豬β-防御素-2在黃曲霉毒素B1致仔豬空腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用

李慶豪，張 曼，孫 娟，彭雅婷，劉 勇，金 鑫*,李 奎*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.鄭州大學(xué) 第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

黃曲霉毒素(aflatoxin,AF)是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的一種具有強(qiáng)致癌、致畸、致突變的次生代謝產(chǎn)物，多見于霉變飼料中。目前已經(jīng)成功分離的AF多達(dá)20余種并由其在紫外光下發(fā)出的顏色命名[1]，其中以產(chǎn)毒黃曲霉所產(chǎn)生的黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)所占比例最大、毒性最強(qiáng)，其毒性可達(dá)砒霜的68倍且穩(wěn)定性極強(qiáng)[2]。研究表明，長期攝入一定量的AFB1對消化道有嚴(yán)重影響，破壞動(dòng)物腸道菌群平衡，導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率和日增重降低[3]，影響動(dòng)物健康，且影響我國動(dòng)物產(chǎn)品出口，給生產(chǎn)養(yǎng)殖帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。目前解決黃曲霉污染的主要手段是使用抗生素[4-5]，但抗生素的危害及耐藥性問題極大地限制了其使用。因此使用天然抗菌肽作為藥物或飼料添加劑緩解AFB1造成的影響，成為當(dāng)前亟須解決的關(guān)鍵問題。

防御素(defensins)是動(dòng)物自身產(chǎn)生的天然抗菌肽家族中最重要的一類，其分子中的半胱氨酸殘基以二硫鍵連接使防御素分子形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物防御素依據(jù)其分子空間結(jié)構(gòu)的不同分為α-、β-和θ-防御素[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，防御素與多種腸道疾病關(guān)系密切[7]，除具有抗菌和抗病毒的作用外，還能促進(jìn)上皮細(xì)胞再生以修復(fù)機(jī)體損傷[8]。因此，在上皮和黏膜組織中高表達(dá)的防御素構(gòu)成了機(jī)體抵抗外界的第1道防線[9-10]。目前豬源α-和θ-防御素鮮有報(bào)道，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的豬源β-防御素有29種，其中以豬β-防御素-2(porcine β-defensin 2,pBD-2)在消化系統(tǒng)中的含量最高[5]。但其對AFB1所致的腸道損傷是否有緩解或治療作用尚不明確。

為探究pBD-2在AFB1所致小腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用，選用體外培養(yǎng)的新生仔豬空腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)，使用不同質(zhì)量濃度AFB1及pBD-2處理細(xì)胞，找出對細(xì)胞造成顯著影響的AFB1質(zhì)量濃度及可用于細(xì)胞處理的pBD-2安全質(zhì)量濃度，后使用不同質(zhì)量濃度的pBD-2處理AFB1致細(xì)胞損傷模型，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，分別采用qPCR和Western blot方法在mRNA和蛋白水平檢測炎性因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)變化，以分析pBD-2是否對AFB1所致小腸上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)具有緩解作用，為開發(fā)pBD-2作為預(yù)防AFB1對動(dòng)物損害的藥物或綠色飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料IPEC-J2細(xì)胞由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)所需FBS胎牛血清(BS1612)購自BIOEXPLORER公司；基礎(chǔ)培養(yǎng)基(31800，11875)、PBS磷酸鹽緩沖液(P1010)及胰蛋白酶-EDTA消化液(T1300)購自索萊寶科技有限公司；AFB1(A6636,assay:≥98%)購自Sigma公司；pBD-2(BP019197,purity:90.71%)購自武漢百意欣生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞檢測CCK-8試劑盒(GK10001)購自GLPBIO公司；RNA小量提取試劑盒(PID0360406)購自康寧生命科學(xué)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(11123ES60)、qPCR試劑盒(11202ES08)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(20315ES05)及ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒(36208ES60)購自翌圣生物科技有限公司；RIPA裂解液(P0013)及PMSF(ST506)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Western blot所需β-actin抗體(WL01372)、TNF-α抗體(WL01581)、IL-1β抗體(WL00891)及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(WLA023a)購自萬類生物科技有限公司。

1.2 IPEC-J2細(xì)胞培養(yǎng)取出凍存的IPEC-J2細(xì)胞，37℃恒溫水浴快速融化后，使用含10% FBS的完全培養(yǎng)基，以1×105cells/cm2的密度接種至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶培養(yǎng)基總體積5 mL。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)[11]。傳代2～3次后，部分細(xì)胞于液氮中凍存?zhèn)溆茫糠謧鞔?2孔細(xì)胞培養(yǎng)板用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 AFB1及pBD-2可用質(zhì)量濃度篩選

1.3.1不同質(zhì)量濃度AFB1及pBD-2處理IPEC-J2細(xì)胞 待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔面積的90%以上，取出12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使用PBS潤洗細(xì)胞2遍，將培養(yǎng)體系中的完全培養(yǎng)基更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使每孔最終體積為500 μL，在培養(yǎng)孔中分別加入梯度質(zhì)量濃度(0，20，40，60，80，100 mg/L)的AFB1及梯度質(zhì)量濃度(0，2，4，6，8，10 mg/L)的pBD-2處理IPEC-J2細(xì)胞12 h，每一質(zhì)量濃度設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.2CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 處理細(xì)胞12 h后，棄去培養(yǎng)基，使用PBS潤洗細(xì)胞2次，換用基礎(chǔ)培養(yǎng)基并加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基10%體積的CCK-8。置于培養(yǎng)箱孵育4 h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，使用酶標(biāo)儀檢測各培養(yǎng)孔的D450 nm，按照如下計(jì)算方法換算為細(xì)胞存活率，確認(rèn)AFB1及pBD-2的安全質(zhì)量濃度范圍。

其中，Ds：試驗(yàn)組吸光度(含有細(xì)胞、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、CCK-8和AFB1或pBD-2)；Db：空白組吸光度(含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基和CCK-8)；Dc：對照組吸光度(含有細(xì)胞、基礎(chǔ)培養(yǎng)基和CCK-8)。

1.4 AFB1致細(xì)胞損傷模型建立

1.4.1qPCR引物設(shè)計(jì) qPCR所需引物參考NCBI基因序列使用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)并交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 IPEC-J2細(xì)胞炎性因子相關(guān)基因引物信息

1.4.2不同質(zhì)量濃度AFB1處理IPEC-J2細(xì)胞 根據(jù)細(xì)胞存活率檢測結(jié)果，使用安全的梯度質(zhì)量濃度AFB1處理IPEC-J2細(xì)胞12 h，同時(shí)設(shè)立空白對照組。操作方法同1.3.1。

1.4.3細(xì)胞總RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄 處理細(xì)胞12 h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，PBS潤洗2次，按照RNA小量提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，使用多功能酶標(biāo)儀檢測RNA質(zhì)量濃度與純度，將質(zhì)量良好的總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作獲得cDNA。封口膜封口后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4qPCR檢測炎性因子mRNA表達(dá)變化 qPCR選用20 μL體系，其中包含 10 μL的Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix、7.2 μL的RNase-free ddH2O、0.4 μL的濃度為10 μmol/L的Forward Primer和0.4 μL的濃度為10 μmol/L的Reverse Primer及2 μL cDNA模板，擴(kuò)增反應(yīng)后通過擴(kuò)增曲線及溶解曲線判斷擴(kuò)增效果及引物特異性，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計(jì)算并分析TNF-α和IL-1β相對于β-actin的相對表達(dá)量及其變化情況，找出開始對IPEC-J2細(xì)胞造成顯著影響的AFB1質(zhì)量濃度，依據(jù)藥物低中劑量原則[12]，以此濃度的AFB1處理細(xì)胞，建立細(xì)胞損傷模型。qPCR擴(kuò)增程序按照qPCR試劑盒說明書設(shè)置如下：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線階段使用儀器默認(rèn)設(shè)置。

1.5 pBD-2在AFB1致IPEC-J2細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用分析

1.5.1AFB1及pBD-2處理IPEC-J2細(xì)胞 根據(jù)細(xì)胞存活率檢測及細(xì)胞損傷模型建立結(jié)果，使用可用梯度質(zhì)量濃度的pBD-2處理AFB1致IPEC-J2細(xì)胞損傷模型，根據(jù)pBD-2質(zhì)量濃度梯度設(shè)置多組試驗(yàn)組。同時(shí)設(shè)立單獨(dú)使用AFB1和pBD-2處理的細(xì)胞作為陽性對照組和陰性對照組，未做任何處理的細(xì)胞作為空白對照組。所有對照組處理細(xì)胞12 h，試驗(yàn)組使用AFB1處理12 h后，分別換用不同質(zhì)量濃度pBD-2處理12 h。操作方法同1.3.1。所有組均設(shè)置6次重復(fù)，分為2批處理，分別用于總RNA和總蛋白提取。

1.5.2細(xì)胞總RNA及總蛋白提取 細(xì)胞處理結(jié)束后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，與1.4.3相同操作提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將RIPA裂解液和PMSF按照9∶1的比例混合，使PMSF的終濃度為1 mmol/L。取另一批細(xì)胞，PBS潤洗2次，按照RIPA裂解液說明書操作提取細(xì)胞總蛋白，再按照每4 μL蛋白樣品加入1 μL蛋白上樣緩沖液(5×)的比例，給每個(gè)蛋白樣品加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。混勻后沸水浴5 min，使蛋白充分變性。封口膜封口后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3qPCR檢測炎性因子mRNA表達(dá)變化 方法同1.4.4，分析TNF-α和IL-1β相對于β-actin的相對表達(dá)量及其變化情況，在mRNA水平確定pBD-2在AFB1致IPEC-J2細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。

1.5.4Western blot檢測炎性因子蛋白表達(dá)變化 SDS-PAGE蛋白凝膠按照分離膠10%、濃縮膠5%的濃度配制。按每孔等體積上樣量10 μL，采用濃縮膠80 V、分離膠120 V的恒壓設(shè)置，約150 min完成電泳。使用200 mA恒流模式轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，再用5%脫脂牛奶封閉。孵育抗體后使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，比值法計(jì)算TNF-α和IL-1β相對于內(nèi)參蛋白β-actin的相對表達(dá)量。在蛋白水平確定pBD-2在AFB1致IPEC-J2細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。

2 結(jié)果

2.1 IPEC-J2細(xì)胞培養(yǎng)使用含10% FBS的完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果如圖1所示，細(xì)胞24 h可鋪滿培養(yǎng)瓶底部的80%以上，細(xì)胞狀態(tài)良好，生長速度較快，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 IPEC-J2細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h時(shí)觀察結(jié)果

2.2 AFB1及pBD-2可用質(zhì)量濃度范圍篩選在AFB1或pBD-2處理過的細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基和CCK-8，同時(shí)設(shè)立對照組和僅含基礎(chǔ)培養(yǎng)基及CCK-8的空白組，置于培養(yǎng)箱孵育4 h后，使用酶標(biāo)儀測定各培養(yǎng)孔的D450 nm，計(jì)算細(xì)胞相對存活率。檢測結(jié)果如圖2所示，致細(xì)胞顯著死亡的AFB1起始質(zhì)量濃度為60 mg/L；pBD-2在10 mg/L時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率顯著低于空白對照組。因此，AFB1和pBD-2的使用質(zhì)量濃度應(yīng)分別低于60，10 mg/L。

2.3 AFB1致IPEC-J2細(xì)胞損傷模型的建立根據(jù)質(zhì)量濃度篩選結(jié)果，使用梯度質(zhì)量濃度(0，10，20，30，40，50 mg/L)的AFB1處理細(xì)胞12 h，提取細(xì)胞總RNA，使用qPCR方法檢測TNF-α mRNA與IL-1β mRNA的表達(dá)變化。

2.3.1qPCR擴(kuò)增反應(yīng) 選用20 μL擴(kuò)增體系，按照1.4.4中的參數(shù)設(shè)置進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增曲線及溶解曲線如圖3所示，擴(kuò)增曲線均表現(xiàn)為S形指數(shù)特征，表明擴(kuò)增效果良好；溶解曲線均為單一峰曲線，且Tm值與設(shè)計(jì)值相同，未見多峰、主峰增寬或主峰位置不一致，表明引物特異性良好，不存在非特異性擴(kuò)增。

2.3.2AFB1對TNF-α mRNA及IL-1β mRNA表達(dá)的影響 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔΔCt法計(jì)算數(shù)據(jù)并分析TNF-α和IL-1β相對于β-actin的相對表達(dá)量及其變化情況。結(jié)果如圖4所示，不同質(zhì)量濃度的AFB1處理IPEC-J2細(xì)胞，炎性因子TNF-α mRNA和IL-1β mRNA的表達(dá)存在劑量相關(guān)的變化，且AFB1自質(zhì)量濃度30 mg/L起對細(xì)胞造成顯著影響(P<0.05)。因此，后續(xù)試驗(yàn)使用30 mg/L的AFB1處理細(xì)胞，建立細(xì)胞損傷模型。

不含相同字母的組間存在顯著性差異(P<0.05)。下同

圖3 β-actin(A)、TNF-α(B)和IL-1β(C)的擴(kuò)增曲線及溶解曲線

與空白對照組(0 mg/L)相比，*P<0.05，**P<0.01

2.4 pBD-2在AFB1致IPEC-J2細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用使用梯度質(zhì)量濃度(2，4，6，8 mg/L)的pBD-2處理細(xì)胞損傷模型12 h，同時(shí)設(shè)立AFB1陽性對照組、pBD-2陰性對照組和空白對照組。提取各組細(xì)胞總RNA和總蛋白，分別使用qPCR和Western blot方法從mRNA和蛋白水平檢測炎性因子TNF-α與IL-1β的表達(dá)變化。

2.4.1TNF-α的表達(dá)變化 qPCR與Western blot結(jié)果顯示，2，4，6，8 mg/L的pBD-2對TNF-α mRNA的表達(dá)均無顯著影響(P>0.05)，但自4 mg/L起可顯著上調(diào)TNF-α蛋白的表達(dá)(P<0.05)；30 mg/L 的AFB1在兩方面均將其顯著上調(diào)(P<0.05)。使用不同質(zhì)量濃度的pBD-2處理細(xì)胞損傷模型，當(dāng)pBD-2為2，8 mg/L時(shí)顯著上調(diào)了TNF-α mRNA的表達(dá)(P<0.05)，在4，6 mg/L時(shí)將mRNA下調(diào)至空白對照組水平(P<0.05)，蛋白方面TNF-α的表達(dá)均有顯著降低(P<0.05)，在8 mg/L時(shí)將其下調(diào)至顯著低于空白對照組水平(P<0.05)。結(jié)果表明，AFB1可上調(diào)IPEC-J2細(xì)胞TNF-α的表達(dá)促發(fā)炎癥反應(yīng)，pBD-2可重新下調(diào)TNF-α的表達(dá)以緩解該炎癥反應(yīng)，且以6 mg/L的pBD-2緩解作用最佳(圖5)。

0.空白對照組；2P～8P.陰性對照組(2，4，6，8 mg/L pBD-2)；30A.陽性對照組(30 mg/L AFB1)；A2P～A8P.試驗(yàn)組(30 mg/L AFB1+2，4，6，8 mg/L pBD-2)

2.4.2IL-1β的表達(dá)變化 qPCR與Western blot結(jié)果顯示，2，4，6，8 mg/L的pBD-2對IL-1β mRNA的表達(dá)均無顯著影響(P>0.05)，但可逐漸上調(diào)IL-1β蛋白的表達(dá)(P<0.05)；30 mg/L的AFB1在兩方面均將其顯著上調(diào)(P<0.05)。使用不同質(zhì)量濃度的pBD-2處理細(xì)胞損傷模型，IL-1β mRNA及蛋白的表達(dá)均有顯著降低(P<0.05)，其中4，6 mg/L的pBD-2可重新下調(diào)IL-1β mRNA的表達(dá)至空白對照組水平(P<0.05)；6，8 mg/L的pBD-2將IL-1β蛋白下調(diào)至空白對照組水平(P<0.05)。結(jié)果表明，AFB1可上調(diào)IPEC-J2細(xì)胞IL-1β的表達(dá)促發(fā)炎癥反應(yīng)，pBD-2可重新下調(diào)IL-1β的表達(dá)以緩解該炎癥反應(yīng)，且以6 mg/L的pBD-2緩解作用最佳(圖6)。

0.空白對照組；2P～8P.陰性對照組(2，4，6，8 mg/L pBD-2)；30A.陽性對照組(30 mg/L AFB1)；A2P～A8P.試驗(yàn)組(30 mg/L AFB1+2，4，6，8 mg/L pBD-2)

3 討論

AFB1是最常見且毒性最強(qiáng)的霉菌毒素，常見于霉變動(dòng)物飼料，長期攝入一定量的AFB1對動(dòng)物消化道會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p傷[13]，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅。pBD-2作為動(dòng)物體內(nèi)的天然抗菌肽，除具有廣譜抗菌和抗病毒的作用外，還可增強(qiáng)動(dòng)物免疫力、修復(fù)損傷和促進(jìn)傷口愈合[14]。由試驗(yàn)結(jié)果可知，與空白對照組相比，60 mg/L及更高質(zhì)量濃度AFB1組細(xì)胞顯著死亡，表明60 mg/L及更高質(zhì)量濃度的AFB1對小腸上皮細(xì)胞具有致命毒性，可對腸黏膜造成嚴(yán)重?fù)p傷；PESTKA等[15]研究表明，低攝入量、短攝入時(shí)間及單次頻率的霉菌毒素刺激，具有上調(diào)免疫應(yīng)答的作用。20 mg/L AFB1組細(xì)胞存活率顯著高于空白對照組，表明低質(zhì)量濃度的AFB1可能具有免疫刺激作用[16]，激發(fā)了細(xì)胞的免疫反應(yīng)以清除毒素并促進(jìn)細(xì)胞增殖。唐吉等[17]研究表明，藥物劑量是影響藥物效應(yīng)的重要因素。不同劑量的同一藥物可能會(huì)產(chǎn)生不同的作用，過高劑量反而會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)。2，4，6，8 mg/L的pBD-2顯著提高了細(xì)胞存活率，表明適宜質(zhì)量濃度的pBD-2具有促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞生長的作用，但10 mg/L的pBD-2表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，因此pBD-2在生產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用務(wù)必注意使用劑量。

AFB1在30 mg/L時(shí)會(huì)顯著影響IPEC-J2細(xì)胞炎性因子TNF-α及IL-1β的表達(dá)變化，pBD-2可調(diào)節(jié)這種變化來緩解細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。TNF-α作為具有多種生物效應(yīng)的細(xì)胞因子，其主要作用是促進(jìn)炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫[18]，隨著AFB1質(zhì)量濃度逐漸升高，TNF-α mRNA的表達(dá)先明顯降低，后顯著升高，表明低質(zhì)量濃度的AFB1激起了細(xì)胞的免疫反應(yīng)，高質(zhì)量濃度的AFB1使TNF-α過度表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，當(dāng)AFB1上調(diào)其表達(dá)后，適宜質(zhì)量濃度的pBD-2可將其重新下調(diào)至正常水平。IL-1β是IL-1家族中的一種，在細(xì)胞因子中處于關(guān)鍵地位，不僅在免疫應(yīng)答中至關(guān)重要，且廣泛參與感染狀態(tài)和炎癥反應(yīng)[19]，其表達(dá)隨AFB1劑量升高逐漸上升表明細(xì)胞受到AFB1影響出現(xiàn)了劑量依賴性的免疫應(yīng)答或炎癥反應(yīng)，后在pBD-2的作用下得到緩解。以上結(jié)果表明pBD-2可通過降低TNF-α及IL-1β的表達(dá)緩解AFB1導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。

李宇華等[12]研究表明，藥物使用存在明確的量效關(guān)系，較低劑量或許無法達(dá)到應(yīng)有效果并可能存在耐藥問題，過高劑量甚至可能出現(xiàn)毒性作用，且過低劑量和過高劑量均可能出現(xiàn)與預(yù)期相反的效果?？琢钤频萚20]研究表明，具有劑量毒性的不同物質(zhì)共同作用時(shí)可能出現(xiàn)混合毒性，且混合毒性作用一般至少高于其中一種物質(zhì)單獨(dú)作用。使用pBD-2處理AFB1細(xì)胞損傷模型，在mRNA水平下調(diào)TNF-α與IL-1β的表達(dá)時(shí)均出現(xiàn)兩者的表達(dá)先降低后升高的現(xiàn)象，此結(jié)果的出現(xiàn)可能是由于過低質(zhì)量濃度的pBD-2未能達(dá)到消除細(xì)胞炎性因子過量表達(dá)的作用，僅起到一定程度的緩解作用，而較高質(zhì)量濃度的pBD-2與AFB1出現(xiàn)混合毒性，再次激起了細(xì)胞的免疫應(yīng)答。蛋白水平未出現(xiàn)這一現(xiàn)象，考慮蛋白與mRNA的作用不同，蛋白的產(chǎn)生以mRNA的存在為前提，mRNA最終通過蛋白發(fā)揮作用，兩者相互調(diào)控，且mRNA水平與蛋白水平的表達(dá)存在時(shí)空特異性，在相關(guān)機(jī)制下mRNA與蛋白的表達(dá)量可能呈非線性相關(guān)[21]。但TNF-α與IL-1β一致的變化趨勢共同說明了AFB1對IPEC-J2細(xì)胞的影響以及pBD-2在修復(fù)細(xì)胞損傷和緩解炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用。

綜上所述，適宜劑量的pBD-2可通過調(diào)控炎性因子的表達(dá)來緩解AFB1對小腸上皮細(xì)胞造成的炎癥反應(yīng)，在一定程度上緩解了AFB1對消化道的損害。本研究為開發(fā)pBD-2作為預(yù)防AFB1對動(dòng)物損害的藥物或綠色飼料添加劑提供了理論依據(jù)。