外泌體在腎間質(zhì)纖維化中作用的研究進(jìn)展

宋曉紅 郭兆安

近年來(lái)，慢性腎臟病（CKD）的發(fā)病率不斷上升，流行病學(xué)研究表明，CKD 全球流行率接近10%，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。隨著病情的進(jìn)展，有490.2 萬(wàn)～708.3 萬(wàn)CKD 患者最終進(jìn)展為終末期腎?。‥SRD），給家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。腎間質(zhì)纖維化（RIF）是不同病因的CKD患者腎功能進(jìn)行性喪失的共同途徑，其主要病理特征為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管萎縮、毛細(xì)血管丟失、肌成纖維細(xì)胞增殖加速和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積。RIF 因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，相互作用的信號(hào)通路容易形成補(bǔ)償機(jī)制，目前尚無(wú)有效方法可阻止其進(jìn)展。近期研究顯示，外泌體參與包括RIF 等的多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展，并已經(jīng)在疾病診斷與治療方面顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。因此深入系統(tǒng)地研究外泌體在RIF 中的作用機(jī)制對(duì)指導(dǎo)RIF 早期診斷與治療，改善患者預(yù)后意義重大。

一、外泌體概述

外泌體是一種直徑為30～150 nm 的細(xì)胞外囊泡，外由脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成，內(nèi)含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸［包括mRNA、微RNA（miR）或長(zhǎng)鏈非編碼RNA］等多種成分。它通過母體細(xì)胞多囊體的外膜與頂端質(zhì)膜的融合而被釋放進(jìn)入微環(huán)境，可以反映母體細(xì)胞的生理病理狀態(tài)。人體內(nèi)幾乎所有類型細(xì)胞均可分泌外泌體，外泌體最初被認(rèn)為是人體的“垃圾袋”，但隨著研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到外泌體在病理生理過程中的重要作用。研究者發(fā)現(xiàn)，外泌體可以通過受體-配體結(jié)合，直接與質(zhì)膜融合和通過內(nèi)吞方式將脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等成分由母體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，誘導(dǎo)靶細(xì)胞的遺傳和表觀遺傳學(xué)變化，參與生物發(fā)生發(fā)展過程。在RIF 中受損腎單位細(xì)胞分泌的外泌體攜帶不同蛋白質(zhì)、核酸等效應(yīng)器分子，將有害信號(hào)不斷傳播與擴(kuò)大，不僅使腎臟固有細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，還不斷激活炎性細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞，使得損傷修復(fù)過程由間斷性轉(zhuǎn)為持續(xù)性，ECM 不受控制地積聚，導(dǎo)致正常腎功能逐漸喪失。外泌體除在生物體的病理生理過程中扮演重要角色外，還可以作為疾病診斷與治療的工具，其中，人工外泌體（AE）作為一種新型納米生物技術(shù)已經(jīng)引起人們的關(guān)注。本文將主要從發(fā)病機(jī)制方面綜述外泌體在RIF 研究中的最新進(jìn)展，并探討外泌體在RIF 診斷與治療中的前景與挑戰(zhàn)。

二、外泌體在RIF 發(fā)病機(jī)制中的作用

腎臟受到損傷后，來(lái)源于腎臟系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞（TEC）等固有細(xì)胞的外泌體通過多種細(xì)胞因子及通路募集炎性細(xì)胞，促使腎固有細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，激活肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致ECM過度沉積，從而促進(jìn)RIF 進(jìn)展。外泌體的具體作用機(jī)制見圖1。

圖1 外泌體促進(jìn)RIF 發(fā)展的作用機(jī)制

1.炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

炎性細(xì)胞的遷移與浸潤(rùn)在RIF 進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。在受到高血糖、蛋白質(zhì)超載、缺氧等損傷后，TEC 出現(xiàn)包括細(xì)胞周期停滯、EMT 等細(xì)胞及分子重排改變，從而分泌各種趨化因子（包括CCL2、CCL3 等）觸發(fā)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞向損傷部位募集。損傷初期，被招募至損傷部位的中性粒細(xì)胞主要驅(qū)動(dòng)早期炎癥反應(yīng)，隨后活化的巨噬細(xì)胞釋放多種炎性及纖維化因子，促使持續(xù)性炎癥發(fā)生，ECM 積聚，正常腎單位被永久性纖維瘢痕代替，腎功能逐漸喪失。由TEC 釋放的炎性趨化因子或介質(zhì)，除了通過可溶性細(xì)胞因子和介質(zhì)傳遞經(jīng)典信號(hào)外，外泌體因其傳遞信息的潛力在促進(jìn)炎癥細(xì)胞的激活與募集、加重炎癥反應(yīng)方面也受到學(xué)者們的極大關(guān)注。

巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)是腎小管間質(zhì)疾病最具特征的表現(xiàn)之一，來(lái)源于受損TEC 的外泌體可通過上皮-巨噬細(xì)胞信號(hào)串?dāng)_介導(dǎo)巨噬細(xì)胞募集與活化。Lv等的研究顯示，經(jīng)牛血清白蛋白處理的TEC 可通過外泌體將有害信號(hào)傳遞到間質(zhì)巨噬細(xì)胞，促進(jìn)腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化。研究者發(fā)現(xiàn)，暴露于牛血清白蛋白環(huán)境中，不僅使TEC 釋放更多含有CCL2 mRNA 的外泌體，還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)CCL2 mRNA 的攝取，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的遷移，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。據(jù)報(bào)道，在CKD患者的腎組織中，巨噬細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為具有促炎效應(yīng)的M1 型，分泌對(duì)系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用的炎癥因子，從而促進(jìn)腎纖維化進(jìn)程。巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換可以由細(xì)胞因子或配體-受體的相互作用來(lái)觸發(fā)，最近發(fā)現(xiàn)外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞通信是啟動(dòng)M1 型巨噬細(xì)胞活化的另一種途徑。Lv 等發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者尿液外泌體中存在高水平的miR-19b-3p 且與腎小管間質(zhì)炎癥程度相關(guān)，隨后其將牛血清白蛋白誘導(dǎo)的TEC 外泌體與巨噬細(xì)胞共同孵育，結(jié)果顯示外泌體中miR-19b-3p 可靶向作用于細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1（SOCS-1）激活NF-κB 通路，使受體巨噬細(xì)胞極化為促炎的M1 表型，加重腎臟損傷。此外，經(jīng)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）處理的TEC 釋放的外泌體可通過轉(zhuǎn)移miR-23a 和抑制泛素編輯酶A20 的活性，激活NF-κB 信號(hào)來(lái)觸發(fā)巨噬細(xì)胞的促炎表型，接受外泌體注射的小鼠腎小管間質(zhì)炎癥程度明顯增加也佐證了這一作用。

2.肌成纖維細(xì)胞活化

肌成纖維細(xì)胞是具有平滑肌的某些功能和結(jié)構(gòu)特征的成纖維細(xì)胞，完全發(fā)育的肌成纖維細(xì)胞具有與成纖維細(xì)胞相似的外觀，可特異性表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）。研究表明，腎組織的肌成纖維細(xì)胞主要來(lái)源于成纖維細(xì)胞活化、骨髓分化及上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化等，外泌體在其中扮演重要角色。

低氧應(yīng)激導(dǎo)致TEC 分泌外泌體，將外泌體與腎成纖維細(xì)胞（NRK-49F）共同孵育后，NRK-49F表達(dá)大量α-SMA、FN 以及Ⅰ型膠原，研究進(jìn)一步證明miR-150-5p 在外泌體介導(dǎo)的TEC-成纖維細(xì)胞通信中發(fā)揮重要作用。此外，Wen 等報(bào)道，來(lái)源于高糖處理近端TEC 的外泌體可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變。筆者通過對(duì)外泌體進(jìn)行蛋白組學(xué)結(jié)合Nephroseq 數(shù)據(jù)庫(kù)分析，認(rèn)為內(nèi)皮型一氧化氮合酶可能在外泌體誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞激活中有著不可替代的作用，但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。還有研究表明，TGF-β1誘導(dǎo)TEC 產(chǎn)生的外泌體可以加重正常TEC 的表型改變，定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-qPCR）顯示miR-21借助外泌體完成TEC 間的信息傳遞，通過激活受體細(xì)胞Pten/Akt 信號(hào)通路參與RIF 的發(fā)生發(fā)展。雖然對(duì)于發(fā)生EMT 的TEC 是否通過轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的方式參與纖維化進(jìn)程尚存在爭(zhēng)議，但它仍可通過旁分泌等途徑促進(jìn)炎性細(xì)胞和肌纖維細(xì)胞的募集，促進(jìn)RIF 的發(fā)生。

3. ECM 沉積

ECM 沉積是RIF 的一個(gè)標(biāo)志性形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，不僅與Ⅰ型、Ⅲ型膠原、FN 等蛋白的過度合成有關(guān)，而且與其降解減少有關(guān)。外泌體中的miR 等成分可通過多條途徑參與ECM 的沉積。

研究表明，成纖維細(xì)胞活化后可分泌大量膠原蛋白，是ECM 的主要來(lái)源。Guan 等研究缺血再灌注（IR）模型小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，外泌體敲除（腹腔注射外泌體抑制劑GW4869）的小鼠α-SMA、Ⅰ型膠原和FN 表達(dá)明顯降低，隨后的體外實(shí)驗(yàn)表明，缺氧條件下TEC 來(lái)源的外泌體miR-150 可啟動(dòng)成纖維細(xì)胞的增殖與活化，這可能是IR 腎臟外泌體促進(jìn)ECM 合成的機(jī)制之一。染色體顯性遺傳性多囊腎病（ADPKD）被認(rèn)為是最常見的單基因遺傳性腎病，主要由PKD1（占85%）或PKD2（占15%）突變引起，是ESRD 的重要病因之一。一項(xiàng)有關(guān)ADPKD 的研究顯示，在體外PKD1 缺失腎上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以激活成纖維細(xì)胞，促進(jìn)FN、α-SMA 和TGF-β mRNA 表達(dá)，導(dǎo)致ECM 的異常沉積，并發(fā)現(xiàn)可能通過miR-200s 和miR-21 靶向下調(diào)受體細(xì)胞PKD1 基因表達(dá)發(fā)揮作用。此外，用PKD1 突變細(xì)胞外泌體處理小鼠腎髓質(zhì)集合管細(xì)胞后，RT-qPCR 顯示囊性細(xì)胞miR 與外泌體miR 以及鄰近細(xì)胞miR 之間可能存在一個(gè)正反饋環(huán)，促使ADPKD 患者的囊腫生長(zhǎng)及腎纖維化的不斷進(jìn)展，外泌體作為運(yùn)輸miR 的“架橋”，是環(huán)路中不可缺少的部分。

TGF-β 是腎纖維化進(jìn)程中的關(guān)鍵因子，可通過Smad 依賴及非Smad 依賴信號(hào)通路介導(dǎo)COL1A1、COL4A1、基質(zhì)金屬蛋白酶和組織金屬蛋白酶抑制劑等下游信號(hào)的表達(dá)，調(diào)節(jié)ECM 的合成與降解，促進(jìn)纖維化進(jìn)程。最近越來(lái)越多的證據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄因子Sp1 對(duì)一些與纖維化相關(guān)的基因表達(dá)起著重要的調(diào)節(jié)作用，包括TGF-β 以及TGF-β 的下游靶標(biāo)。一項(xiàng)研究應(yīng)用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)狼瘡性腎炎（LN）患者尿外泌體中miR 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示miR-21 和miR-150 過表達(dá)，miR-29c 表達(dá)降低，并且這種表達(dá)特點(diǎn)與LN 患者RIF 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。將miR-150 和miR-21 模擬物轉(zhuǎn)染TEC，在TGF-β 刺激后，細(xì)胞中Sp1 的產(chǎn)生被抑制，同時(shí)誘導(dǎo)COL1A1、COL4A1、TGF-β 和Smad3 等促纖維化分子表達(dá)增加，表明miR-150 和miR-21 通過Smad3/TGF-β 途徑發(fā)揮促纖維化作用，而不依賴于Sp1。而用miR-29c 抑制劑轉(zhuǎn)染PTC，不僅促使纖維化分子明顯增加，亦促進(jìn)了Sp1 的產(chǎn)生，說(shuō)明miR-29c 可能通過Sp1 依賴的Smad3/TGF-β 通路抑制TEC 合成膠原蛋白。

目前有關(guān)RIF 的具體機(jī)制尚在研究中，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能量代謝失常在RIF 發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究還顯示，外泌體攜帶的環(huán)狀RNA（circRNA）TRPS1 可通過影響谷氨酰胺代謝促進(jìn)膀胱癌免疫微環(huán)境中CD8T 淋巴細(xì)胞的耗竭從而影響腫瘤進(jìn)展。因此，外泌體通過影響能量代謝參與RIF 或許是未來(lái)研究的新方向。

三、外泌體與RIF 診斷

尿液中的外泌體攜帶著來(lái)自親代細(xì)胞的不同分子物質(zhì)，代表腎單位不同部分的病理生理狀態(tài)。因此，尿液外泌體作為各種腎臟疾病診斷和預(yù)后評(píng)估的無(wú)創(chuàng)性潛在標(biāo)志物引起了廣泛關(guān)注。有研究比較了38 例CKD 患者和12 名正常人的尿液外泌體，結(jié)果顯示尿外泌體中miR-200b 的含量與患者腎功能及RIF 程度密切相關(guān)，提示它可能是一種新型無(wú)創(chuàng)的腎纖維化標(biāo)志物。同時(shí)有研究表明，尿液外泌體circ_0040507 結(jié)合血清PSA 在診斷前列腺癌方面有良好的應(yīng)用前景。雖然研究取得了一定的進(jìn)展，但尿液外泌體應(yīng)用于臨床仍有諸多障礙，其中主要限制因素是缺乏一種標(biāo)準(zhǔn)化的、易于操作的且適用于大樣本量常規(guī)篩查實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。目前有幾項(xiàng)研究正在尋求突破方法，嘗試在不使用超速離心法的情況下冷凍尿液和分離外泌體，相信在不久的將來(lái)，這些難關(guān)會(huì)被逐一攻克。

四、外泌體與RIF 治療

在治療方面，與細(xì)胞療法相比，外泌體能在起到治療效應(yīng)的同時(shí)不會(huì)引發(fā)細(xì)胞的自我增殖，從而降低腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。目前的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：①通過阻斷外泌體的產(chǎn)生或攝取，中斷外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞通信，延緩疾病發(fā)展進(jìn)程。②直接從細(xì)胞中分離天然外泌體進(jìn)行疾病治療。但上述2 種方式均存在著靶向性不足的問題，在發(fā)揮治療作用的同時(shí)可能會(huì)干擾人體正常的生理過程，從而導(dǎo)致難以估量的后果。③對(duì)天然外泌體進(jìn)行一定程度的改造，包括負(fù)載藥物、對(duì)親本細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)、在外泌體表面涂覆靶向抗體等，增強(qiáng)外泌體作用的靶向性。但如何將改造方法標(biāo)準(zhǔn)化、提高載藥效率以及實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)等問題仍未得到解決。

基于上述種種挑戰(zhàn)，以納米生物技術(shù)為基礎(chǔ)的AE 應(yīng)運(yùn)而生，并已經(jīng)在一些領(lǐng)域取得突破。Aday 等運(yùn)用微流控系統(tǒng)成功將let-7b-5p 導(dǎo)入基于脂質(zhì)納米粒的AE 中，并有效地將該miR 傳遞給內(nèi)皮細(xì)胞，從而促進(jìn)血管生成，提高了內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧環(huán)境中的存活率。此外，Li 等用介孔二氧化硅修飾的轉(zhuǎn)換納米顆粒負(fù)載辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA），然后包裹M1 型巨噬細(xì)胞衍生的外泌體膜，不僅實(shí)現(xiàn)靶向給藥，還克服了SAHA的不良藥代動(dòng)力學(xué)，從而發(fā)揮優(yōu)異的抗腫瘤作用，研究結(jié)果表明細(xì)胞膜包裹的仿生納米顆粒在藥物輸送系統(tǒng)中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。在另一項(xiàng)研究中，Zhang等將紅細(xì)胞和MCF-7 腫瘤細(xì)胞來(lái)源的雜交膜蛋白整合到磷脂雙分子層中構(gòu)建了第一個(gè)具有抗吞噬和靶向癌癥治療的仿生人工嵌合外泌體，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，與普通脂質(zhì)體相比，人工嵌合外泌體在體內(nèi)具有更高的腫瘤蓄積率、更低的截留率和更好的抗腫瘤治療效果，同時(shí)具有制備規(guī)?；?、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、載藥量高和功能定制化等特點(diǎn)。與其他載體系統(tǒng)相比，仿生外泌體的合成具有簡(jiǎn)便性，這種載藥方式可能是未來(lái)納米醫(yī)學(xué)發(fā)展的關(guān)鍵。目前AE 載藥方式已經(jīng)在抗腫瘤等領(lǐng)域取得一定進(jìn)展，但在腎臟疾病方面的研究還沒有完全展開，相信AE 也可以在RIF 的治療中發(fā)揮獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

五、總結(jié)與展望

RIF 作為腎臟疾病中廣泛存在的病理機(jī)制，一直是醫(yī)學(xué)工作者研究的重點(diǎn)，如何減緩RIF 進(jìn)程，改善預(yù)后是一項(xiàng)亟待解決的難題。在過去的十年里，廣泛的研究集中在基于各種細(xì)胞的方法來(lái)修復(fù)受損的腎實(shí)質(zhì)，包括多能祖細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等，然而該方法存在著諸多限制。在各種被提出的腎纖維化潛在治療方法中，外泌體作為一種無(wú)細(xì)胞治療方法逐步走入人們視線。隨著研究的深入，外泌體參與RIF 發(fā)生發(fā)展的機(jī)制逐漸被揭示。同時(shí)外泌體的特殊性質(zhì)，如生物相容性、選擇靶向性和可修飾性，也讓人們認(rèn)識(shí)到它在RIF診斷與治療方面的潛力。雖然外泌體的研究發(fā)展同樣面臨著許多挑戰(zhàn)，但筆者相信隨著科技的發(fā)展和研究的深入，外泌體將成為設(shè)計(jì)新一代RIF診斷與治療方法的重要工具。