禽腺病毒強毒(FAdV-4)WZ株對SPF雞和SPF鴨的致病性比較

李利杰，孫文杰，劉 琳，王賽楠，趙振超，張世華，陶明月，高文明，李新生

(河南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，河南 鄭州 450002)

包涵體肝炎-心包積液綜合征(hepatitis hydropericardium syndrome，HHS)于1986年在巴基斯坦安卡拉地區(qū)首次報道，稱為“安卡拉病”；因為心包積液后似荔枝，也稱為“荔枝病”[1]。此后，該病在亞洲、南美洲、北美洲和歐洲等多個地區(qū)廣泛傳播。2015年，HHS在我國主要養(yǎng)雞地區(qū)暴發(fā)[2]。給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。HHS主要引起3～6周齡仔雞急性死亡，病死率為10%～80%，典型病變?yōu)椋焊闻K發(fā)生包涵體肝炎、心包內(nèi)有淡黃色、膠凍樣積液[3]。

在我國暴發(fā)的HHS是由高毒力禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)引起的[4]。FAdV屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬病毒，共分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個群[5]。其中Ⅰ群FAdV分為A、B、C、D、E 5個種，F(xiàn)AdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10、FAdV-11共12個血清型[6]。12種血清型的FAdV均可引發(fā)禽類的肝炎、心包積液綜合征或HHS。在我國雞群流行感染引起HHS的病原屬于Ⅰ群C種血清4型禽腺病毒(FAdV-4)[7]。

雞是FAdV-4強毒最易感的自然宿主，包括肉雞、商品蛋雞和種雞，在其他宿主中很少引起嚴重的臨床發(fā)病和高病死率[8]。PAN等[9]從患有心包積液的病鴨體內(nèi)分離出1株鴨源FAdV-4毒株，并在SPF雞和SPF鴨上進行了致病性評價，發(fā)現(xiàn)其在雞中可誘發(fā)嚴重的心包積液和導(dǎo)致10%的病死率，而在試驗組鴨中均未觀察到臨床癥狀。FAdV-4強毒是否感染鴨并導(dǎo)致鴨發(fā)病和死亡還尚未見報道。因此，本試驗分別經(jīng)肌肉注射接種28日齡SPF鴨和28日齡SPF雞高致病力雞源FAdV-4毒株WZ株，對強毒攻擊后雞和鴨的臨床癥狀、大體病變、存活率、體質(zhì)量、組織病理學變化、內(nèi)臟組織病毒載量以及泄殖腔排毒情況進行系統(tǒng)比較研究。

1 材料與方法

1.1 病毒和LMH細胞FAdV-4強毒W(wǎng)Z株由河南農(nóng)業(yè)大學分離鑒定保存；LMH細胞購自ATCC(ATCC?CRL-2117TM)。

1.2 實驗動物SPF種雞蛋購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；SPF種鴨蛋購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。種蛋均由本實驗室按照相關(guān)標準孵化、飼養(yǎng)于SPF隔離器內(nèi)。

1.3 病毒培養(yǎng)無菌條件下，將凍存的FAdV-4 WZ株肝組織剪碎，按質(zhì)量比1∶4加入無菌PBS，充分研磨，制成20%肝組織勻漿，反復(fù)凍融3～5次后4 000×g離心10 min，取上清，加入青鏈霉素混合液使其終濃度分別為100 U/mL、100 g/L，4℃作用2 h，經(jīng)0.45 μm和0.22 μm無菌濾器過濾后，取200 μL 20%肝組織上清接種至單層的LMH細胞，37℃感作1 h，棄去上清液，PBS清洗3次，加入一定量含2%胎牛血清的DME/F-12培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h觀察記錄1次細胞病變情況，72 h后收獲病毒液，反復(fù)凍融3次，離心去除細胞碎片后接種于新的LMH細胞。如此重復(fù)，在LMH細胞上連續(xù)傳至F3代，收獲病毒液，-80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒毒價測定取上述F3代細胞病毒液用無血清DME/F-12培養(yǎng)基連續(xù)進行10倍倍比稀釋(10-1～10-10)。取24 h左右長滿單層LMH細胞的96孔細胞培養(yǎng)板，棄去原培養(yǎng)基，各稀釋度分別接種8孔，每孔加入100 μL稀釋好的病毒液，同時設(shè)置細胞對照孔。最后，每孔再加入100 μL含2%胎牛血清的DME/F-12培養(yǎng)基，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。連續(xù)觀察7 d，逐日記錄細胞病變孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

1.5 FAdV-4 WZ株對SPF雞和SPF鴨的致病性取28日齡SPF雞和SPF鴨各20只，分別隨機分為攻毒組和對照組，10只/組，攻毒組胸部肌肉注射1 mL 含107.8TCID50的FAdV-4 WZ株F3代病毒液，對照組胸部肌肉注射1 mL PBS，各組均分開飼養(yǎng)，攻毒后連續(xù)14 d，每天稱體質(zhì)量、記錄發(fā)病和死亡情況。死亡雞只和鴨立即剖檢，觀察大體病變。

1.6 樣品采集攻毒后1～14 d，隨機抽取攻毒組和對照組各5只SPF雞和SPF鴨，分別采集泄殖腔拭子。采集攻毒后病死雞、鴨和攻毒后14 d未死亡雞、鴨的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織樣品，部分樣品于室溫下用4%甲醛溶液固定，剩余樣品于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 病毒DNA提取和熒光定量PCR將1.6中-80℃ 保存的組織樣品用PBS勻漿，4 000×g離心10 min，吸取組織上清；將1.6中采集的泄殖腔拭子分別用1 mL PBS于4℃浸泡1 h，8 000×g離心10 min，吸取上清液。根據(jù)說明書方法提取DNA。

參照文獻[10]建立的FAdV-4 TaqMan實時熒光定量PCR方法，使用正向引物：5′-TCAGCAGGCCATCCAAC-3′，反向引物：5′-TGTCGAACA-CGCCATAGAG-3′，TaqMan探針：5′-FAM-ACCTGTGGACCATCCCGTTCAGT-TAMRA-3′。反應(yīng)體系：2×Premix Ex Taq 10 μL，正、反向引物各0.4 μL，探針0.8 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃延伸20 s，共40個循環(huán)。測定SPF雞和SPF鴨心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織樣品和泄殖腔拭子中FAdV-4的病毒載量，每個樣品一式3份，進行熒光PCR方法鑒定。

1.8 組織病理學觀察取1.6中固定的組織樣品，進行常規(guī)處理，包埋于石蠟中，切成5 μm左右的薄片，經(jīng)蘇木精和伊紅(HE)染色后使用光學顯微鏡觀察各組織病理學變化。

2 結(jié)果

2.1 F3代FAdV-4 WZ株可致LMH細胞穩(wěn)定病變F3代FAdV-4 WZ株接種后24 h即可觀察到LMH細胞皺縮變圓，折光性增強；接種后48 h可見細胞聚集成團狀，似葡萄串，部分細胞崩解死亡(圖1)；接種后72 h約95%的細胞脫落崩解。

A.．正常LMH細胞；B．接種后48 h LMH細胞

2.2 病毒毒價測定結(jié)果FAdV-4 WZ株經(jīng)梯度稀釋接種于LMH細胞，連續(xù)觀察7 d，根據(jù)Reed-Muench法計算，F(xiàn)3代WZ株的TCID50為10-7.8/0.1 mL。

2.3 SPF雞接種FAdV-4 WZ株后的臨床癥狀和大體病變攻毒組SPF雞在攻毒后1 d發(fā)病2只，死亡0只；攻毒后2 d全部發(fā)病，表現(xiàn)精神沉郁、羽毛蓬松、嗜睡、采食量減少和拉黃綠色稀便，并死亡8只；攻毒后3 d全部發(fā)病死亡(圖2A)。攻毒后攻毒組體質(zhì)量明顯降低，與對照組SPF雞相比差異顯著(P<0.05)(圖2B)。死亡雞只剖檢可見：心包內(nèi)積有大量的水樣或果凍樣淡黃色滲出液，肝臟腫脹發(fā)黃、出血、易碎，腎臟腫大、出血(圖3)。而注射PBS的對照組SPF雞生長健康良好。

2.4 SPF鴨接種FAdV-4 WZ株后的臨床癥狀和大體病變以同樣劑量肌肉接種SPF鴨，攻毒后1～14 d，與注射PBS的10只對照組SPF鴨一樣，攻毒組10只鴨精神、采食、糞便均正常，未表現(xiàn)出任何臨床異常；體質(zhì)量與對照組SPF鴨相比差異不顯著(P>0.05)；剖檢也均未見病變(圖2C，D,圖4)。

A、B.分別為SPF雞的存活和體質(zhì)量曲線；C、D.分別為SPF鴨的存活和體質(zhì)量曲線 *表示攻毒組與對照組SPF雞的體質(zhì)量差異顯著(P<0.05)

A.、B．攻毒組SPF雞的心臟、肝臟和腎臟；C、D．對照組SPF雞的心臟、肝臟和腎臟

A.、B．攻毒組SPF鴨的心臟、肝臟和腎臟；C、D．對照組SPF鴨的心臟、肝臟和腎臟

2.5 攻毒后SPF雞和SPF鴨內(nèi)臟組織病理學分析攻毒組SPF雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和胸腺組織切片經(jīng)HE染色可觀察到明顯的組織病理學損傷(圖5)。心臟內(nèi)可見心肌細胞周圍間質(zhì)性水腫、細胞間隙增大、中性粒細胞和單核細胞輕度浸潤(圖5A)；肝實質(zhì)細胞核內(nèi)出現(xiàn)嗜堿性包涵體、間質(zhì)出血、肝細胞核溶解壞死(圖5B)；脾臟間質(zhì)廣泛出血、淋巴細胞數(shù)量減少(圖5C)；肺部嚴重充血、終末細支氣管擴張(圖5D)；腎間質(zhì)大范圍充血、腎小管上皮細胞從基底膜脫落壞死、淋巴細胞浸潤(圖5E)；胸腺內(nèi)淋巴細胞大量減少、局部壞死(圖5F)。

A.心臟，間質(zhì)性水腫、淋巴細胞浸潤(100×)；B.肝臟，出血、核內(nèi)嗜堿性包涵體(400×)；C.脾臟，淋巴細胞數(shù)量減少、廣泛出血(100×)；D.肺臟，嚴重充血(100×)；E.腎臟，間質(zhì)大范圍充血、腎小管上皮細胞從基底膜脫落壞死(100×)；F.胸腺，淋巴細胞大量減少、局部壞死(100×)

在攻毒組SPF鴨的內(nèi)臟組織中均未觀察到明顯的組織病理學損傷(圖6)。

A.～F.分別為攻毒組SPF鴨的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和胸腺組織

2.6 內(nèi)臟組織病毒載量測定通過建立的TaqMan熒光定量PCR方法，在攻毒組SPF雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊、胸腺、氣管、腺胃和小腸中均檢出FAdV-4。肝臟的病毒載量最高，為4.66×107拷貝/μL，其次為小腸、腎臟、肺臟、脾臟、胸腺、腺胃、氣管、法氏囊、心臟，且肝臟與其他組織的病毒載量相比差異極顯著(P<0.01)(圖7)。

**表示肝臟與其他組織的病毒載量差異極顯著(P<0.01)

而在采集的攻毒組SPF鴨內(nèi)臟組織中均未檢出FAdV-4。

2.7 泄殖腔排毒情況通過實時熒光定量PCR方法檢測攻毒后1～14 d各組泄殖腔拭子中的病毒載量。攻毒組SPF雞在攻毒后3 d內(nèi)均可檢測到排毒,且攻毒后2 d排毒量最高，為2.03×104拷貝/μL，對照組雞均未檢出FAdV-4排毒。攻毒3 d后攻毒組SPF雞全部死亡(圖8)。

圖8 攻毒組SPF雞泄殖腔拭子中FAdV-4的病毒載量

攻毒組SPF鴨在攻毒后1～14 d與對照組鴨結(jié)果相同，從拭子中均未檢出FAdV-4排毒。

3 討論

HHS是由FAdV-4引起的雞的一種急性傳染病，潛伏期為3～5 d，感染雞只突然發(fā)病，急性死亡且死亡率高，具有異常激進的臨床過程[11]。死亡雞只剖檢常見肝臟炎癥和嚴重的心包積液，通常認為感染雞大多死于心力衰竭[12]。2015年以來HHS在我國大范圍暴發(fā)，給我國家禽業(yè)健康發(fā)展造成了巨大威脅。近來，SHEN等[13]報道在鴨、鵝、鴛鴦和鴕鳥中分離鑒定出FAdV-4，并且呈現(xiàn)出與雞相似的臨床癥狀。CHEN等[14]研究表明從櫻桃谷鴨中分離的FAdV-4對25日齡左右的鴨具有高致病性。這些研究提示FAdV-4在不同動物種間存在跨物種傳播的可能性。于是，很多養(yǎng)鴨企業(yè)開始使用FAdV-4滅活疫苗或亞單位疫苗免疫鴨，以預(yù)防鴨感染FAdV-4，從而避免損失。雞屬于動物界脊索動物門鳥綱雞形目雉科，鴨屬于動物界脊索動物門鳥綱雁形目鴨科鴨亞科[15]。雞和鴨屬于不同目，不同科，不同種動物。通常一種動物易感的病原，另一種動物可能并不一定易感，這樣可以避免一種病原微生物同時對多種動物造成感染。例如，H5、H7亞型高致病性禽流感病毒，對雞具有高致病性，可以導(dǎo)致易感雞的發(fā)病率和病死率接近100%，而對鴨和鵝等則致病力較弱，盡管偶可感染，但較少導(dǎo)致發(fā)病和死亡[16]。

導(dǎo)致雞高病死率的FAdV-4強毒是否對鴨也具有同樣高的致病性，本研究選取28日齡的SPF雞和SPF鴨，選擇同樣的最佳攻毒途徑(肌肉注射)及高致死劑量，以評價當前流行的對雞呈現(xiàn)強毒力的FAdV-4對鴨的致病性和致死率等。結(jié)果顯示，雞源FAdV-4強毒W(wǎng)Z株可致攻毒組SPF雞發(fā)生嚴重的HHS，肝臟腫大，心包內(nèi)聚積有大量的淡黃色滲出液；攻毒后體質(zhì)量與對照組雞相比顯著降低(P<0.05)；攻毒后3 d感染雞只全部死亡。組織病理學觀察可見肝細胞核內(nèi)有嗜堿性包涵體，免疫器官脾臟和胸腺中淋巴細胞數(shù)量減少。攻毒后1 d即可在泄殖腔拭子中檢測到排毒，攻毒后2 d檢測到的排毒量最高，為2.03×104拷貝/μL。在攻毒組SPF雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊、胸腺、氣管、腺胃和小腸中均可檢出FAdV-4，其中，肝臟的病毒載量最高，為4.66×107拷貝/μL，表明FAdV-4可在雞多種組織中快速入侵和復(fù)制，且肝臟是其主要的靶器官，這與YU等[17]的研究報道一致。而同樣條件下，攻毒組SPF鴨在14 d的觀察期內(nèi)沒有出現(xiàn)臨床癥狀和死亡；體質(zhì)量持續(xù)上升，且與對照組鴨相比差異不顯著(P>0.05)；剖檢未見病變及組織病理學損傷；在其組織樣品和泄殖腔拭子中均未檢出FAdV-4。劉吉山等[18]報道鴨源FAdV-4可致30日齡雞只死亡50%，鴨源FAdV-4可能在鴨體內(nèi)多為缺乏臨床癥狀的隱性感染，但在雞體內(nèi)則可引起嚴重的HHS和死亡。本研究結(jié)果表明，對SPF雞具有強致病性且致死率高達100%的FAdV-4 WZ株，即使經(jīng)肌肉注射，鴨也不感染，不發(fā)病。

綜上所述，當前對我國養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重威脅的FAdV-4強毒株只感染雞不感染鴨；在鴨群接種來源于雞的FAdV-4流行毒株的滅活疫苗和亞單位疫苗預(yù)防鴨感染FAdV-4，缺乏完整的病原學和血清學等流行病學依據(jù)。對雞呈現(xiàn)強毒力的FAdV-4毒株對鴨無致病性的內(nèi)在機制，尚需進一步研究。