PCV3自然感染仔豬病例的病理學觀察及體內(nèi)分布

呂志凱，張偉超，陳永林，孫秀秀，王 庚，涂 軍，錢 平，程國富，陳 品*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，湖北 武漢 430070；2.廣西揚翔股份有限公司，廣西 貴港 537100)

2016年，PALINSKI等[1]收集患有皮炎腎病綜合征的母豬及流產(chǎn)胎兒的組織病料進行qPCR和IHC檢測，結(jié)果顯示豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)陰性，通過宏基因組測序及遺傳進化樹分析，發(fā)現(xiàn)了一種未知的圓環(huán)病毒，將其命名為豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)[2]。美國首次報道PCV3后，世界范圍內(nèi)隨即也陸續(xù)檢測并報道發(fā)現(xiàn)PCV3的存在,包括韓國、波蘭、意大利、巴西、俄羅斯、西班牙和瑞典[3-4]。2016-2017年，我國南方地區(qū)尤其是廣東省大量豬場的仔豬出現(xiàn)先天性震顫導致站立和行走困難，仔豬死亡率高，徐國等[5]通過對死亡仔豬的組織樣本檢測，發(fā)現(xiàn)PCV3在我國已經(jīng)存在。PCV3與PCV2引起的臨床癥狀相似，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[6-7]。本研究旨在通過揭示PCV3在感染豬組織器官中的分布規(guī)律及其對豬體組織產(chǎn)生的病理損傷變化，為后續(xù)深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑鼠抗PCV3單克隆抗體由揚州大學預防獸醫(yī)系高崧教授饋贈；山羊抗鼠源/家兔源二抗抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB顯色粉劑購自博士德生物工程有限公司。

1.2 樣品來源及收集樣品采自廣西貴港動物疫病凈化示范區(qū)內(nèi)的部分規(guī)?；i場。從剖檢的病、死豬中篩選出豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)及PCV2五種病原RT-PCR檢測陰性且PCV3 RT-PCR檢測陽性的16頭病、死豬作為研究對象；另挑選PPV、PRV、CSFV、PRRSV、PCV2及PCV3 RT-PCR檢測均為陰性的4頭健康豬作對照組。每頭病豬采集大腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、腸(十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸)、扁桃體、腎上腺、胰腺及淋巴結(jié)(肺門淋巴結(jié)、下頜淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淺淋巴結(jié)、腘淋巴結(jié)、膝前淋巴結(jié))、皮膚等23個組織的病變部位經(jīng)4%多聚甲醛固定后常規(guī)制作石蠟切片。

1.3 大體病變記錄及樣品處理檢查并詳細記錄病、死豬的體表特征及各組織器官的質(zhì)地、顏色和病變情況。

1.4 常規(guī)石蠟切片制作及HE染色將固定好的組織進行二次取材，然后將組織放入包埋框中并暫在10%福爾馬林溶液中保存。將以上組織放入全自動脫水機中，進行常規(guī)酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟，包埋完成后，制成3 μm厚的石蠟切片，然后使用全自動染色機進行HE染色。

1.5 免疫組織化學染色對石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)過3%過氧化氫避光阻斷、微波修復、正常濃度山羊血清封閉、一抗(工作濃度為1∶800)4℃孵育過夜、二抗(工作濃度為1∶1)室溫孵育、DAB避光顯色、蘇木素襯染、鹽酸分化和甘油明膠封片等過程，最后在光學顯微鏡下觀察并制圖分析。

2 結(jié)果

2.1 PCV3病原學檢測結(jié)果排除豬場幾種主要病毒病的混合感染后，篩選出PCV3單獨感染的病、死豬16頭，具體檢測結(jié)果見表1。

表1 PCV3的qPCR檢測結(jié)果

2.2 臨床癥狀及剖檢變化PCV3感染豬初期消化功能降低出現(xiàn)食欲不振到被毛粗亂無光澤(圖1A)；大腦外觀腫脹變大、腦膜下彌漫性出血；心臟冠狀溝膠凍樣水腫塊附著(圖1B)，個別病例心包液內(nèi)有纖維蛋白索狀物；肺臟膨大，心葉、尖葉及膈葉間質(zhì)增寬、水腫，個別病例可見肺表面島嶼樣實變區(qū)；肝臟腫大，表面時有大小不等灰白色散在病灶；胃腸不同程度的卡他性胃腸炎，雞腸樣變化；腎臟不同程度的腫大，色彩多樣構(gòu)成花斑狀外觀(圖1C)；腎上腺腫大，壞死灶出現(xiàn)在皮質(zhì)部；全身淋巴結(jié)不同程度腫大，外觀呈灰白色或深淺不一的暗紅色；脾臟腫大，邊緣有丘狀突起以及出血性梗死灶；扁桃體表面黏液附著，有針尖狀出血點，顏色變暗。

A.PCV3感染豬被毛粗亂；B.PCV3感染豬心臟冠狀溝膠凍樣水腫；C.PCV3感染豬腎臟點狀出血，色澤變淡；D.PCV3感染豬淋巴結(jié)腫大，呈灰白色或暗紅色

2.3 組織病理學觀察心臟：心肌纖維腫脹、纖維間輕微出血，溶解斷裂；肝臟：中央靜脈及肝竇內(nèi)淤血嚴重，肝索排列紊亂(圖2A)；脾臟：脾小結(jié)和動脈淋巴鞘結(jié)構(gòu)不清晰甚至數(shù)量減少，淋巴細胞溶解消失，壞死區(qū)出現(xiàn)單個或多個組織細胞團塊；肺：間質(zhì)性肺炎，支氣管上皮細胞壞死脫落，散在管腔內(nèi)，炎性細胞如淋巴細胞、巨噬細胞浸潤，大量淋巴細胞及巨噬細胞填充其中(圖2B)；腎臟：腎臟皮質(zhì)部小動脈充血，毛細血管及腎小管間淋巴細胞浸潤；扁桃體：淋巴小結(jié)萎縮數(shù)量減少，生發(fā)中心及淋巴帽中淋巴細胞不同程度的變性壞死，淋巴細胞數(shù)量減少明顯，巨噬細胞出現(xiàn)；食管：黏膜下層淋巴細胞和巨噬細胞浸潤，淋巴濾泡增生，偶見中性粒細胞(圖2D)；淋巴結(jié)：淋巴結(jié)副皮質(zhì)區(qū)及淋巴竇增寬，巨噬細胞浸潤其間；生發(fā)中心淋巴細胞核破碎、壞死，網(wǎng)狀細胞及巨噬細胞增多，個別病例淋巴結(jié)毛細血管淤血(圖2C)；胃：固有層腺體周圍毛細血管擴張，充血，淋巴細胞、巨噬細胞及中性粒細胞浸潤；十二指腸、空腸及直腸：固有層增寬，巨噬細胞、中性粒細胞浸潤；回腸：Peyer's Patch增生明顯，生發(fā)中心大量網(wǎng)狀細胞成團狀代替淋巴細胞，淋巴細胞凝固、破碎，巨噬細胞出現(xiàn)；盲腸、結(jié)腸：固有層淋巴濾泡增生，炎性細胞團塊樣存在，可見少量淋巴細胞，巨噬細胞及中性粒細胞增多、浸潤；胰腺：小葉間隙輕微充盈變寬，導管及腺細胞間質(zhì)內(nèi)巨噬細胞浸潤；腎上腺：血竇內(nèi)大量淤血，束狀帶、網(wǎng)狀帶間隙內(nèi)血細胞、巨噬細胞及淋巴細胞浸潤；腦：腦膜水腫、脫離，腦膜下毛細血管充血、淤血，少量膠質(zhì)細胞包繞神經(jīng)細胞周圍，毛細血管周圍淋巴細胞、巨噬細胞浸潤；皮膚真皮層毛細血管淤血，汗腺周圍嗜酸粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞浸潤。

A.肝臟中央靜脈、肝竇淤血，肝細胞顆粒變性，肝竇內(nèi)出現(xiàn)少量巨噬細胞、淋巴細胞；B.肺毛細血管充血，肺泡上皮細胞脫落，結(jié)締組織增生；C.淋巴結(jié)淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)模糊，淋巴細胞減少，網(wǎng)狀組織填充壞死區(qū)；D.食管黏膜下層淋巴濾泡增生，淋巴細胞及巨噬細胞浸潤

2.4 PCV3在感染豬組織中的分布PCV3感染豬組織切片免疫組化染色結(jié)果顯示，PCV3陽性信號出現(xiàn)在淋巴細胞和巨噬細胞的細胞質(zhì)中，少量陽性信號出現(xiàn)在感染細胞的細胞核中，對照組無陽性信號(圖3)。

A.對照組：以PBS代替一抗復染扁桃體組織切片，DAB顯色未見陽性信號；B.對照組：以PBS代替一抗復染淋巴結(jié)組織切片，DAB顯色未見陽性信號；C.扁桃體：PCV3陽性信號位于上皮細胞及淋巴小結(jié)內(nèi)巨噬細胞及單核細胞胞質(zhì)中；D.淋巴結(jié)：PCV3陽性信號出現(xiàn)在淋巴小結(jié)及彌散淋巴組織的淋巴細胞及巨噬細胞中

3 討論

在本試驗中，豬感染PCV3后，最初表現(xiàn)消化功能低下，繼而食欲不振、被毛粗亂同時伴發(fā)呼吸系統(tǒng)癥狀，隨著病程進一步加深，病豬生長停滯，淺表淋巴結(jié)腫大，混合其他病原感染后，出現(xiàn)發(fā)燒死亡，與研究報道結(jié)果一致[1,8]。采用免疫組化方法檢測PCV3在豬體內(nèi)的分布，發(fā)現(xiàn)PCV3陽性信號主要出現(xiàn)感染細胞的胞質(zhì)中，有少量出現(xiàn)在感染細胞的細胞核中，結(jié)果與PALINSKI等[1]采用免疫組化檢測PCV3的結(jié)果相符合。PCV2的主要靶細胞和PCV3一樣，主要是淋巴細胞及巨噬細胞，因此感染豬的免疫器官病變明顯，扁桃體、淋巴結(jié)及脾臟中淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)模糊，淋巴細胞減少，生發(fā)中心網(wǎng)狀細胞、巨噬細胞浸潤[9-10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，PCV3可單獨引發(fā)病豬表現(xiàn)PMWS癥狀，鏡下也呈現(xiàn)相應的病理特征，且PMWS癥狀的嚴重程度與感染豬的年齡、飼養(yǎng)管理及有無其他病原混合感染有關。有研究認為，PCV2不能單獨引發(fā)PMWS，接種PCV2不能復制出PMWS的癥狀[11]。KRAKOWKA等[12]將PCV2細胞培養(yǎng)物經(jīng)口鼻接種未吃初乳的1日齡仔豬，26 d后剖檢時發(fā)現(xiàn)豬腸系膜淋巴結(jié)中度腫大，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)生發(fā)中心網(wǎng)狀細胞成團出現(xiàn)。ROVIRA等[13]將PCV2細胞培養(yǎng)物經(jīng)皮下接種初生未飼喂初乳的仔豬對其引發(fā)的病理變化進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)仔豬無任何PMWS癥狀，顯微鏡下觀察并未發(fā)現(xiàn)實質(zhì)器官發(fā)生病變或炎癥。

PCV3感染豬各段腸管均有明顯的炎癥反應，這與唐寧等[14]的研究結(jié)果不同，將PCV2接種斷奶仔豬，胃及各段腸管均未見病變。PCV3感染豬胰腺及腎上腺可見淋巴及巨噬細胞浸潤，PCV2感染豬的胰腺及腎上腺未見病變[14-15]。此外研究結(jié)果顯示，肺泡上皮細胞及腎小管上皮細胞中均未檢測到PCV3陽性信號，與此不同的是PCV2除了感染單核細胞和巨噬細胞還可以感染肺泡上皮細胞及腎小管上皮細胞[16]。