不同品系絨山羊皮膚毛囊生長(zhǎng)發(fā)育周期中chi-miR-107-3p及其相關(guān)基因的表達(dá)分析

劉 斌 王立忠 吳鐵成，2 馬躍軍,3 趙若陽(yáng) 高玉林 閆新剛 李玉榮*

(1．內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，畜牧研究所，呼和浩特 010031；2.肉羊遺傳資源評(píng)價(jià)與繁育技術(shù)內(nèi)蒙古自治區(qū)工程實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010031；3．阿拉善白絨山羊種羊場(chǎng)，內(nèi)蒙古 阿拉善 750336；4.鄂爾多斯市立新實(shí)業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

絨山羊是重要的絨用經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其絨毛生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的季節(jié)性，但不同品種之間有很大的差異，大多數(shù)絨山羊在非長(zhǎng)絨期(5～7月)不長(zhǎng)絨，次級(jí)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育分為休止期(3～4月)、興盛前期(5～7月)、興盛期(8～12月)和退行期(1～2月)等4個(gè)階段，而有少數(shù)絨山羊可以常年長(zhǎng)絨(6月開(kāi)始長(zhǎng)絨)。內(nèi)蒙古白絨山羊是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期選育而形成的絨肉兼用型地方良種，分為巴彥淖爾市的二狼山型、鄂爾多斯市的阿爾巴斯型和阿拉善盟的阿拉善型三個(gè)類(lèi)群，具有季節(jié)性長(zhǎng)絨，羊絨細(xì)，纖維長(zhǎng)，光澤好，絨毛手感柔軟，綜合品質(zhì)優(yōu)良的特性。鄂爾多斯市伊金霍洛旗蘇布爾嘎培育的敏蓋絨山羊(未經(jīng)品種命名)，全舍飼養(yǎng)殖，具有常年長(zhǎng)絨、產(chǎn)絨量高等特點(diǎn)，成為當(dāng)?shù)啬撩裰饕酿B(yǎng)殖家畜。2016年“敏蓋”商標(biāo)被認(rèn)定為鄂爾多斯市知名商標(biāo)，2019年被國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局認(rèn)定為馳名商標(biāo)，因此暫命名為“敏蓋絨山羊”。絨山羊絨毛生長(zhǎng)受遺傳、營(yíng)養(yǎng)和光照、溫度等環(huán)境因素的影響，但遺傳占主要影響因素，從基因調(diào)控的方向研究皮膚毛囊生長(zhǎng)發(fā)育顯得尤為重要。miRNA是真核生物中存在的小分子非編碼RNA家族，具有抑制靶向mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯或者能夠剪切靶向mRNA并促進(jìn)其降解的功能。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研究報(bào)道m(xù)iRNA在毛囊形態(tài)發(fā)生、毛囊干細(xì)胞的增殖、分化和凋亡的穩(wěn)態(tài)平衡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Yuan等發(fā)現(xiàn)陜北絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊不同時(shí)期的皮膚毛囊miRNA表達(dá)存在特異性。Yuan等發(fā)現(xiàn)miR-22可以促進(jìn)毛囊退化，維持毛囊處于靜止期。馬濤發(fā)現(xiàn)miRNA-203在絨山羊毛囊發(fā)育的生長(zhǎng)期和休止期均有表達(dá)，且在休止期的表達(dá)量顯著高于生長(zhǎng)期，其候選靶基因的表達(dá)則相反。吳志紅通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot研究表明在胎兒皮膚成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞中，chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p 和 chi-miR-532-3p 在mRNA和蛋白水平上均可不同程度的調(diào)控WNT10A的表達(dá)。chi-miR-107-3p是一類(lèi)小分子RNA，Wu等通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)在薩能奶山羊睪丸組織中發(fā)現(xiàn)。Li等研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用納米載體(TLN)可使chi-miR-107-3p缺失，dicer表達(dá)上調(diào)，從而加速角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，從而促進(jìn)皮膚傷口的愈合。盡管有眾多的miRNA參與絨山羊皮膚毛囊周期性生長(zhǎng)過(guò)程，但鮮少有chi-miR-107-3p在不同品系間絨山羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的比較研究。本研究基于課題組前期對(duì)阿爾巴斯型絨山羊光控增絨處理組和對(duì)照組皮膚毛囊樣品進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果(相關(guān)數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，篩選到chi-miR-107-3p及其相關(guān)基因

ADCK5

、

DSBC1

、

ARSA

、

FMAP4

、

RHBDF2

和

ALDH3A2

，可能與絨山羊皮膚毛囊的周期性生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。因此，以絨毛生長(zhǎng)周期差異顯著的阿拉善型白絨山羊和敏蓋絨山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，應(yīng)用組織切片技術(shù)對(duì)不同品系絨山羊處于不同生長(zhǎng)周期毛囊結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，并通過(guò)qPCR方法對(duì)chi-miR-107-3p和相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行探究，旨在為絨毛生長(zhǎng)周期變化分子基礎(chǔ)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取內(nèi)蒙古阿拉善白絨山羊種羊場(chǎng)和鄂爾多斯敏蓋絨山羊羊場(chǎng)體重相近的2歲絨山羊母羊各3只，分別在1、4、7和9月采集體側(cè)部位直徑1 cm的皮膚2份，一份用4%多聚甲醛固定進(jìn)行組織切片制作，另一份快速保存于液氮罐中，用于qRT-PCR檢測(cè)。采樣前在取樣區(qū)域周?chē)は伦⑸?%利多卡因進(jìn)行局部麻醉，采樣過(guò)程符合動(dòng)物福利要求。

1.2 試劑及儀器設(shè)備

主要試劑：伊紅染液、蘇木素染液等購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；4%多聚甲醛、石蠟、TRIZOL、Tris堿、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、AL 2000、瓊脂糖、RNase-Free dd HO、氯仿、75%冰乙醇、2×Phanta Max Master Mix、1×TAE緩沖液；PrimeScript(TM) RT Master Mix (Perfect Real Time)、TB Green(TM) Premix Ex Taq(TM) II (RNaseH Plus)、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis和TB Green qRT-PCR User Manual等反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒等購(gòu)自TaKaRa。

主要儀器設(shè)備：LEICA RM2016切片機(jī)、梯度PCR儀(Eppendorf,德國(guó))、熒光定量PCR儀(CFX 96 Bio-Rad,美國(guó))、正倒置一體熒光顯微鏡。

1.3 試驗(yàn)方法

1

.

3

.

1

皮膚組織HE染色

將皮膚樣品在4%多聚甲醛中固定24 h后取出，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成7 μm的薄片，用常規(guī)HE染色方法染色，中性樹(shù)脂封片，干燥后觀察。由于皮膚在脫水透明過(guò)程中會(huì)發(fā)生收縮現(xiàn)象，因此在研究皮膚毛囊形態(tài)時(shí)需對(duì)皮膚收縮率進(jìn)行校正。

皮膚收縮率=脫水透明后皮膚面積/
活體樣皮膚面積×100%

表皮厚：真皮層到皮膚表面的垂直距離，μm；

真皮厚：皮下脂肪組織到表皮層的垂直距離，μm；

初、次級(jí)毛球?qū)挘河蔑@微鏡微測(cè)尺選擇不同視野10個(gè)完整的初、次級(jí)毛囊，測(cè)量其毛球的寬度，μm；

初、次級(jí)毛囊深：初、次級(jí)毛囊到表皮層的垂直距離，μm；

初、次級(jí)毛囊密度：利用顯微鏡微測(cè)尺選擇視野內(nèi)10個(gè)完整初、次級(jí)毛囊個(gè)數(shù)，再進(jìn)行換算為個(gè)/mm。

1

.

3

.

2

實(shí)時(shí)熒光定量法1.3.2.1 引物設(shè)計(jì) chi-miR-107-3p序列為AGCAGCAUUGUACAGGGCUAU，

U6

作為內(nèi)參基因。使用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)

RHBDF2

、

ADCK5

、

ARSA

、

ALDH3A2

、

DSBC1

和

FMAP4

基因熒光定量引物，選取

GAPDH

為內(nèi)參基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd.)合成(表1)。

表1 引物信息
Table 1 Primer information

基因名稱(chēng)Gene name登錄號(hào)Login number引物序列(5'→3')Primer sequence (5'→3')片段大小/bpProduct length退火溫度/℃Annealingtemperaturechi-miR-107-3pNC_030833.1AGCAGCATTGTACAGGGCTAT10656 ℃RHBDF2XM_018063741.1F: GTCCCAGAGCATCCGCAAGTR: TCCACGCCTCCCACAGAA13158 ℃ADCK5XM_018058741.1F: CGCTCCTCTTCCCTCCTTR: CCACCCATTCTGGCAACT14864 ℃ARSAXM_005701596.3F: AGAGCTTTCCAGGGCACTCAR: CATCGTCTCAGGTCCGTTGT15562 ℃ALDH3A2XM_018064739.1F: ATTTACTCCAGCCTGCCTACR: CAGCCAAGTGTCACCTCA12662 ℃DSBC1XM_005676701.3F: GCAGGCTCTGACCGAATCR: CTGGGCTGGTGACAAGGA8858 ℃FMAP4XM_018064747.1F: TCCACCTTTGACCGAGACCR: GTTGATGCCATTGGCGTAG14758 ℃U6NM_001161346.2F: GGAACGATACAGAGAAGATTAGCR: TGGAACGCTTCACGAATTTGCG6862 ℃GAPDHXM_005680968.3F: CCACGAGAAGTATAACAACACCR: GTCATAAGTCCCTCCACGAT12060 ℃

1.3.2.2 總RNA提取及cDNA合成 用液氮將皮膚樣品研磨后，使用TRIZOL提取總RNA，采用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)總RNA濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳和A/A檢測(cè)RNA質(zhì)量，保存于-80 ℃冰箱中備用。采用PrimeScript(TM) RT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒合成cDNA(mRNA)，采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis and TB Green qRT-PCR User Manual試劑盒合成cDNA(miRNA)，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>1.3.2.3 qRT-PCR檢測(cè) 利用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，以

GAPDH

基因?yàn)閮?nèi)參，對(duì)mRNA進(jìn)行熒光定量；以

U

6為內(nèi)參，對(duì)chi-miR-107-3p進(jìn)行熒光定量。反應(yīng)體系為T(mén)B Green(TM) Premix Ex Taq(TM) II (RNaseH Plus) 10 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，cDNA 1 μL，RNase-Free ddHO 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性2 min，(95 ℃ 變性10 s，62 ℃退火10 s，72 ℃延伸 20 s)40個(gè)循環(huán)后進(jìn)入溶解曲線，55 ℃到95 ℃，每0.6 s上升0.5 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用2值法對(duì)chi-miR-107-3p及mRNA的表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。運(yùn)用SPSS 20.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，使用雙變量Pearson進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以

P

<0.05為差異顯著，

P

<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品系絨山羊皮膚毛囊組織顯微結(jié)構(gòu)分析

校準(zhǔn)并測(cè)量皮膚收縮率發(fā)現(xiàn)，2個(gè)品系絨山羊皮膚收縮率均約為65%。皮膚毛囊組織顯微結(jié)構(gòu)觀察分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)品系毛囊群結(jié)構(gòu)均以三元型為主(3個(gè)初級(jí)毛囊和若干個(gè)次級(jí)毛囊)，可見(jiàn)少量的二元型和四元型。在退行期，次級(jí)毛囊細(xì)胞核增大，開(kāi)始死亡，同時(shí)有部分細(xì)胞開(kāi)始向外擴(kuò)散，呈現(xiàn)刷狀分布，細(xì)胞破碎，逐漸成為一點(diǎn)甚至消失，毛囊群之間的結(jié)締組織較薄，連接不緊密(圖1(a)和(b)，圖2(a)和(b))；在休止期，次級(jí)毛囊基本退化，極少看到具有紅色內(nèi)跟鞘的毛囊，毛乳頭完全消失，次級(jí)毛囊密度達(dá)到最低，毛囊群結(jié)構(gòu)之間的結(jié)締組織變薄，次級(jí)毛囊排布散亂，大小不一，多成散狀分布(圖1(c)和(d)，圖2(c)和(d))；興盛前期，級(jí)毛囊再次重建，初級(jí)毛囊周?chē)霈F(xiàn)多個(gè)小毛囊，同時(shí)也有幾個(gè)小毛囊緊密相靠，這說(shuō)明有新的毛囊產(chǎn)生。如圖1(e)、圖2(g)、圖2(e)和圖2(g)，具有常年長(zhǎng)絨特點(diǎn)的敏蓋絨山羊次級(jí)毛囊重建均已基本完成，初、次級(jí)毛囊均呈橢圓形，排列緊密、整齊。而阿拉善型絨山羊次級(jí)毛囊正處于重建階段，次級(jí)毛囊分布雜亂，仍有部分新生毛囊出現(xiàn)；在興盛期，次級(jí)毛囊重建完成，此時(shí)次級(jí)毛囊密度最大，具有紅色內(nèi)跟鞘的毛囊也最多，次級(jí)毛囊排布整齊，毛囊群之間的結(jié)締組織連接緊密，結(jié)構(gòu)明顯。如圖1(f)、圖2(h)、圖2(f)和2(h)。結(jié)合表2可見(jiàn)，2個(gè)品系絨山羊初級(jí)毛囊密度在整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)幾乎沒(méi)有變化，而次級(jí)毛囊密度變化顯著。皮膚毛囊興盛前期，阿拉善型絨山羊次級(jí)毛囊密度極顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)，次級(jí)毛囊深、初級(jí)毛球?qū)?、次?jí)毛球?qū)捄蚐/P值(次級(jí)毛囊數(shù)/初級(jí)毛囊數(shù))等性狀均顯著小于敏蓋絨山羊(光控增絨)(

P

<0.05)。在皮膚毛囊興盛期，阿拉善型絨山羊次級(jí)毛囊密度、次級(jí)毛囊深和次級(jí)毛球?qū)掞@著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)。表明兩種品系的絨山羊初級(jí)、次級(jí)毛囊在形態(tài)特征上基本一致，但在同一時(shí)期的生長(zhǎng)規(guī)律不同。

表2 不同品系內(nèi)蒙古絨山羊皮膚毛囊組織結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)分析
Table 2 Statistical analysis of transverse skin and hair follicle tissue structure of different strains of Inner Mongolia cashmere goats

性狀Character月份Month阿拉善型絨山羊Alashan cashmere goats敏蓋絨山羊Mingai cashmere goats1月26.29±0.18 a27.13±1.90 a表皮厚度/μmDepth of secondary follicle4月20.24±1.58 a21.31±0.64 a7月27.51±3.48 a34.19±3.72 a9月32.36±1.64 a34.16±1.43 a1月1 015.94±14.34 a1 100.04±9.56 a真皮厚度/μmThickness of dermis4月1 012.42±61.44 a976.52±37.76 a7月1 091.89±19.50 a1 126.77±37.63 a9月1 093.35±10.38 a1 192.60±10.75 a1月2 015.54±20.19 a2 041.60±42.67 a初級(jí)毛囊深度/μmDepth of primary follicle4月1 707.83±24.75 a1 733.48±25.48 a7月2 073.33±7.51 Bc2 281.1±49.29 ABb9月2 394.65±34.89 a2 488.45±65.85 a1月1 162.54±16.75 a1 151.79±5.64 a次級(jí)毛囊深度/μmDepth of secondary follicle4月1 008.70±20.52 a1 070.24±2 977 a7月1 155.50±31.09 b1 276.27±19.01 a9月1290.91±29.86 b1 456.91±76.32 a1月224.44±7.85 a252.48±8.38 a初級(jí)毛球直徑/μmDiameter of primary hair bulb4月157.77±6.40 a181.36±13.77 a7月239.30±19.64 b305.57±7.59 a9月317.54±8.07 a313.70±10.74 a1月96.14±1.40 a101.71±3.37 a次級(jí)毛球直徑/μmDiameter of secondary hair bulb4月84.53±2.93 a91.53±9.70 a7月84.30±0.91 b112.56±5.31 a9月101.92±3.30 b118.73±5.69 a1月2.91±0.79 a2.63±0.76 a初級(jí)毛囊密度/(個(gè)/mm2)Density of primary follicle4月2.45±0.61 a2.54±0.57 a7月2.99±0.71 a2.90±0.54 a9月2.99±0.75 a3.00±0.75 a1月26.27±2.13 a27.18±3.36 a次級(jí)毛囊密度/(個(gè)/mm2)Density of secondary follicle4月22.54±3.11 a23.09±3.59 a7月28.36±2.29 A35.63±2.98 B9月39.09±4.04 a43.91±3.86 b1月9.61±2.40 a10.83±2.14 a初級(jí)毛囊數(shù)/次級(jí)毛囊數(shù)S/P4月9.49±1.67 a9.37±1.95 a7月10.41±2.72 a12.54±1.67 b9月13.85±2.64 a15.20±2.30 a

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(<0.05)；肩標(biāo)不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(<0.01)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(>0.05)。
Note: In the same line, values with different small letters superscripts mean significant difference (<0.05); Different capital letters superscripts mean extremely significant difference (<0.01); While the same letter superscripts mean no significant difference (>0.05).

(a)、(c)、(e)、(g)分別是阿拉善型絨山羊皮膚毛囊退行期、休止期、興盛前期、興盛期橫切切片；(b)、(d)、(f)、(h)分別是敏蓋絨山羊皮膚毛囊退行期、休止期、興盛前期、興盛期橫切切片；▲初級(jí)毛囊；★次級(jí)毛囊。比例尺為100 μm。(a), (c), (e) and (g) were transverse sections of the skin follicles of Alxa cashmere goats in anagen, resting stage， prosperous and regression stage respectively; (b), (d), (f) and (h) were transverse sections of the skin follicles of Mingai cashmere goats in anagen, resting stage, prosperous and regression stage respectively; ▲ Primary hair follicle; ★ Secondary hair follicle. Bar is 100 μm.圖1 不同品系絨山羊皮膚毛囊橫切切片F(xiàn)ig.1 Transverse skin sections of different strains on cashmere goats

(a)、(c)、(e)、(g) 分別是阿拉善型絨山羊皮膚毛囊退行期、休止期、興盛前期、興盛期橫切切片；(b)、(d)、(f)、(h) 分別是敏蓋絨山羊皮膚毛囊退行期、休止期、興盛前期、興盛期橫切切片；▲初級(jí)毛囊；★次級(jí)毛囊。比例尺為100 μm。(a), (c), (e) and (g) were localisation sections of the skin follicles of Alxa cashmere goats in anagen, resting stage, prosperous and regression stage respectively; (b), (d), (f) and (h) were localisation sections of the skin follicles of Mingai cashmere goats in anagen, resting stage, prosperous and regression stage respectively; ▲ Primary hair follicle; ★ Secondary hair follicle. Bar is 100 μm.圖2 不同品系絨山羊皮膚毛囊縱切切片F(xiàn)ig.2 Localisation skin sections of different strains on cashmere goat

2.2 不同品系絨山羊皮膚組織chi-miR-107-3p相關(guān)基因在不同毛囊周期的表達(dá)分析

2

.

2

.

1

不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p的表達(dá)分析由圖3(a)可見(jiàn)，阿拉善型絨山羊皮膚毛囊興盛前期chi-miR-107-3p達(dá)量極顯著高于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。對(duì)同一品種不同時(shí)期chi-miR-107-3p的表達(dá)量進(jìn)行分析，由圖3(b)可見(jiàn)，阿拉善型絨山羊皮膚組織中，chi-miR-107-3p表達(dá)量在興盛前期極顯著大于興盛期(

P

<0.01)，且顯著大于退行期和休止期(

P

<0.05)。敏蓋絨山羊皮膚組織中，chi-miR-107-3p的表達(dá)量在休止期最高，且顯著大于其他3個(gè)時(shí)期(

P

<0.05)。因此說(shuō)明，不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p的表達(dá)規(guī)律不同。

ALS：阿拉善型絨山羊; MG：敏蓋絨山羊; January:絨山羊皮膚毛囊退行期; April:絨山羊皮膚毛囊休止期; July: 絨山羊皮膚毛囊興盛前期；September：絨山羊皮膚毛囊興盛期。圖3a為相同時(shí)期不同品系之間的比較，圖3b為相同品系不同時(shí)期的比較，組間比較肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；下同。ALS: Alxa cashmere goat; MG: Mingai cashmere goat; January: the skin follicles of Alxa cashmere goats in anagen; April: the skin follicles of Alxa cashmere goats in resting stage; July: the skin follicles of Alxa cashmere goats in prosperous; September: the skin follicles of Alxa cashmere goats in regression stage respectively. Different small letters superscripts mean significant difference (P<0.05); Different capital letters superscripts mean extremely significant difference (P<0.01); While the same letter superscripts mean no significant difference (P<0.05); The same as below.圖3 不同品系絨山羊皮膚毛囊不同生長(zhǎng)時(shí)期chi-miR-107-3p相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of chi-miR-107-3p in skin and hair follicles of different strains Cashmere goats

2

.

2

.

2

不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p相關(guān)基因在不同毛囊周期的表達(dá)量分析對(duì)不同品系絨山羊皮膚毛囊不同發(fā)育時(shí)期皮膚組織中

ADCK

、

DSBC1

、

RHBDF2

、

ALDH3A2

、

ARSA

和

FMAP4

基因的表達(dá)量進(jìn)行差異性分析(圖4)。結(jié)果顯示，在休止期(4月)，阿拉善型絨山羊皮膚組織中

ADCK

5基因的表達(dá)量極顯著大于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。興盛前期(7月)，阿拉善型絨山羊皮膚組織中

RHBDF2

基因極顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。興盛期(9月)，阿拉善型絨山羊和敏蓋絨山羊皮膚組織中

ADCK5

、

DSBC1

、

RHBDF2

、

ALDH3A2

、

ARSA

和

FMAP4

基因的表達(dá)量差異不顯著(

P

>0.05)。退行期(1月)，阿拉善型絨山羊皮膚組織中

DSBC1

基因的表達(dá)量極顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。在整個(gè)皮膚毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育周期中，

RHBDF2

基因的表達(dá)量在興盛前期到興盛期的過(guò)程中逐漸升高，在興盛期達(dá)到最高，之后逐漸降低，到達(dá)退行期，其表達(dá)量最低；

ALDH3A2

基因的表達(dá)量在休止期最高，隨著皮膚毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育，其表達(dá)量逐漸降低，到達(dá)興盛期，其表達(dá)量最低，到休止期表達(dá)量逐漸升高。由此可見(jiàn),不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p相關(guān)基因在同一毛囊發(fā)育階段表達(dá)量不一致。

圖4 不同品系絨山羊皮膚毛囊不同生長(zhǎng)時(shí)期mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of mRNA in skin and hair follicles of different breeds(strains) Cashmere goats

2

.

2

.

3

chi-miR-107-3p及其相關(guān)基因和皮膚及毛囊性狀間的相關(guān)性分析對(duì)chi-miR-107-3p以及6個(gè)基因和兩品系絨山羊皮膚毛囊性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析(表3)，chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因與皮膚毛囊初級(jí)毛囊密度和真皮厚顯著相關(guān)(

P

<0.05)，與次級(jí)毛囊密度、S/P、表皮厚、初次級(jí)毛囊深及初次級(jí)毛球?qū)捑鶚O顯著相關(guān)(

P

<0.01)；

ALDH3A2

基因與初級(jí)毛囊密度、真皮厚和次級(jí)毛球?qū)掞@著相關(guān)(

P

<0.05)，與次級(jí)毛囊密度、S/P、表皮厚、初次級(jí)毛囊深及初級(jí)毛球?qū)捑鶚O顯著相關(guān)(

P

<0.01)；

DSBC1

基因僅與初級(jí)毛囊密度顯著相關(guān)(

P

<0.05)，其他基因與皮膚毛囊性狀均未表現(xiàn)相關(guān)性。表明差異表達(dá)的chi-miR-107-3p及其相關(guān)基因并不完全與皮膚毛囊性狀相關(guān)。

表3 chi-miR-107-3p和相關(guān)基因與絨毛性狀的關(guān)聯(lián)分析
Table 3 The association analysis of chi-miR-107-3p and mRNA with fleece traits

性狀Characterchi-miR-107-3pADCK5DSBC1RHBDF2ALDH3A2ARSAFMAP4初級(jí)毛囊密度Density of primary follicle0.0390.9550.0120.0380.0100.0870.606次級(jí)毛囊密度Density of secondary follicle0.0010.7480.0840.0010.0050.2140.848初級(jí)毛囊數(shù)/次級(jí)毛囊數(shù)S/P0.0010.6900.1640.0010.0060.2630.994真皮厚度Thickness of dermis0.0110.7350.5610.0110.0450.1290.891表皮厚度Thickness of epidermis0.0030.5110.1290.0030.0090.1490.930初級(jí)毛囊深度Depth of primary follicle0.0010.5880.2120.0010.0020.046*0.941次級(jí)毛囊深度Depth of secondary follicle0.0010.2560.1080.0010.0030.2260.756初級(jí)毛球直徑Diameter of primary hair bulb0.0010.2680.1900.0010.0040.1690.926次級(jí)毛球直徑Diameter of secondary hair bulb0.0010.2090.4550.0010.0100.1570.581

注：表中數(shù)據(jù)表示相關(guān)性值。
Note: The data in the table represent correlation values.

3 討 論

3.1 不同品系絨山羊皮膚組織不同毛囊發(fā)育時(shí)期的形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

產(chǎn)絨量是絨山羊最主要的經(jīng)濟(jì)性狀，次級(jí)毛囊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和興盛期的長(zhǎng)短很大程度上影響產(chǎn)絨量絨毛品質(zhì)，其中遺傳力較高的3個(gè)性狀分別是毛囊深度、毛囊密度以及S/P值，且均與產(chǎn)絨量相關(guān)。對(duì)絨山羊皮膚組織顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)初級(jí)毛囊密度雖然伴隨著毛囊的退化、更新有一定幅度的變化，但是其毛囊密度在各生長(zhǎng)階段基本不發(fā)生變化。李長(zhǎng)青等在對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊與遼寧絨山羊皮膚毛囊生長(zhǎng)規(guī)律的研究中也得到相同的結(jié)論。由表2可見(jiàn)，阿拉善型絨山羊皮膚毛囊S/P值在興盛前期顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)，S/P值越大，說(shuō)明皮膚毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育越完善。范一星在不同毛被類(lèi)型內(nèi)蒙古絨山羊皮膚毛囊周期性生長(zhǎng)及相關(guān)分子機(jī)理研究中指出，活性S/P值較大時(shí)，表明次級(jí)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育更完善，與本研究結(jié)構(gòu)相似。由于敏蓋絨山羊?qū)儆诔Ｄ觊L(zhǎng)絨型絨山羊，次級(jí)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育較早，皮膚毛囊興盛前期大部分毛干已經(jīng)長(zhǎng)出體表，次級(jí)毛囊毛球結(jié)構(gòu)完整，而阿拉善型絨山羊此時(shí)期次級(jí)毛囊正處于重建過(guò)程當(dāng)中，大部分毛囊發(fā)育仍不完整。在皮膚毛囊興盛期，阿拉善型絨山羊次級(jí)毛囊密度顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)，阿拉善型絨山羊次級(jí)毛囊深顯著小于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)，且次級(jí)毛球?qū)掞@著小于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)，原因是阿拉善型絨山羊?qū)儆诩竟?jié)性長(zhǎng)絨絨山羊，次級(jí)毛囊進(jìn)入興盛期較遲。趙艷麗等對(duì)遼寧絨山羊常年長(zhǎng)絨型和季節(jié)性長(zhǎng)絨型絨山羊皮膚毛囊組織結(jié)構(gòu)研究指出，由興盛前期轉(zhuǎn)入興盛期的過(guò)程中，常年型次級(jí)毛囊深、次級(jí)毛球?qū)捑@著大于季節(jié)型，這與本研究一致。

3.2 不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p在不同毛囊發(fā)育時(shí)期的的表達(dá)分析

miRNA是最新發(fā)現(xiàn)在絨山羊皮膚毛囊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起調(diào)控作用的一類(lèi)小分子非編碼RNA，何玉龍等對(duì)不同發(fā)育階段小尾寒羊皮膚毛囊特異性miRNA鑒定分析，為從miRNA層面進(jìn)一步挖掘改良羊毛品質(zhì)及產(chǎn)量相關(guān)功能基因方面提供數(shù)據(jù)支撐與研究思路。本研究發(fā)現(xiàn)，皮膚毛囊興盛前期，chi-miR-107-3p在阿拉善型絨山羊皮膚組織中的表達(dá)量極顯著高于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。同時(shí)結(jié)合皮膚組織顯微結(jié)構(gòu)分析，阿拉善型絨山羊次級(jí)毛囊正處于重建階段，而敏蓋絨山羊次級(jí)毛囊已經(jīng)重建完成。這說(shuō)明在皮膚組織中高表達(dá)的chi-miR-107-3p抑制次級(jí)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育。在興盛期，chi-miR-107-3p在2個(gè)品系絨山羊皮膚組織中的表達(dá)量均較低，此時(shí)皮膚毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育最快。進(jìn)入退行期，chi-miR-107-3p的表達(dá)量逐漸增大，此時(shí)次級(jí)毛囊正處于退化階段。同時(shí)，經(jīng)過(guò)chi-miR-107-3p與皮膚毛囊性狀進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，chi-miR-107-3p與皮膚毛囊各性狀均顯著相關(guān)(

P

<0.05)。Li等研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用TLN可使chi-miR-107-3p缺失，dicer表達(dá)上調(diào)，可以加速皮膚傷口的愈合，說(shuō)明chi-miR-107-3p的缺失可以加速角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，從而加速皮膚的生長(zhǎng)。由此推測(cè)chi-miR-107-3p是絨山羊皮膚毛囊周期性生長(zhǎng)發(fā)育的重要影響因子之一，可能參與次級(jí)毛囊重建。

3.3 不同品系絨山羊皮膚組織RHBDF2和ALDH3A2基因在不同毛囊發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

李曉凱利用毛被類(lèi)型的名義顯著性候選基因和不同毛被類(lèi)型不同毛囊周期比較轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),進(jìn)行WGCNA數(shù)據(jù)的挖掘分析,發(fā)現(xiàn)

RHBDF2

基因可能與不同毛被類(lèi)型存在潛在一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果表明，阿拉善型絨山羊皮膚組織中

RHBDF2

基因的表達(dá)量在興盛期最高，生長(zhǎng)發(fā)育至退行期，

RHBDF2

基因的表達(dá)量逐漸降低，在休止期和興盛前期的表達(dá)量最低。敏蓋絨山羊皮膚組織中

RHBDF2

基因的表達(dá)量在興盛期最高，且在退行期和興盛前期的表達(dá)量大于休止期休止期。同時(shí)對(duì)

RHBDF2

基因與絨山羊皮膚毛囊性狀進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，

RHBDF2

基因與皮膚毛囊各性狀均顯著相關(guān)(

P

<0.05)。說(shuō)明高表達(dá)的

RHBDF2

基因可以促進(jìn)皮膚毛囊生長(zhǎng)。Hosur等在小鼠皮膚損傷傷口愈合反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，

RHBDF

2基因通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)參與上皮再生，可以通過(guò)增強(qiáng)表皮生長(zhǎng)因子受體來(lái)加速皮膚傷口愈合，這與本研究結(jié)果相同。推測(cè)

RHBDF2

基因是絨山羊皮膚毛囊周期性生長(zhǎng)發(fā)育的重要影響因子；兩個(gè)品系絨山羊皮膚組織中

ALDH3A2

基因的表達(dá)量均是在休止期最高，且極顯著大于其他3個(gè)時(shí)期(

P

<0.01)，退行期和興盛前期極顯著大于興盛期(

P

<0.01)，興盛前期顯著大于退行期(

P

<0.05)。可以發(fā)現(xiàn)，

ALDH3A2

基因的表達(dá)量在皮膚毛囊休止期至興盛期的過(guò)程中逐漸降低，由退行期至休止期的過(guò)程中逐漸增高。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，

ALDH3A2

基因與皮膚毛囊各性狀均顯著相關(guān)(

P

<0.05)。說(shuō)明高表達(dá)的

ALDH3A2

可能抑制皮膚毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育，是調(diào)控皮膚毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的重要影響因子。研究發(fā)現(xiàn)，Sj?gren-Larsson綜合征(SLS)是一種遺傳性神經(jīng)皮膚疾病，由脂肪醛脫氫酶(FALDH)基因誘導(dǎo)

ALDH3A2

突變引起，導(dǎo)致脂肪醛脫氫酶缺乏，脂肪醛和脂肪醇積聚，會(huì)增加角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)并且延緩皮膚屏障的恢復(fù)，

ALDH3A2

在絨山羊羊絨發(fā)育過(guò)程中的作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.4 chi-miR-107-3p和RHBDF2基因的表達(dá)差異相關(guān)性分析

通過(guò)對(duì)chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因在絨山羊皮膚毛囊不同發(fā)育周期的表達(dá)量呈相反趨勢(shì)。在次級(jí)毛囊重建初期，chi-miR-107-3p表達(dá)量較高，而

RHBDF2

基因的表達(dá)量極低，隨著次級(jí)毛囊重建逐步完成，chi-miR-107-3p表達(dá)量顯著降低，

RHBDF2

基因的表達(dá)量逐漸增高。直到進(jìn)入退行期，chi-miR-107-3p的表達(dá)量逐漸增高，而

RHBDF2

基因的表達(dá)量逐漸降低，休止期，chi-miR-107-3p的表達(dá)量達(dá)到最大值，此時(shí)

RHBDF2

基因的表達(dá)量最小。同時(shí)，結(jié)合基因表達(dá)與皮膚毛囊性狀的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因均與初級(jí)毛囊密度和真皮厚度顯著相關(guān)(

P

<0.05)，且與次級(jí)毛囊密度、表皮厚度、初級(jí)和次級(jí)毛囊深度和毛球直徑極顯著相關(guān)(

P

<0.01)。同時(shí)，利用miRbase預(yù)測(cè)了

RHBDF2

基因與chi-miR-107-3p可能具有靶向關(guān)系，推測(cè)chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因可能存在負(fù)調(diào)控關(guān)系，共同調(diào)控絨山羊皮膚毛囊的周期性生長(zhǎng)發(fā)育，但這一關(guān)系仍需通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.5 展望

本研究通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)不同品系的絨山羊皮膚毛囊組織顯微結(jié)構(gòu)相近。結(jié)合chi-miR-107-3p及其相關(guān)基因的表達(dá)情況，皮膚毛囊從興盛前期到興盛期、退行期到休止期，chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因表達(dá)量變化總相反。說(shuō)明chi-miR-107-3p可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控

RHBDF2

基因的表達(dá)來(lái)抑制絨山羊皮膚毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育，但這一關(guān)系需進(jìn)一步證實(shí)；根據(jù)

ALDH3A2

基因在絨山羊皮膚組織中的表達(dá)情況與毛囊形態(tài)密切相關(guān)發(fā)現(xiàn)，

ALDH3A2

基因可能是絨山羊皮膚毛囊周期性生長(zhǎng)發(fā)育的重要影響因子。接下來(lái)的研究需進(jìn)一步確定chi-miR-107-3p與其相關(guān)基因的靶向關(guān)系，及其對(duì)絨山羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用，對(duì)深入了解絨山羊皮膚毛囊周期性生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制具有重要的意義。