基于微生物16SrRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)ICR小鼠傳代后腸道菌群變化的分析

張璐瑤 孟 琳 顓清芮 傅祥偉，3 侯云鵬*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/畜禽育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,北京 100193；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832000)

哺乳動(dòng)物胃腸道內(nèi)定植了1 014種細(xì)菌，這些細(xì)菌基因總和是宿主基因數(shù)目的 100 多倍，因此也被稱為寄主體內(nèi)的“隱形器官”。近年來(lái)關(guān)于哺乳動(dòng)物腸道微生物的研究表明，腸道微生物可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和神經(jīng)等方式參與機(jī)體的能量代謝、物質(zhì)吸收、免疫調(diào)節(jié)等多項(xiàng)生命活動(dòng)。作為宿主體內(nèi)控制代謝的隱形器官,腸道微生物失調(diào)可能造成多種代謝紊亂疾病，如肥胖，Ⅱ型糖尿病，脂肪肝和動(dòng)脈粥樣硬化等。此外，腸道菌群易受宿主年齡、性別以及飲食等應(yīng)激性環(huán)境因素的影響。

小鼠腸道中存在大量的微生物菌群,這些微生物菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜種類繁多,參與宿主的代謝,在宿主的消化吸收和免疫調(diào)控方面均發(fā)揮了重要作用,對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育有很大影響。ICR品系小鼠以多產(chǎn)為目標(biāo)進(jìn)行選育，由美國(guó)癌癥研究所(Institute of cancer research)分送各國(guó)飼養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)小鼠ICR。ICR品系小鼠毛色白化，同時(shí)具有適應(yīng)性強(qiáng)，體格健壯，繁殖力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好等特點(diǎn)，是常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室模式動(dòng)物。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室和我國(guó)的從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理的研究者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間和多代次的近親擴(kuò)繁，ICR品系小鼠隨著繁殖代次的增加會(huì)出現(xiàn)一些生長(zhǎng)和繁殖性能異常的狀況。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，ICR品系小鼠傳代后新生子代的生長(zhǎng)速度顯著降低，各年齡段體重顯著降低，體長(zhǎng)顯著降低等現(xiàn)象。

隨著基因組技術(shù)和二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,研究微生物群落結(jié)構(gòu)也實(shí)現(xiàn)了從傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)基提取法到使用高通量測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)變。其中，16SrRNA測(cè)序已經(jīng)成為研究微生物群落組成及其分布的重要手段。16SrRNA測(cè)序技術(shù)是通過(guò)比對(duì)細(xì)菌 16SrRNA 序列對(duì)細(xì)菌進(jìn)行快速種屬鑒定的一種方法。與此同時(shí)16SrRNA測(cè)序技術(shù)還可以對(duì)樣品中的優(yōu)勢(shì)物種以及一些未知的物種進(jìn)行檢測(cè)和分類，獲得樣品中的微生物組成并計(jì)算出它們的相對(duì)豐度。此外，16SrRNA測(cè)序還可以通過(guò)差異菌群進(jìn)行差異代謝通路預(yù)測(cè)分析，預(yù)測(cè)腸道微生物的變化帶來(lái)的代謝差異表型等。由此，猜測(cè)ICR品系雄性小鼠隨著繁殖代次的增加出現(xiàn)的生長(zhǎng)異?？赡芘c其腸道微生物的改變有關(guān)。為探究ICR雄性小鼠隨著繁殖代次的增加出現(xiàn)的生長(zhǎng)異常和其腸道微生物的關(guān)系，分別收集F0、F1、F2和F3代18周雄鼠的大腸內(nèi)容物，每組收集6個(gè)重復(fù)，通過(guò)16SrRNA測(cè)序技術(shù)，研究ICR雄性小鼠傳代之后腸道菌群的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

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1

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1

試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雌性ICR小鼠20只，雄性ICR小鼠10只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)7周齡，體重25～30 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，小鼠繁殖飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。小鼠繁殖飼料具體營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)(表1)，從華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司購(gòu)買。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照相關(guān)參數(shù)進(jìn)行控制：小鼠自由采食和飲水，供應(yīng)充足，墊料每周更換一次。光照控制在12 h∶12 h(北京時(shí)間8:00～20:00光照)，溫度控制在20～25 ℃，濕度為45%～55%。

表1 飼料配方Table 1 Feed formula

1.2 試驗(yàn)方法

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2

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1

動(dòng)物建模方式

所有小鼠均在清潔級(jí)鼠房飼養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境，將這些小鼠作為F0代記錄。隨后，標(biāo)記耳號(hào)(耳號(hào)按繁殖代次標(biāo)記為：F0:10XX)并記錄后，每籠按照雌雄比2∶1進(jìn)行合籠。雌鼠明顯懷孕后，取出單籠飼養(yǎng)。產(chǎn)仔記為F1代，及時(shí)記錄產(chǎn)仔數(shù)與出生體重(注意初產(chǎn)雌鼠易食仔，需及時(shí)查看處理；若雌鼠流產(chǎn)導(dǎo)致妊娠失敗也需記錄)。幼鼠F1代21日齡時(shí)斷奶，標(biāo)記耳號(hào)并記錄性別與離乳體重，將飼料剝碎放入幼鼠籠內(nèi)便其采食。35日齡(性成熟)時(shí)，取體況良好的F1代雄鼠與雌鼠1∶2交配進(jìn)行下一代繁殖實(shí)驗(yàn)，此時(shí)應(yīng)注意避免近親交配，產(chǎn)仔標(biāo)記為F2代。處理過(guò)程與上述F0代時(shí)處理相同。以此類推，F(xiàn)2代雄鼠和雌鼠1∶2交配后產(chǎn)生的后代記為F3代，以此類推，將其后代分別標(biāo)記為F1：11XX，F(xiàn)2：12XX，F(xiàn)3：13XX，F(xiàn)4：14XX， F5：15XX。

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2

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2

腸道微生物樣本收集

小鼠處死后，取大腸中的內(nèi)容物于無(wú)菌凍存管中，分別收集F0、F1、F2和 F3 代 18周 雄鼠的大腸內(nèi)容物，每組收集6個(gè)重復(fù)。標(biāo)記好后立即投入液氮中迅速冷凍。待所有樣本收集完成后，轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存。

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2

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3

腸道微生物樣本DNA提取

大腸內(nèi)容物標(biāo)本解凍以后，按照Fast DNA SPIN Soil Kit (MP Biomedicals，Santa Ana，CA)說(shuō)明書(shū)的操作說(shuō)明進(jìn)行樣本DNA提取，提取細(xì)菌DNA。所有樣品全部提取完成后，放入干冰中送檢，使用Qiime平臺(tái)進(jìn)行16SrRNA測(cè)序。后續(xù)的細(xì)菌DNA擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析均由北京奧維森科技有限公司承擔(dān)。

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2

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4

細(xì)菌DNA擴(kuò)增

對(duì)腸道微生物樣本的16SrRNA V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為(F:ACTCCTACGGGAGGCAGCAG R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT 北京奧維森科技有限公司)。選擇Premix Taq 試劑。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 28個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸7 min。然后使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)樣本質(zhì)量進(jìn)行定量檢測(cè)，最終選擇DNA濃度>50 mg/L、總量>3 ng的24份樣品進(jìn)行16SrRNA測(cè)序。

1

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2

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5

細(xì)菌16SrRNA測(cè)序分析

使用16SrRNA的高可變區(qū)QIIME測(cè)序技術(shù)，對(duì)樣品的16SrRNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果以“Fast-q”格式存儲(chǔ)。同時(shí)，使用Mi-seq測(cè)序得到Pair-End(PE)雙端序列數(shù)據(jù)，對(duì)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析，經(jīng)過(guò)一系列的篩選，拼接和去冗余處理等，最終得到優(yōu)質(zhì)的數(shù)據(jù)。質(zhì)控分析過(guò)程中，需要使用Trimmomatic (V0.36),Pear (V0.96)，F(xiàn)lash (V1.20)，Vsearch (V2.7.1)等相關(guān)軟件。

將序列按照相對(duì)豐度排序，排列順序從高到低。所有序列依據(jù)不同的相似度進(jìn)行OTU劃分，對(duì)大于97%相似水平的OTU進(jìn)行生物信息分析。結(jié)合QIIME(version 1.9.1)平臺(tái)，參考16S細(xì)菌和古菌核糖體數(shù)據(jù)庫(kù), kSilva2(Release128/132 http:∥www.arbsilva.de)，RDP(V16 http:∥rdp.cme.msu.edu/),Greengene(Release13.5 http:∥greengenes.secondgenome.com/)采用RDP classifier貝葉斯算法進(jìn)行分類學(xué)分析。最后通過(guò)序列比對(duì)獲得每個(gè)OTUs的物種分類信息。使用PICRUSt對(duì)OTUs豐度標(biāo)準(zhǔn)化，并將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的OTUs對(duì)應(yīng)到相應(yīng)的基因進(jìn)化樹(shù)，從而得到相應(yīng)的KEGG信息，并用STAM P對(duì)得到的KEGG進(jìn)行差異分析。

1

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2

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6

統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS分析軟件中的獨(dú)立樣本

t

檢驗(yàn)對(duì)小鼠的體重，微生物多樣性以及特定菌種差異分析。

P

<0.05為顯著性差異，

P

<0.01為極顯著性差異，

P

>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同繁殖代次ICR雄性小鼠在相同周齡的體重分析

為了探究不同代次ICR品系小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育情況，在0、3、5和18周4個(gè)時(shí)期分別取F1、F2、F3、F4和F5 代雄性小鼠進(jìn)行稱重，每組樣本數(shù)不低于20只。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1所示，在0、3、5和18周，小鼠的體重隨著代次的積累均呈下降趨勢(shì)，且差異顯著，說(shuō)明ICR雄性小鼠隨著繁殖代次的增加，體重顯著降低。

*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001,ns差異不顯著(P>0.05)。下同。* Represents P<0.05, ** Represents P<0.01, *** Represents P<0.001, ns represents significant difference at 0.05 level。The same below.圖1 不同代次ICR雄性小鼠在相同周齡的體重比較Fig.1 Comparison of body weight of ICR male mice of different generations at the same age

2.2 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物測(cè)序分析

為探究ICR雄性小鼠隨著繁殖代次的增加出現(xiàn)的生長(zhǎng)發(fā)育異常和其腸道菌群關(guān)系，分別收集F0、F1、F2和 F3 代 18周雄鼠的大腸內(nèi)容物，每組收集6個(gè)重復(fù)，對(duì)16S的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行16SrRNA測(cè)序。根據(jù)16SrRNA的測(cè)序結(jié)果，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，參考16 s細(xì)菌和古菌核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)Silva，共產(chǎn)生 1 786 個(gè) OTU,經(jīng)過(guò)抽平處理剩余1 729個(gè)。如圖2(a)示，F(xiàn)0代有OTUs 有1 276個(gè)，其中特殊OTUs 有87個(gè)；F1代有OTUs 有1 258個(gè)，其中特殊OTUs 有113個(gè)；F2代有OTUs 有1 173個(gè)，其中特殊OTUs 有47個(gè)；F3代有OTUs 有1 195個(gè)，其中特殊OTUs 有47個(gè)。為了更好的顯示多個(gè)樣本之間的距離關(guān)系，將加權(quán)與未加權(quán)的unifrac樣本距離矩陣用熱力圖表現(xiàn)出來(lái)，如圖2(b)所示，聚類結(jié)果表明F0、F1、F2和 F3 代各組間微生物群落物種有明顯差異。

圖2 不同代次ICR雄性小鼠腸道微生物測(cè)序分析Fig.2 Intestinal microbial sequencing analysis of different generations of male ICR mice

2.3 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的Alpha多樣性指數(shù)分析

通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品OTU總數(shù)和每個(gè)OTU的相對(duì)豐度進(jìn)行樣品多樣性指數(shù)的計(jì)算。不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的Alpha多樣性比較結(jié)果見(jiàn)圖3。在分析Alpha 多樣性的過(guò)程中，通常使用Shannon-Wiener指數(shù)來(lái)反映樣本中微生物多樣性，Shannon指數(shù)利用各樣本在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。如圖3(b)所示，隨樣本序列數(shù)的增加，曲線逐漸趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠反映樣本中絕大多數(shù)微生物的信息，測(cè)序分析預(yù)測(cè)結(jié)果可信度較高。Chao1和Observed-species指數(shù)根據(jù)所測(cè)得OTUs的數(shù)量來(lái)預(yù)測(cè)樣品中微生物種類，兩者值越大，物種越豐富；由圖3(c)可知，F(xiàn)0、F1、F2和F3的chao1指數(shù)分別為922.035±78.932 8、821.1 625±72.941 8、757.502 5±19.1 453和613.325±106.878 7，各組兩兩比較均有顯著差異(

P

<0.05),隨繁殖代次的增加，chao1指數(shù)顯著下降。由圖3(d)可知，F(xiàn)0、F1、F2和F3的Observed-species指數(shù)分別為654.2±53.52 23、557.675±49.626 3、548.7±18.476 7和384.2±54.112 9，F(xiàn)0、F1和F2間兩兩比較無(wú)顯著差異(

P

>0.05),但F3代較前三組有顯著下降(

P

<0.001)。辛普森指數(shù) (Simpson) 和香儂指數(shù)(Shannon)的計(jì)算是基于樣品的所有OTU豐度和均勻度及其注釋物種信息進(jìn)行的。辛普森指數(shù)和香儂指數(shù)可以反映樣本的菌群種類數(shù)和每個(gè)菌種占總體群落的比例， Simpson指數(shù)越接近于1，香儂指數(shù)(Shannon)指數(shù)越大，說(shuō)明樣品中的菌群種類越豐富，多樣性水平越高。由圖3(e)可知，F(xiàn)0、F1、F2和F3的香儂指數(shù)(Shannon)分別為5.3 275±0.607 0、5.7 375±0.481 5、4.425±0.484 1和3.5 775±0.417 7，F(xiàn)0和F1比較無(wú)顯著差異(

P

>0.05),但隨代次的增加，F(xiàn)2和F3的香儂指數(shù)(Shannon)指數(shù)顯著下降(

P

>0.05)。由圖3(f)可知，F(xiàn)0、F1、F2和F3的Simpson指數(shù)分別為0.865±0.075 50、0.902 5±0.069 56、0.877 5±0.044 25和0.815±0.03 697，各組兩兩比較均無(wú)顯著差異(

P

>0.05)。綜上，結(jié)果表明隨繁殖代次的增加，腸道菌群Alpha多樣性呈顯著下降趨勢(shì)。

圖3 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的Alpha多樣性比較Fig.3 Comparison of Alpha diversity of intestinal microbial in different generations of male ICR mice

2.4 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群中門(mén)水平微生物類群的差異

不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群門(mén)水平聚類結(jié)果表明各組間微生物群落物種有明顯差異。如圖4(a)，在門(mén)水平上，各組的優(yōu)勢(shì)菌群均為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)(F0、F1、F2和F3組分別為83.3%，79.0%，81.8%和90.3%)和擬桿菌門(mén)(Bacteroides)(F0、F1、F2和F3組分別為6.0%、5.1%、4.0%和3.2%)。在F0組中擬桿菌門(mén)(Bacteroides)的豐度為6.0%，厚壁菌門(mén)的豐度為83.3%，且在F1組中擬桿菌門(mén)(Bacteroides)的豐度顯著低于F0組(

P

<0.01)，F(xiàn)2和F3組也顯著低于F0和F1組(

P

<0.01)(圖4(b))。此外，如圖4(c)，脫鐵桿菌門(mén)(Deferribacteres)在F2和F3組中的豐度也有顯著降低(

P

<0.01)。綜上，隨代次積累，ICR品系小鼠腸道微生物多樣性在門(mén)水平上有很大變化，并且隨代次積累，對(duì)一些特定的菌群，如厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和脫鐵桿菌門(mén)豐度的影響更為深遠(yuǎn)。

圖4 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群中門(mén)水平微生物類群的差異Fig.4 Differences of phylum level microflora in the intestinal microbiota of different generations of male ICR mice

2.5 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群中屬水平微生物類群的差異

如圖5(a)所示，毛螺菌科-NK4A136組，螺桿菌屬、乳酸球菌、梭菌屬-sencu-stricto-1、瘤胃球菌屬、彎曲桿菌屬、未確認(rèn)的-毛螺菌科、鏈球菌屬、乳酸菌屬、球菌屬、埃希氏菌屬、普氏菌屬和擬桿菌-S24-7組等在各組腸道微生物群中屬水平微生物類群均有差異。在屬水平上，F(xiàn)0、F1和F2 3組的優(yōu)勢(shì)菌群均為乳酸菌屬(

Lactobacillus

)(F0、F1和F2組分別為83.1%、62.8%和38.2%)，但F3代小鼠的一些未確認(rèn)分類的菌屬占比較高，約為45.3%。此外，如圖5(b)所示，雖然F0、F1和F2三組中乳酸菌屬均為優(yōu)勢(shì)菌群，但各組的乳酸菌屬豐度有顯著差異(

P

<0.05)，且隨代次的積累呈逐漸下降的趨勢(shì)。埃希氏菌屬(

Escherichia

)(F0、F1、F2和F3組分別為0.015%、0.032%、0.439%和2.41%)在F1、F2和F3代中的豐度有顯著升高(

P

<0.01)(圖5c)。綜上，隨代次積累，ICR品系小鼠腸道微生物多樣性在屬水平上有很大變化，并且隨代次積累，產(chǎn)生的影響更為深遠(yuǎn)。

圖5 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群中屬水平微生物類群的差異Fig.5 Differences of genus level microflora in the intestinal microbiota of different generations of male ICR mice

2.6 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的差異代謝途徑(KEGG)預(yù)測(cè)

為進(jìn)一步探究ICR子代體重下降的機(jī)制，本研究針對(duì)這一變化出現(xiàn)的差異最明顯的兩個(gè)組，即F0代和F3代的腸道微生物進(jìn)行KEGG差異代謝通路預(yù)測(cè)。如圖6可知，KEGG分析發(fā)現(xiàn)14條代謝途徑有顯著差異，其中，乙醛酸鹽代謝、胰島素信號(hào)通路、苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸生物合成途徑，萜類化合物生物合成途徑，肽聚糖生物合成和糖酵解糖異生作用在F3組中的豐度顯著低于F0組(

P

<0.05)，結(jié)果顯示F3代氨基酸合成，糖類代謝等多條基礎(chǔ)代謝通路受損。因此，不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的變化可能對(duì)小鼠的新陳代謝有一定影響。

圖6 F0和F3組腸道微生物差異生物功能代謝通路預(yù)測(cè)Fig.6 Analysis of metabolic pathway of biological different functions of the fecal microbiota in different generations of male ICR mice

3 討 論

3.1 ICR雄性小鼠傳代后腸道微生物多樣性顯著降低

本研究采用16SrRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)分析ICR雄性小鼠隨著繁殖代次增加出現(xiàn)的生長(zhǎng)異常和其腸道菌群的關(guān)系。通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果的深度挖掘和分析，發(fā)現(xiàn)隨代次積累，ICR雄性小鼠腸道微生物多樣性顯著降低，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)如擬桿菌門(mén)豐度顯著降低，相關(guān)益生菌門(mén)如脫鐵桿菌門(mén)的豐度也顯著降低，且隨代次的積累逐漸下降。以上結(jié)果顯示腸道菌群的失調(diào)可能是導(dǎo)致ICR雄性小鼠出現(xiàn)生長(zhǎng)異常的原因。大多數(shù)細(xì)菌可被可歸為兩大類，一大類是厚壁菌門(mén)，包括葡萄球菌、鏈球菌等；另一大類是擬桿菌門(mén)。有研究表明腸道菌群多樣性會(huì)影響宿主的體重，在對(duì)各組腸道菌群的分析中，不難發(fā)現(xiàn)擬桿菌門(mén)豐度顯著降低，這些變化可能與ICR雄性小鼠體重降低有關(guān)。另外值得注意的是，在針對(duì)屬水平的腸道微生物豐度分析中，發(fā)現(xiàn)隨ICR雄性小鼠繁殖代次的積累，乳酸菌屬豐度顯著降低，且隨代次的積累呈逐漸下降的趨勢(shì)。

乳酸菌(

Lactic

acid

bacteria

，LAB)是一類在動(dòng)物胃腸道中廣泛存在的厭氧或兼性厭氧性細(xì)菌，且此類細(xì)菌利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸等有機(jī)酸，是一類廣譜益生菌。作為益生菌，乳酸菌具有豐富的物種多樣性，包含18個(gè)屬，共200多種。乳酸菌在代謝過(guò)程中可以為宿主供給必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)代謝，促進(jìn)其生長(zhǎng)。乳酸菌還可以調(diào)節(jié)腸道環(huán)境酸堿平衡，使其符合淀粉酶和糖化酶等消化酶的最適pH，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。此外，乳酸菌可以改善腸道微環(huán)境，抑制一些有害的致病菌的生長(zhǎng)，增強(qiáng)生物體對(duì)疾病的抵抗力?；诖?，本研究認(rèn)為乳酸菌豐度的降低是造成 ICR雄性小鼠子代出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育異常的一個(gè)重要原因。

3.2 ICR雄性小鼠KEGG差異功能預(yù)測(cè)

除了益生菌缺失對(duì)腸道菌群多樣性造成的影響之外，腸道菌群還在機(jī)體不同的代謝途徑中發(fā)揮作用。差異菌群導(dǎo)致的代謝異?？梢赃M(jìn)一步解釋ICR雄性小鼠子代出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育異常表型。結(jié)合KEGG分析表明，隨繁殖代次增加，ICR雄性小鼠的苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸生物合成等氨基酸合成途徑，萜類化合物生物合成途徑，胰島素信號(hào)通路，糖酵解糖異生作用等糖類代謝途徑可能會(huì)出現(xiàn)表達(dá)異常的情況。芳香族氨基酸中的苯丙氨酸、色氨酸屬于必需氨基酸，而酪氨酸是半必需氨基酸。其中苯丙氨酸可以氧化成酪氨酸，并與酪氨酸一起合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素，參與機(jī)體糖代謝和脂肪代謝，因此芳香族氨基酸代謝對(duì)機(jī)體的其他兩大代謝途徑有很重要的調(diào)節(jié)作用，芳香族氨基酸代謝失調(diào)將直接導(dǎo)致機(jī)體的代謝功能紊亂。此外，胰島素信號(hào)通路在機(jī)體代謝的調(diào)控方面也有舉足輕重的地位。胰島素是能量代謝的主要調(diào)控激素，胰島素與受體結(jié)合后，激活受體中的蛋白酪氨酸激酶(PI3K)，被激活的酪氨酸激酶作用于受體底物，使受體底物發(fā)生磷酸化，隨后激活3種已知的 AKT 異構(gòu)體，最終通過(guò)多種不同的途徑參與到胰島素的代謝調(diào)節(jié)中，促進(jìn)機(jī)體對(duì)能量利用。通過(guò)圖6可以推測(cè)ICR雄性小鼠能量利用率也在逐漸降低。

3.3 展望

本研究結(jié)果初步探明ICR雄性小鼠的腸道菌群失衡可能是導(dǎo)致其生長(zhǎng)發(fā)育異常的機(jī)制之一。由于機(jī)體腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜,本研究?jī)H在門(mén)和屬水平對(duì)腸道菌群進(jìn)行了研究，并根據(jù)KEGG分析了可能影響的基礎(chǔ)代謝通路，對(duì)于具體關(guān)鍵微生物和生長(zhǎng)發(fā)育之間的因果關(guān)系值得進(jìn)一步研究。在后續(xù)的研究中，可以考慮對(duì)ICR小鼠進(jìn)行乳酸菌等益生菌的灌胃試驗(yàn)，觀察是否可以改善ICR雄性小鼠后代發(fā)育異常和體重下降等異常情況。

本研究結(jié)果同時(shí)表明，F(xiàn)2代前優(yōu)勢(shì)菌群未發(fā)生明顯改變，建議使用ICR子代進(jìn)行試驗(yàn)研究最好在F2代前，如確需更多子代進(jìn)行研究，建議考慮以非近親繁殖方式的進(jìn)行交配以進(jìn)行擴(kuò)繁和傳代。對(duì)個(gè)體一致性和遺傳表型穩(wěn)定性一要求較高的生物學(xué)試驗(yàn)ICR鼠不建議作為首選，如果實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)和資源有限，在使用ICR小鼠進(jìn)行繁殖實(shí)驗(yàn)時(shí)，須定期引入親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的ICR小鼠進(jìn)行擴(kuò)繁和傳代。

4 結(jié) 論

ICR雄性小鼠傳代后腸道微生物多樣性顯著降低，擬桿菌門(mén)和脫鐵桿菌門(mén)豐度顯著降低，乳酸菌屬豐度顯著降低，埃希氏菌屬等致病菌豐度顯著提高。結(jié)合差異代謝通路預(yù)測(cè)分析，隨代次積累ICR雄性小鼠氨基酸合成，糖類代謝等多條基礎(chǔ)代謝通路可能受損，這些變化均可導(dǎo)致ICR雄性小鼠后代發(fā)育異常和體重下降等缺陷。