BVDV Erns抗體ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用

劉勃興，劉 暢，王利麗，付 祥，吳同壘，劉 潔，高榮菊，張志強*，史秋梅*

(1.河北科技師范學院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學重點實驗室，河北 秦皇島 066004；2.河北省唐山市樂亭縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 唐山 063600)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)屬于黃病毒科瘟病毒屬單股RNA囊膜病毒[1-3]。我國BVDV最早發(fā)現(xiàn)于1980年[4]，給我國肉牛和奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。DIAO等[5]對1987—2019年國內(nèi)牛群中的BVDV進行了Meta分析，發(fā)現(xiàn)我國牛群BVDV的感染率約為36.0%，其中，新疆地區(qū)BVDV感染率(67.5%)最高，西北地區(qū)樣品中BVDV抗原陽性率最高。BVDV感染牛臨床可出現(xiàn)消化道、呼吸道、生長繁殖異常等癥狀，病情嚴重時可導(dǎo)致病牛死亡，還可以造成無任何示病癥狀但危害更大的持續(xù)感染(persistently infected，PI)，據(jù)估計，70%～90%的BVDV感染病例無臨床表現(xiàn)[6-8]。

BVDV的檢測方法大致可分為病原學檢測和血清學檢測兩類，其中BVDV抗體血清學檢測可輔助抗原檢測，有助于牛群中PI鑒定和評估接種疫苗牛群的免疫接種效果。目前BVDV的血清學檢測方法有ELISA、抗體中和試驗和瓊脂擴散試驗等，其中ELISA是世界動物衛(wèi)生組織推薦的BVDV檢測方法之一，也是在實驗室診斷中的常用方法。我國BVDV抗體ELISA商品化檢測試劑盒的品牌和種類較少，導(dǎo)致BVDV抗體檢測成本較高。國內(nèi)對BVDV抗體ELISA檢測方法已開展了大量的研究，其中基于BVDV結(jié)構(gòu)蛋白E2[9-14]、Erns(E0)[9,15-17]這兩種囊膜蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白NS3[9,17]蛋白建立的間接ELISA方法居多，此外，抗BVDV納米抗體雙抗夾心ELISA[18]、PPA-ELISA[19]、Dot-ELISA[20]等ELISA類型也應(yīng)用于BVDV的抗體檢測。

為了解河北地區(qū)牛群BVDV抗體陽性率，本研究構(gòu)建了BVDV HB-1株的Erns蛋白(gp48基因)的原核表達載體，并經(jīng)原核系統(tǒng)表達了Erns蛋白，以該蛋白為包被抗原建立BVDV抗體間接ELISA檢測方法，并應(yīng)用該方法檢測河北地區(qū)牛血清樣品的BVDV抗體陽性率。

1 材料與方法

1.1 病毒株、質(zhì)粒和血清BVDV HB-1株，分離自河北肉犢牛腹瀉樣品，由本研究室保存；pET-28a質(zhì)粒、BVDV陽性血清和陰性血清、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)陽性血清、牛布魯菌陽性血清、牛輪狀病毒(BRV)陽性血清、牛冠狀病毒(BCoV)陽性血清、口蹄疫病毒(FMDV)陽性血清均由河北省預(yù)防重點實驗室提供。

1.2 引物的設(shè)計與合成根據(jù)BVDV HB-1株的Erns蛋白基因(gp48)序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計用于Erns蛋白基因(gp48)擴增的引物。E-BamHⅠ：5′-CGGGATCCGAGAACATAACGCA-ATGGAACTTGC-3′；E-SalⅠ：5′-GCGTCGACTGCATATGCCCCAAACCATGTC-3′。

1.3 主要試劑病毒RNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊科技有限公司；SalⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；明膠、牛血清白蛋白 BSA-V、IPTG、羊抗小鼠IgG-HRP購自北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE Gel Kit、eECL Western blot Kit、His-Taggde Protein Purification Kit購自北京康為世紀(CWBIO)生物科技有限公司；兔抗牛IgG/HRP血清、鼠抗His tag antibody購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini KitⅠ購自美國OMEGA公司；BVDV ELISA抗體檢測試劑盒購自愛德士(IDEXX)瑞士生物科技有限公司

1.4 Erns(gp48)基因的PCR擴增、序列分析及原核表達載體構(gòu)建與鑒定用病毒RNA快速提取試劑盒提取感染BVDV HB-1的MDBK細胞培養(yǎng)物中的病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，用合成gp48擴增引物進行PCR并回收純化。將目的基因克隆至pMD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-gp48，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落用gp48基因擴增引物進行PCR檢測，陽性菌落送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。從NCBI下載BVDV參考株的Erns基因序列并用Lasergene.v7.1中Editseq軟件翻譯為氨基酸序列，用Megalign軟件進行同源性比對并建立發(fā)育進化樹。在確認獲得的gp48序列無移碼突變后，將pET-28a和pMD19-T-gp48質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，回收目的片段構(gòu)建pET-28a-gp48重組載體，轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，挑取單菌落進行雙酶切與測序鑒定。

1.5 重組Erns蛋白的原核表達、純化及Western blot鑒定將pET-28a-gp48/BL21接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基在37℃恒溫搖床培養(yǎng)至D600 nm值為0.4～0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)6 h，離心收集菌液，用PBS重懸菌泥超聲破碎，收集上清和沉淀，用SDS-PAGE鑒定重組蛋白的表達形式并用His-Taggde Protein Purification Kit純化蛋白。以鼠抗His tag antibody(1∶1 000)為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP血清(1∶5 000)為二抗，Western blot鑒定重組蛋白。

1.6 BVDV抗體間接ELISA檢測方法的建立及優(yōu)化采用方陣滴定法確定。蛋白包被質(zhì)量濃度分別為每孔包被20，40，80，160，320 ng，血清按照1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400進行稀釋?；谏鲜龅淖罴褩l件，分別進行包被條件(37℃包被0.5，1.0，1.5，2.0 h，4℃包被過夜)、封閉液(5%脫脂奶、2% BSA和1%明膠)、封閉時間(37℃封閉0.5，1.0，1.5，2.0 h)、血清孵育時間(37℃孵育0.5，1.0，1.5，2.0 h)、二抗稀釋度(1∶5 000，1∶10 000，1∶20 000，1∶40 000，1∶80 000)、二抗孵育時間(37℃孵育0.5，1.0，1.5，2.0 h)和顯色時間(37℃顯色5，10，15，20 min)的條件優(yōu)化。

1.10 重復(fù)性試驗分別驗證建立的ELISA方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性。批內(nèi)重復(fù)性試驗：分別用同批次的重組Erns蛋白包被并封閉后的ELISA板檢測4份BVDV陽性和4份BVDV陰性的牛血清；批間重復(fù)性試驗：分別用重組Erns蛋白包被并封閉后1，14，28 d的ELISA板檢測BVDV陽性和BVDV陰性的牛血清。每個血清做3個平行孔，測定D450 nm值，計算不同批次內(nèi)的變異系數(shù)(CV)，評估本研究建立的ELISA方法的批間重復(fù)效果。

1.11 與商品化試劑盒比較試驗以建立的間接ELISA方法和IDEXX BVDV的ELISA抗體檢測試劑盒同時檢測河北某牛場的90份牛血清，比較2種方法檢測結(jié)果并計算符合率，計算方法見表1。

表1 符合率計算方法

1.12 臨床樣品的檢測用本研究建立的間接ELISA方法檢測河北地區(qū)牛場的血清樣品477份，統(tǒng)計并分析牛血清樣品的陽性率。

2 結(jié)果

2.1 Erns(gp48)基因的PCR擴增、序列分析及原核表達載體構(gòu)建與鑒定以提取的BVDV HB-1株感染細胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增gp48基因。結(jié)果顯示，在681 bp出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1A)。序列測定與比對分析結(jié)果顯示，BVDV HB-1株與NCBI數(shù)據(jù)庫國內(nèi)的BVDV-1型參考株的Erns氨基酸序列同源率為96.0%～99.1%，與國外BVDV-1型的Erns氨基酸序列同源率為92.4%～95.6%，與國內(nèi)外BVDV-2型的參考株Erns氨基酸序列同源率為79.1%～81.3%。進化樹分析結(jié)果顯示，BVDV HB-1株Erns氨基酸序列與國內(nèi)的BVDV-1型的Erns氨基酸序列屬于同一個大分支，且與相應(yīng)參考株距離較近，其次距離較近的BVDV株為國外的BVDV-1型參考株，而國內(nèi)外3株BVDV-2型的參考株處于另一個大分支且距離最遠(圖2)。序列分析結(jié)果表明，BVDV HB-1株Erns氨基酸序列與國內(nèi)基因1型BVDV的同源性較高，具有作為診斷試劑研發(fā)實驗材料的潛力。

M1.DL2000 DNA Marker;M2.DL5000 DNA Marker ;1.gp48 基因;2.陰性對照；3.pET-28a-gp48經(jīng) BamHⅠ/SalⅠ酶切產(chǎn)物;4.pET-28a

紅色代表本研究BVDV毒株；藍色代表國外BVDV毒株

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-gp48經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，得到約681 bp的基因片段和約5 300 bp的質(zhì)粒片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1B)。測序結(jié)果顯示，基因序列無移碼、突變，表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-gp48。

2.2 重組Erns蛋白的原核表達、純化及Western blot鑒定將pET-28a-gp48重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后用SDS-PAGE鑒定。結(jié)果顯示，在約33 kDa處有目的蛋白條帶，與預(yù)期蛋白大小一致，重組Erns蛋白以包涵體形式表達(圖3A)。用His-Taggde Protein Purification Kit純化蛋白，結(jié)果顯示，純化后僅在33 kDa出現(xiàn)目的條帶，無雜帶(圖3B)。Western blot鑒定結(jié)果顯示，在33 kDa處出現(xiàn)目的條帶(圖3C),表明成功獲得重組Erns蛋白，且試劑盒純化蛋白效果較好。

M.蛋白Marker;1.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后菌體裂解物;2.菌體裂解物上清;3.菌體裂解物沉淀;4.陰性對照;5.純化前的Erns 蛋白;6.純化后的Erns 蛋白；7.陰性對照;8.重組 Erns

2.3 BVDV抗體間接ELISA檢測方法的建立及優(yōu)化以重組的Erns蛋白作為包被抗原建立的BVDV抗體間接ELISA檢測方法經(jīng)條件優(yōu)化試驗，最終確定的Erns蛋白包被、封閉、血清、二抗(兔抗牛IgG/HRP血清)及顯色條件見表2。

表2 BVDV抗體間接ELISA檢測方法反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.4 臨界值的確定用優(yōu)化后的間接ELISA方法檢測臨床30份BVDV陰性血清，結(jié)果顯示，30份陰性血清D450 nm呈正態(tài)分布，經(jīng)計算臨界值為0.326，即待檢血清D450 nm高于0.326判定為陽性，D450 nm低于0.326判定為陰性(圖4)。

圖4 30份陰性血清D450 nm的正態(tài)分布圖

2.5 特異性試驗特異性試驗結(jié)果顯示，除BVDV陽性血清樣品(D450 nm=1.204)檢測結(jié)果為陽性，其余病原陽性血清檢測結(jié)果(D450 nm<0.326)均為陰性(圖5),表明本研究建立的間接ELISA抗體檢測方法具有較強特異性，能特異性檢測出BVDV陽性血清。

圖5 特異性試驗結(jié)果

2.6 敏感性試驗用建立間接ELISA方法分別檢測不同稀釋度的BVDV陽性血清。結(jié)果顯示，經(jīng)1∶1 600稀釋BVDV陽性血清后檢測結(jié)果仍為陽性(圖6)，表明本研究建立的間接ELISA抗體檢測方法具有較高的敏感性。

圖6 敏感性試驗結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗用4份BVDV陽性血清和4份BVDV陰性血清分別進行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗。結(jié)果顯示，8份血清檢測數(shù)據(jù)的批內(nèi)CV為1.88%～9.61%，批間CV為0.82%～9.36%，重復(fù)性試驗的CV均低于10%(表3)，表明本研究建立的間接ELISA抗體檢測方法具有較好的重復(fù)性。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果(n=8) D450 nm

2.8 與商品化試劑盒比較試驗分別用建立的間接ELISA方法和IDEXX BVDV 的ELISA抗體檢測試劑盒對河北某牛場的90份牛血清進行檢測。結(jié)果顯示,IDEXX試劑盒檢出陽性樣品72份，陰性樣品18份，本研究建立的方法檢出陽性樣品72份，陰性樣品18份。2種方法的總符合率為93.33%，陽性符合率92.00%，陰性符合率71.43%(表4)。結(jié)果表明，本研究建立的方法與IDEXX試劑盒符合率較高，具有較高的準確性。

表4 與商品化試劑盒比較結(jié)果

2.9 臨床樣品的檢測結(jié)果應(yīng)用建立的間接ELISA方法檢測河北地區(qū)牛場的血清樣品。結(jié)果顯示，接種BVDV疫苗免疫牛場的牛血清樣品BVDV抗體檢測陽性率為30.43%～92.86%，而未接種BVDV疫苗免疫牛場的牛血清樣品BVDV抗體檢測陽性率為0%～100%(表5)，表明建立的BVDV抗體ELISA檢測方法能應(yīng)用于臨床樣品檢測。在接種疫苗免疫的牛場BVDV抗體陽性率明顯高于未接種疫苗免疫的牛場，未接種BVDV疫苗免疫的牛場檢測出BVDV抗體陽性血清，表明存在BVDV感染。

表5 臨床樣品檢測結(jié)果(n=477)

3 討論

BVDV-1b基因型是全球檢出率最高的BVDV基因型，在我國，該基因型也是BVDV主要流行的基因型之一，因此，該基因型常作為疫苗和診斷試劑的試驗株。Erns是BVDV的囊膜蛋白之一，在病毒吸附宿主細胞、抑制宿主IFN的產(chǎn)生等方面有著重要的作用[21]。更重要的是，Erns可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體，據(jù)報道，在PI動物的血清中Erns抗體質(zhì)量濃度可高達50 μg/L[22]。因此，Erns是BVDV疫苗和診斷試驗研制的靶位蛋白之一。本試驗BVDV HB-1株分離自河北肉犢牛腹瀉樣品，基因型為我國主要流行的基因型BVDV-1b，具有作為診斷試劑研發(fā)的潛力。進一步對HB-1株的Erns氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)BVDV HB-1株的Erns氨基酸序列與NCBI上國內(nèi)BVDV-1型的參考株同源率為96.0%～99.1%，同源性極高，可作為BVDV抗體ELISA檢測方法的包被抗原。因此，本研究構(gòu)建了pET-28a-gp48，在BL21(DE3)感受態(tài)細胞進行原核表達，成功獲得了重組Erns蛋白。

本研究以重組Erns蛋白作為包被抗原建立BVDV抗體間接ELISA檢測方法。經(jīng)條件優(yōu)化試驗，最終確定ELISA反應(yīng)條件：重組Erns包被質(zhì)量濃度為40 ng/孔，包被溫度和時間為4℃過夜；封閉液為1%明膠溶液，封閉時間為2 h(37℃)；血清稀釋倍數(shù)為100倍，血清孵育時間為1 h(37℃)；二抗稀釋倍數(shù)為40 000倍，二抗孵育時間為0.5 h(37℃)；顯色時間為10 min(37℃)；臨界值為0.326(D450 nm)。進一步對該方法的特異性、靈敏度和重復(fù)性進行驗證，結(jié)果顯示：該方法能特異性識別BVDV陽性血清和陰性血清，而對BRV、IBRV、FMDV、BCoV、牛布魯菌共計5種在牛常見的細菌和病毒性病原陽性血清檢測結(jié)果均為陰性，表明該方法具有較好的特異性；當血清經(jīng)1∶1 600稀釋后結(jié)果仍為陽性，表明該方法具有較高的靈敏度；批內(nèi)和批間重復(fù)試驗的CV均低于10%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。用IDEXX的BVDV抗體檢測試劑盒與本研究中建立的方法同時檢測某牛場的血清樣品，2種方法的總符合率為93.33%，陽性符合率92.00%，陰性符合率71.43%。在國內(nèi)同樣基于Erns蛋白建立的BVDV抗體ELISA檢測方法中，本研究建立的方法敏感性與肖盛中等[15]和丁金花等[16]建立方法的敏感性(1∶1 600)相同，比陳瑞紅[9]建立方法的靈敏度(1∶640)高；重復(fù)性上，本研究和研究報道[9，15-16]的重復(fù)性數(shù)據(jù)相似，批內(nèi)和批間CV均小于10%；與其他方法進行符合試驗，本研究(93.33%)高于肖盛中等[15](86%)、丁金花等[16](88.67%)、陳瑞紅[9](88.1%)建立的方法。但陰性符合率(71.43%)偏低，與陰性樣品數(shù)量少有關(guān)。

應(yīng)用建立的間接ELISA方法初步對河北地區(qū)18個牛場的477份血清樣品進行檢測。其中，18個牛場中有4個奶牛場，且均接種了BVDV滅活疫苗(占比100%，4/4)，而僅有2家肉牛場接種疫苗(占比11.76%，2/14)。在接種疫苗的牛場中，抗體陽性率為30.43% ～ 92.86%，表明在接種疫苗的牛場中，BVDV抗體陽性率和抗體水平存有不同，部分牛場的抗體陽性率低于50%，需及時補免。BVDV滅活疫苗在我國上市時間較短，應(yīng)用的范圍較小，但奶牛場對該病的預(yù)防接種意識明顯高于肉牛場。在未接種疫苗的14個肉牛場中，陽性血清占比明顯低于接種免疫后的牛場，其中6個肉牛場的陽性血清占比為0%，僅有1個承德肉牛場的陽性血清占比達100%，其余陽性血清占比均低于50%。在未接種BVDV疫苗的牛場中檢測到BVDV抗體，表明該場可能存在感染BVDV或PI牛，應(yīng)結(jié)合RT-PCR等檢測方法進一步確認這些牛場的肉牛是否存在BVDV感染。