三氮脒處理后犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

馮笑笑，張佩豪，張 悅，田思瑾，劉亞娟，姚大偉

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

三氮脒(diminazene aceturate，DA)作為一種廣譜抗血液原蟲(chóng)的芳香雙脒類衍生物藥物，因其特效以及價(jià)格低廉成為國(guó)內(nèi)治療犬巴貝斯蟲(chóng)病的首選藥物[1]。但是，近年來(lái)隨著耐藥蟲(chóng)株的不斷出現(xiàn)，臨床上DA很難徹底清除體內(nèi)的巴貝斯蟲(chóng)，導(dǎo)致治療周期較長(zhǎng)，而且復(fù)發(fā)率極高。目前，尚不清楚犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)(Babesiagibsoni)對(duì)DA產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理，對(duì)于DA藥物作用機(jī)理的研究也相對(duì)較少。轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序(RNA sequencing，RNA-Seq)技術(shù)[2]可從整體水平上對(duì)細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律進(jìn)行研究。目前轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序已在B.bigemina[3]、B.microti[4]、B.bovis[5]以及B.divergens[6]的研究中得到應(yīng)用。但是,關(guān)于犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究報(bào)道較少，并沒(méi)有公開(kāi)可用的轉(zhuǎn)錄組信息。為了更好的了解DA藥物與犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)之間的相互作用，本試驗(yàn)對(duì)犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)進(jìn)行體外培養(yǎng)，DA藥物處理24 h后，提取樣品中總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析，探索、篩選與DA藥物作用相關(guān)的犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)基因，以提高對(duì)DA與巴貝斯蟲(chóng)相互作用機(jī)制的了解，尋求潛在的藥物作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)株來(lái)源犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)由本實(shí)驗(yàn)室保存，接種于試驗(yàn)犬保蟲(chóng)。

1.2 主要試劑胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco；青鏈霉素混合液(100×)、紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自Solarbio；DA購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 帶蟲(chóng)血樣的培養(yǎng)與處理采集保蟲(chóng)犬血液2 mL，EDTA抗凝，3 000 r/min離心10 min。棄掉上層血清和白細(xì)胞層，收集下層的紅細(xì)胞。用PBS洗滌3次，紅細(xì)胞泥用10倍體積的完全培養(yǎng)液懸浮(RPMI1640培養(yǎng)基含40% FBS、1%青鏈霉素混合液(100×))。無(wú)菌采取健康犬血液2 mL EDTA抗凝，處理方法同上。將保蟲(chóng)犬紅細(xì)胞懸液與健康犬紅細(xì)胞懸液等比例混合，放至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2 mL。每24 h吹打混勻紅細(xì)胞1次，取5 μL制備血涂片，經(jīng)瑞氏吉姆薩染色后在油鏡下觀察蟲(chóng)體，計(jì)算紅細(xì)胞染蟲(chóng)率。培養(yǎng)3 d后棄去上清800 μL。在試驗(yàn)組添加含DA藥物的完全培養(yǎng)液800 μL，藥物終濃度為800 nmol/L，對(duì)照組添加完全培養(yǎng)液800 μL，每組3個(gè)重復(fù)。

1.4 紅細(xì)胞裂解處理DA藥物處理24 h后，取1.5 mL培養(yǎng)的紅細(xì)胞，加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，渦旋混勻后，置于冰上15 min。期間渦旋混勻2次。4℃、450×g離心10 min，棄上清液。向沉淀中加入2倍體積的紅細(xì)胞裂解液，渦旋混勻。于4℃、450×g離心10 min，棄上清液。用500 μL DEPC水重懸，放至液氮迅速冷凍后，-80℃ 備用。對(duì)照組樣品處理方法相同。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程將-80℃保存的樣品送至深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。采用DNBSEQ測(cè)序平臺(tái)，DNBSEQ測(cè)序流程為mRNA文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析。由于數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有關(guān)于犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組信息，因此本試驗(yàn)采用無(wú)參比對(duì)。測(cè)序得到的原始測(cè)序序列用過(guò)濾軟件SOAPnuke v1.4.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并使用trimmomatic v0.36進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，獲得Clean reads，將樣品的Clean reads與組裝得到的Unigene庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)。

1.6 差異基因轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證采集保蟲(chóng)犬血液和臨床患犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)病的病犬的血液樣品2 mL，制備紅細(xì)胞懸液，然后用DA處理，處理方法同1.3。取處理后的血液樣品100 μL，加入1 mL RNAiso plus，按照說(shuō)明書方法提取樣品中總RNA，10 μL反轉(zhuǎn)錄體系中加入500 ng總RNA按照PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)說(shuō)明書方法將上述RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

篩選轉(zhuǎn)錄水平差異較大的基因CL118，根據(jù)測(cè)得的基因序列，采用Primer Primer (Version 5.0)軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物CL 118-F：5′-CCGGATTACGGGACAGAGTTA-3′，下游引物CL 118-R：5′-TAGTTCCAATGGAGCCGTCC-3′，擴(kuò)增片段大小為72 bp。根據(jù)犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)18S rRNA基因保守序列設(shè)計(jì)引物，上游引物B.com 151-F：5′-TGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTG-3′，下游引物B.com 151-R：5′-TCCATGCTGAAGTATTCAAGACACA-3′，擴(kuò)增片段大小為152 bp。以上引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。在25 μL反應(yīng)體系中加入2.5 μL cDNA，按照TB Green?Premix Ex Taq試劑說(shuō)明書進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)在7300 Real-time PCR System中進(jìn)行。以CL118作為靶基因，犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)18S rRNA基因作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析，以未用藥物處理組作為對(duì)照，檢測(cè)DA藥物作用后犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)CL118基因轉(zhuǎn)錄水平。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)與組裝結(jié)果的比對(duì)統(tǒng)計(jì)從Clean reads質(zhì)量統(tǒng)計(jì)表(表1)可以看出：6個(gè)樣品過(guò)濾后的序列數(shù)在3 643～4 256萬(wàn)條之間，測(cè)序質(zhì)量值大于20(Q20)的堿基占所有堿基的92%以上，測(cè)序比對(duì)效率均值在86%左右，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，滿足后續(xù)分析要求。

表1 Clean reads質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

2.2 轉(zhuǎn)錄組功能注釋結(jié)果

2.2.1GO數(shù)據(jù)庫(kù)分析 通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后的轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，根據(jù)Nt數(shù)據(jù)庫(kù)注釋共篩選出77個(gè)有關(guān)巴貝斯蟲(chóng)屬的基因，將篩選后的基因進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分類，基因注釋信息如圖1所示。屬于生物過(guò)程的有74個(gè)，其中與細(xì)胞過(guò)程(39個(gè))和代謝過(guò)程(29個(gè))的unigenes較多，而生物之間的種間相互作用(2個(gè))、生物調(diào)節(jié)(1個(gè))、刺激反應(yīng)(1個(gè))、定位(1個(gè))以及生物調(diào)節(jié)過(guò)程(1個(gè))的unigenens較少。屬于分子功能有77個(gè)，其中與結(jié)合活性(31個(gè))、結(jié)構(gòu)分子活性(22個(gè))、催化活性(17個(gè))、翻譯調(diào)節(jié)活動(dòng)(6個(gè))的unigenes較多，而與蛋白質(zhì)標(biāo)簽(1個(gè))相關(guān)的unigenens較少。屬于細(xì)胞組分有92個(gè)，二級(jí)分類分別為細(xì)胞結(jié)構(gòu)實(shí)體(43個(gè))、細(xì)胞內(nèi)部組分(38個(gè))和含蛋白質(zhì)復(fù)合物(11個(gè))。

圖1 犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)藥物處理后差異表達(dá)基因GO分類

2.2.2KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析 將篩選后的基因進(jìn)行KEGG代謝通路注釋，主要聚集在細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝和有機(jī)系統(tǒng)類別中。如圖2所示，其中參與細(xì)胞過(guò)程的相關(guān)基因共有15個(gè)，其二級(jí)分類分別為真核細(xì)胞群落(2個(gè))、細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡(5個(gè))、運(yùn)輸與分解代謝(6個(gè))以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(2個(gè))；參與環(huán)境信息處理代謝途徑的相關(guān)基因有7個(gè)，均屬于信號(hào)傳導(dǎo)(7個(gè))類；參與遺傳信息處理的相關(guān)基因共有36個(gè)，其二級(jí)分類分別屬于翻譯(29個(gè))、轉(zhuǎn)錄(2個(gè))、蛋白質(zhì)折疊、分類以及降解(5個(gè))；與代謝相關(guān)的基因共有3個(gè)，其二級(jí)分類分別為概述代謝圖(1個(gè))、能量代謝(1個(gè))以及碳水化合物代謝(1個(gè))；與有機(jī)系統(tǒng)相關(guān)的基因共有22個(gè)，其二級(jí)分類的代謝途徑分別為內(nèi)分泌系統(tǒng)(8個(gè))、免疫系統(tǒng)(5個(gè))、成熟過(guò)程(3個(gè))、環(huán)境適應(yīng)(3個(gè))、敏感度系統(tǒng)(2個(gè))以及循環(huán)系統(tǒng)(1個(gè))。

圖2 吉氏巴貝斯蟲(chóng)藥物處理后差異表達(dá)基因KEGG分類

2.3 不同樣本差異基因表達(dá)分析本試驗(yàn)在篩選的過(guò)程中，將錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR(flase discovery rate)<0.01、差異倍數(shù)(flod change,FC)≥2為篩選標(biāo)準(zhǔn)。其中，F(xiàn)C表示2個(gè)樣本(組)間表達(dá)量的比值。測(cè)序結(jié)果顯示，DA作用后犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)CL118基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。該基因在目前有記載的犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)基因數(shù)據(jù)庫(kù)中尚無(wú)相關(guān)報(bào)道和注釋，該基因與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的線蟲(chóng)Parastrongyloidestrichosuri(LM523569)基因序列同源性約90%，該基因與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的盤尾絲蟲(chóng)Onchocerca(VDN00566)氨基酸序列同源性約71%。

2.4 基因表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性，采用相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證，檢測(cè)犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)CL118基因相對(duì)18S rRNA內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖3樣品A組所示，試驗(yàn)室保存蟲(chóng)株經(jīng)DA處理后的CL118基因轉(zhuǎn)錄水平顯著性下調(diào)，該結(jié)果與RNA-Seq的分析結(jié)果相一致，說(shuō)明CL118基因在DA處理后基因轉(zhuǎn)錄水平確實(shí)下調(diào)。

A.實(shí)驗(yàn)室保存蟲(chóng)株；B～D.臨床收集待測(cè)蟲(chóng)株;與對(duì)照組比較，*示P<0.05;**示P<0.01

采集臨床其他患犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)病的病犬血液，檢測(cè)DA藥物處理后CL118基因的轉(zhuǎn)錄水平，所有臨床樣品CL118基因的轉(zhuǎn)錄水平都下調(diào)(降低為未經(jīng)藥物處理組的22.6%～61.2%)。結(jié)果表明，犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)在DA處理后蟲(chóng)體CL118基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。

3 討論

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從整體水平對(duì)基因在蛋白合成中所發(fā)揮的功能以及基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，以揭示在生物應(yīng)對(duì)特定的疾病或其他因素時(shí)在分子水平上的變化規(guī)律。這對(duì)于研究寄生蟲(chóng)的致病機(jī)制、疫苗的開(kāi)發(fā)以及藥物靶標(biāo)的篩選都發(fā)揮重要的作用。有研究報(bào)道，由羅氏巴貝斯蟲(chóng)所引起的犬巴貝斯蟲(chóng)病與人的惡性瘧原蟲(chóng)病的臨床癥狀相似[7]，因此參考瘧疾的研究模型來(lái)用作犬巴貝斯蟲(chóng)的研究的同時(shí)[8]，也有研究將巴貝斯蟲(chóng)與瘧原蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組以及基因組進(jìn)行比對(duì)[9-10]，以發(fā)現(xiàn)兩者的異同。

目前,DA是普遍公認(rèn)有效的抗蟲(chóng)藥，還具有抗炎[11]和抗血壓[12]等作用。該藥作為抗原蟲(chóng)常用藥已有60多年的歷史，長(zhǎng)時(shí)間的使用已有耐藥蟲(chóng)株的出現(xiàn)。目前對(duì)其耐藥性的作用機(jī)制研究較少。有研究表明[14]，通過(guò)體外培養(yǎng)可獲得犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)DA耐藥蟲(chóng)株，而且耐藥蟲(chóng)株與原蟲(chóng)株有能量和糖酵解等代謝的差異。具有DA抗性的犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)分離株比自然感染的野生型蟲(chóng)株具有更高的ATP濃度,表明其糖酵解途徑的活性并沒(méi)有改變。為此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)對(duì)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后用DA進(jìn)行藥物處理，以探究藥物對(duì)于蟲(chóng)體基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。

對(duì)于犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)并沒(méi)有該蟲(chóng)株可查的全基因組數(shù)據(jù)參考，已知的生物信息量又很匱乏，很多并未公開(kāi)數(shù)據(jù)，這給轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析帶來(lái)了困難。目前對(duì)沒(méi)有參考基因組的物種的研究，主要采取的方法是通過(guò)無(wú)參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)行組裝，將獲得的數(shù)據(jù)與已知的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(NR、Nt、Swiss-Prot、GO、KEGG)進(jìn)行比對(duì)，依托于強(qiáng)大的生物信息學(xué)平臺(tái)作為支撐，并根據(jù)“基因結(jié)構(gòu)相似，功能同源”的原理，對(duì)基因的功能進(jìn)行注釋，從而從基因水平上預(yù)測(cè)未知基因的功能并進(jìn)行有方向性的檢測(cè)。本試驗(yàn)將犬屬Unigene篩除后，將獲得的9 699條Unigene數(shù)據(jù)進(jìn)行7大功能數(shù)據(jù)庫(kù)注釋(KEGG、GO、NR、NT、SwissProt、Pfam和KOG)，共有9 332條Unigene獲得了基因注釋，占All-Unigene的96.22%。被所有基因庫(kù)注釋的基因共有131條Unigene(1.35%)，有3.78%的Unigene未被注釋。對(duì)于沒(méi)有得到注釋的Unigene，有可能是吉氏巴貝斯蟲(chóng)經(jīng)DA處理后有新基因，或由于數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)有的基因資源有限，基因功能注釋信息不豐富，從而造成部分序列暫時(shí)無(wú)法獲得對(duì)應(yīng)的功能注釋信息。

對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后的Nt進(jìn)行有關(guān)巴貝斯蟲(chóng)屬注釋的篩選，共篩選出77個(gè)表達(dá)基因，通過(guò)比較其表達(dá)基因GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，發(fā)現(xiàn)注釋富集基因最多的類別是細(xì)胞組分、分子功能和生物進(jìn)程。而差異表達(dá)基因在KEGG通路注釋中，顯示參與翻譯通路有關(guān)的基因較多，提示了DA處理后關(guān)于巴貝斯蟲(chóng)屬的基因表達(dá)變化的方向和代謝途徑。

通過(guò)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平顯著與否進(jìn)行基因篩選，發(fā)現(xiàn)CL118基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著性下調(diào)。對(duì)該基因進(jìn)行核酸數(shù)據(jù)庫(kù)和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)其與Onchocercaochengi(VDN00566.1)氨基酸序列存在71%的相似度，與Parastrongyloidestrichosuri(LM523569.1)基因序列存在90%的同源性。對(duì)CL118基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)蟲(chóng)株在DA處理后，CL118基因的轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)明顯下降，該結(jié)果與RNA-Seq的分析結(jié)果相一致。通過(guò)臨床驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DA處理后的臨床樣本蟲(chóng)株的CL118基因的轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)下降，試驗(yàn)結(jié)果與RNA測(cè)序結(jié)果相一致。其下調(diào)的原因可能是與DA藥物作用有關(guān)，有可能是DA藥物作用的靶點(diǎn)。