠乳腺組織中促炎因子TNF-α和IL-1β的濃度。結(jié)果表明，與對照組相比，LPS組小鼠乳腺組織中促炎因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)顯著升高。而不同濃度的CA處理后，乳腺組織中TNF-α和IL-1β的濃度顯著低于LPS組(圖3)。

圖3 CA對LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺組織TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響

2.4 CA抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺組織NF-κB信號通路活化NF-κB信號通路是一條重要的與炎癥信號傳導(dǎo)相關(guān)的通路，因此本試驗(yàn)檢測了相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，與對照組相比，LPS組小鼠的乳腺組織中磷酸化p65和磷酸化IκB的表達(dá)顯著上調(diào),CA干預(yù)后，呈劑量依賴性地抑制了乳腺組織的磷酸化p65和磷酸化IκB的表達(dá)。表明CA可以通過抑制NF-κB信號傳導(dǎo)的活化進(jìn)而發(fā)揮抗炎的作用(圖4)。

圖4 CA對LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺組織中NF-κB信號通路的影響

2.5 CA增加乳腺組織中FXR表達(dá)FXR是與膽汁分泌相關(guān)的常見受體，主要受初級膽汁酸的調(diào)節(jié)[15]。有研究表明FXR的激活具有抗炎的作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)膽汁酸能夠依賴FXR的激活抑制NF-κB活化。本研究發(fā)現(xiàn)， LPS組小鼠乳腺組織中FXR表達(dá)降低，而CA處理組FXR的表達(dá)呈劑量依賴性增加(圖5)。

圖5 CA對LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺組織中FXR受體表達(dá)的影響

3 討論

乳腺炎泛指發(fā)生在乳腺組織的炎癥，是制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重大疾病之一[16]。目前在臨床上奶牛乳腺炎以使用抗生素治療為主，容易導(dǎo)致抗生素濫用、抗生素殘留等問題，對公共衛(wèi)生事業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。同時(shí)在用藥期和休藥期，造成的乳汁浪費(fèi)、人工成本增加等現(xiàn)象，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[17]。CA作為膽固醇的主要代謝產(chǎn)物，廣泛存在于多種動物膽汁，易提取易合成，并且其具有較強(qiáng)的抗炎能力[11]。然而關(guān)于CA在乳腺炎中的作用還尚未見報(bào)道。因此本研究探討了CA對LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺炎的保護(hù)作用及機(jī)制。

乳腺炎主要表現(xiàn)出乳腺組織的病理性損傷以及炎性細(xì)胞，特別是中性粒細(xì)胞的浸潤[18]。病理學(xué)檢測結(jié)果顯示，CA呈劑量依賴性地降低了LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺組織腺泡結(jié)構(gòu)的改變以及大量炎性細(xì)胞浸潤。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，大量的中性粒細(xì)胞能被趨化性物質(zhì)誘導(dǎo)到炎癥部位[19]。同時(shí)在中性粒細(xì)胞內(nèi)含有一定量的MPO，因此MPO活性通常用來評估中性粒細(xì)胞的浸潤情況[20]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激導(dǎo)致小鼠乳腺組織中MPO活性顯著增加，而CA可呈劑量依賴性的降低LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺組織中MPO活性的增加。此外，乳腺組織中炎性細(xì)胞因子的大量釋放是導(dǎo)致乳腺組織損傷的重要因素。TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早的炎性介質(zhì)，使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，調(diào)節(jié)其他組織代謝活性并促進(jìn)使其他細(xì)胞因子的合成和釋放[21]。IL-1β是一種在多種細(xì)胞中產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，包括單核細(xì)胞、組織巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷性細(xì)胞以及角質(zhì)形成細(xì)胞等非免疫細(xì)胞[22-23]。在本試驗(yàn)中，LPS刺激導(dǎo)致小鼠乳腺組織中TNF-α和IL-1β的濃度顯著升高，而CA干預(yù)后小鼠乳腺組織中TNF-α和IL-1β濃度顯著下調(diào)。因此，CA干預(yù)可以抑制乳腺組織中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，緩解LPS誘導(dǎo)的乳腺炎癥。

NF-κB是一種可以在許多細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其主要由IkB，p65等轉(zhuǎn)錄因子組成，激活后可以參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答，并且發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB信號傳導(dǎo)已成為一種新的可以治療腸炎、關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣化等多種疾病的方式[24-26]，同時(shí)在多種LPS炎癥模型中，其發(fā)揮著重要作用[4]，因此在本試驗(yàn)中，檢測了相關(guān)的蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型中和p-p65和p-IκB的表達(dá)水平增加，CA可以降低p-p65和p-IκB的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制NF-κB的活性。

FXR 是核受體超家族的一員，是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。有研究報(bào)道，激活FXR受體可以抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[27]。同時(shí)，F(xiàn)XR激動劑可以抑制NF-κB信號通路。本研究結(jié)果表明，CA 可以呈劑量依賴性地上調(diào)FXR的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，CA對LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎具有保護(hù)作用，這一作用可能是通過增加FXR受體表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB 信號通路來實(shí)現(xiàn)的。