進(jìn)樣量和信號(hào)強(qiáng)度對(duì)氣相色譜-燃燒-同位素比值質(zhì)譜測(cè)定δ13C和δ15N的影響

杜屹原，孟憲菁，楊 斌，宋 亮，朱光旭，周 曉，張嬡萍，潘 潔，江琳琳

(1.中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶森林生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 勐侖 666303；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，上海 201206；4.中國(guó)科學(xué)院核心植物園，云南 勐侖 666303；5.貴陽學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005；6.普洱學(xué)院，云南 普洱 665000；7.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧 沈陽 110866)

具備連續(xù)流進(jìn)樣技術(shù)的同位素比值質(zhì)譜(isotope ratio mass spectrometry, IRMS)具有自動(dòng)化程度高、分析速度快和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于地球化學(xué)[1-2]、環(huán)境科學(xué)[3-4]和食品科學(xué)[5-6]等領(lǐng)域。以往研究大多數(shù)基于元素分析(elemental analyzer)-同位素比值質(zhì)譜(EA-IRMS)聯(lián)機(jī)系統(tǒng)的快速燃燒原理，可對(duì)樣品總體碳(δ13C)、氮(δ15N)同位素進(jìn)行測(cè)定，極大地拓展了同位素技術(shù)的指示、示蹤和整合功能[7-8]。但是，由于研究對(duì)象在物種、時(shí)間和空間上的變化，導(dǎo)致了其體系內(nèi)部不同化合物代謝過程的差異性與復(fù)雜性，僅依賴總體同位素分析往往缺乏代表性和可信性，甚至可能造成分析過程的誤判。體系內(nèi)特定化合物通常具有較固定或明確的生物化學(xué)過程，針對(duì)特定化合物的同位素分析具有更好的指向性。盡管如此，目前的EA-IRMS無法檢測(cè)復(fù)雜體系中特定化合物的同位素組成。

氣相色譜-燃燒-同位素比值質(zhì)譜儀(GC-C-IRMS)聯(lián)機(jī)系統(tǒng)可對(duì)復(fù)雜體系中的不同化合物進(jìn)行色譜分離，依次燃燒轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的CO2或N2，實(shí)現(xiàn)特定化合物δ13C和δ15N的測(cè)定[5,9-10]，具有靈敏度高、檢測(cè)范圍寬和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)[9,11-14]。精度和準(zhǔn)確度是評(píng)價(jià)GC-C-IRMS性能的關(guān)鍵指標(biāo)，對(duì)于評(píng)價(jià)GC-C-IRMS對(duì)特定化合物的檢測(cè)能力具有重要意義[7,15-17]?？紤]到節(jié)省成本或待測(cè)樣品稀缺，目標(biāo)化合物濃度(或C、N元素含量)較低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致分析測(cè)試時(shí)進(jìn)樣量也較低。此外，某些化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的化合物在色譜柱上的保留時(shí)間接近，即使優(yōu)化色譜條件也可能無法使相鄰色譜峰間實(shí)現(xiàn)完全的基線分離，峰-峰交互干擾會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。為實(shí)現(xiàn)完全的基線分離，樣品進(jìn)樣量或由其轉(zhuǎn)化的CO2或N2信號(hào)強(qiáng)度應(yīng)盡量低。

GC-C-IRMS對(duì)微量化合物檢測(cè)的不確定性限制了特定化合物同位素分析技術(shù)的應(yīng)用?？Х纫?C8H10N4O2)是一種黃嘌呤生物堿有機(jī)化合物，因其化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，在GC-C-IRMS中可以完全地氣化、洗脫和燃燒轉(zhuǎn)化，可作為大多數(shù)特定化合物C、N同位素質(zhì)譜測(cè)定的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)[18]。氨基酸(RCHNH2COOH)是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單元，也是聯(lián)系生物界和非生物界的重要樞紐物質(zhì)，利用特定氨基酸C、N同位素技術(shù)可以精準(zhǔn)識(shí)別生態(tài)系統(tǒng)中不同生物的營(yíng)養(yǎng)級(jí)位置[19-20]。生物體內(nèi)氨基酸種類繁雜、濃度差異大，過高進(jìn)樣量會(huì)導(dǎo)致出峰時(shí)間接近的氨基酸化合物無法實(shí)現(xiàn)峰-峰完全分離，過低進(jìn)樣量會(huì)降低信噪比而影響δ13C和δ15N測(cè)量的精準(zhǔn)度。

基于此，迫切需要綜合評(píng)價(jià)進(jìn)樣量和信號(hào)強(qiáng)度對(duì)GC-C-IRMS測(cè)定δ13C和δ15N的影響。本工作擬以咖啡因化合物為研究對(duì)象，在保證δ13C和δ15N測(cè)定精準(zhǔn)度的前提下，探討GC-C-IRMS對(duì)進(jìn)樣量和信號(hào)強(qiáng)度變化的響應(yīng)特征，并結(jié)合多種氨基酸衍生物測(cè)定，揭示GC-C-IRMS測(cè)定復(fù)雜體系內(nèi)特定化合物δ13C和δ15N的性能表現(xiàn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

GC-C-IRMS聯(lián)機(jī)系統(tǒng)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，主要由TriPlus RSH自動(dòng)進(jìn)樣器、Trace 1310 GC氣相色譜儀、GC IsoLink Ⅱ燃燒轉(zhuǎn)化單元、ConFlo IV連續(xù)流通用接口和DELTA V Advantage同位素比值質(zhì)譜儀5部分組成。特定化合物通過TriPlus RSH自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)注入Trace 1310 GC，色譜分離后進(jìn)入GC IsoLink II燃燒轉(zhuǎn)化單元，經(jīng)過填裝Ni和Cu的微型氧化管燃燒轉(zhuǎn)化為CO2或N2氣體后進(jìn)入ConFlo Ⅳ連續(xù)流通用接口，再經(jīng)開口分流器引入DELTA V Advantage同位素比值質(zhì)譜儀。DELTA V Advantage可將CO2氣體電離為[12C16O2]+、[13C16O2]+和[12C16O18O]+，或?qū)2氣體電離為[14N2]+、[14N15N]+和[15N2]+，經(jīng)由通用三杯接收器采集和不同電阻值的放大器轉(zhuǎn)化為電壓信號(hào)后實(shí)現(xiàn)δ13C或δ15N的測(cè)定。

1.2 材料與試劑

將IAEA-600咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)產(chǎn)品)溶解于丙酮溶劑待測(cè)；丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、α-氨基丁酸(α-ABA)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、蛋氨酸(Met)、谷氨酸(Glu)和苯丙氨酸(Phe)共12種氨基酸及其混合物：純度≥ 99.9%，均為美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。氨基酸衍生化過程：首先將上述氨基酸混合物充分干燥后溶解于1 mL亞硫酰氯-異丙醇溶液(1∶4，V/V)中，于110 ℃酯化2 h；經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，再加? mL新戊酰氯-二氯甲烷溶液(1∶4，V/V)，于110 ℃?；? h；氮吹儀去除多余的衍生化試劑，最后將生成的O-異丙醇酯(NPP)衍生物溶解于0.5 mL二氯甲烷溶劑中待測(cè)[17,20]。使用USGS-40和USGS-41標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(美國(guó)地質(zhì)調(diào)查局產(chǎn)品)對(duì)CO2(純度99.995%)和N2(純度99.999%)工作標(biāo)氣(液化空氣上海有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行標(biāo)定。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息列于表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的同位素信息Table 1 Isotopic information of the standards

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 咖啡因和氨基酸混合物均采用TG-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)進(jìn)行分離，以高純氦氣(99.999%)為載氣。

咖啡因分析的色譜參數(shù)：載氣流速1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度260 ℃；程序升溫：起始溫度50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升溫至260 ℃，保持3 min，總時(shí)長(zhǎng)25 min。

氨基酸分析的色譜參數(shù)：載氣流速2 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫：起始溫度60 ℃，保持2.5 min，以15 ℃/min升溫至110 ℃后，立即以3 ℃/min升溫至150 ℃，再立即以6 ℃/min升溫至230 ℃，保持6 min，最后以25 ℃/min升溫至300 ℃，保持1 min，總時(shí)長(zhǎng)42.3 min。為保證不同氨基酸的色譜分離效果，每隔24 h進(jìn)行200～300 ℃梯度升溫烘烤約2 h以活化色譜柱。

1.3.2燃燒轉(zhuǎn)化單元 燃燒轉(zhuǎn)化溫度為1 000 ℃。為確保待測(cè)化合物充分燃燒轉(zhuǎn)化，分析咖啡因時(shí)，每隔7～10天注入O2約1 h以活化氧化管；分析氨基酸混合物時(shí)，每隔24 h注入O2約1 h以活化氧化管。測(cè)定δ15N時(shí)，須使用液態(tài)氮冷凍去除樣品燃燒產(chǎn)生的CO2氣體，防止[CO]+碎片離子對(duì)相同質(zhì)荷比的[N2]+分子離子造成干擾。

1.3.3質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源(EI)；加速電壓2.98 kV；發(fā)射電流1.50 mA；電子能量123.95 eV；引出電壓大于80%；質(zhì)譜真空度1.6×10-4Pa；識(shí)別起、止色譜峰的斜率0.2、0.4 mV/s；最小檢出信號(hào)20 mV；咖啡因δ13C和δ15N分析的本底值扣除方法采用Calc Mean BGD，即取出峰前5 s內(nèi)所有本底值(BGD)信號(hào)數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值；氨基酸δ13C和δ15N分析的本底值扣除方法采用Individual BGD，即取出峰前5 s內(nèi)最小的連續(xù)5個(gè)BGD信號(hào)數(shù)據(jù)點(diǎn)的移動(dòng)平均值。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1咖啡因測(cè)定 稱取IAEA-600咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配制成14種濃度(0.5～150 mg/L)的咖啡因-丙酮溶液，用于測(cè)定δ13C。采用不分流進(jìn)樣模式，進(jìn)樣體積1 μL?？Х纫?C8H10N4O2)C含量為49.44%，可以實(shí)現(xiàn)不同C質(zhì)量(0.25～74.16 ng)的柱上進(jìn)樣量。用同樣方法配制14種濃度(5～350 mg/L)的咖啡因-丙酮溶液用于δ15N測(cè)定，咖啡因N含量為28.86%，可以實(shí)現(xiàn)不同N質(zhì)量(1.44～101.01 ng)的柱上進(jìn)樣量?？Х纫驑?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度梯度信息列于表2。

表2 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度梯度信息Table 2 Concentration gradient of the caffeine standards

1.4.2氨基酸測(cè)定 為檢驗(yàn)信號(hào)強(qiáng)度對(duì)混合體系內(nèi)特定化合物δ13C測(cè)定的影響，以12種氨基酸混合物為研究對(duì)象，采用5種模式進(jìn)樣，即進(jìn)樣體積1 μL，不分流；進(jìn)樣體積0.2 μL，不分流；進(jìn)樣體積0.1 μL，不分流；進(jìn)樣體積0.5 μL，分流比10∶1；進(jìn)樣體積0.1 μL，分流比10∶1。前3種模式測(cè)試1次，后2種模式測(cè)試2次。

由于氨基酸N含量較低，且IRMS對(duì)N2的離子化效率較低[21]，若進(jìn)樣體積小于1 μL或采用分流模式，將導(dǎo)致N2信號(hào)強(qiáng)度過低而無法檢出。因此，本研究?jī)H采用進(jìn)樣體積為1 μL且不分流模式，每隔12 h測(cè)試1次上述氨基酸δ15N，共測(cè)試8次，以評(píng)價(jià)GC-C-IRMS對(duì)混合體系內(nèi)特定氨基酸δ15N測(cè)定的時(shí)間穩(wěn)定性。每種氨基酸的分子結(jié)構(gòu)由氣相色譜-同位素比值質(zhì)譜(GC-IRMS)[22]分析得到。

EA-IRMS是目前精準(zhǔn)測(cè)定樣品總體同位素最重要的系統(tǒng)之一，其測(cè)定結(jié)果常被作為公認(rèn)結(jié)果。EA-IRMS對(duì)δ15N的測(cè)定基于快速燃燒原理，將樣品在1 000 ℃高溫和過氧環(huán)境下瞬間燃燒，經(jīng)Cu還原形成N2等氣體，并通過除鹵除硫劑及H2O和CO2吸附劑，純化后的N2進(jìn)入IRMS測(cè)定。作為對(duì)比，基于EA-IRMS[15]對(duì)12種氨基酸δ15N進(jìn)行單獨(dú)測(cè)定，主要參數(shù)設(shè)定參考文獻(xiàn)[15,21]，每種氨基酸重復(fù)測(cè)定6次，交叉驗(yàn)證GC-C-IRMS與EA-IRMS對(duì)混合體系內(nèi)特定氨基酸δ15N測(cè)定結(jié)果的一致性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用GC-C-IRMS和EA-IRMS測(cè)量δ13C和δ15N時(shí)，需要使用CO2和N2工作標(biāo)氣進(jìn)行標(biāo)定，溯源至國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算公式如下：

δSpl-ST(‰)=δSpl-WG+δWG-ST+

δSpl-WG×δWG-ST× 10-3

式中，Spl表示咖啡因或氨基酸；WG表示工作標(biāo)氣；ST表示國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，如VPDB或Air-N2。工作標(biāo)氣δWG-ST采用兩點(diǎn)線性內(nèi)插法進(jìn)行校準(zhǔn)：使用USGS-40和USGS-41同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過EA-IRMS測(cè)量后建立標(biāo)準(zhǔn)值與測(cè)量值的線性方程，將工作標(biāo)氣初始值代入該方程后得到校準(zhǔn)后的δWG-ST，其δ13C和δ15N校準(zhǔn)值分別為(-30.36 ± 0.03)‰和(-1.27 ± 0.05)‰(n=5)。以上數(shù)據(jù)處理通過同位素比值質(zhì)譜儀專用軟件Isodat 3.0(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品)完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-C-IRMS測(cè)定咖啡因δ13C和δ15N

GC-C-IRMS測(cè)定IAEA-600咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)δ13C的進(jìn)樣量和信號(hào)強(qiáng)度響應(yīng)特征示于圖1。隨著進(jìn)樣C質(zhì)量從0.25 ng增加到74.16 ng時(shí)，CO2的信號(hào)強(qiáng)度由23 mV逐漸增大到7 706 mV。較低且穩(wěn)定的CO2本底值是保證小樣品量樣品δ13C測(cè)定精度和準(zhǔn)確度的重要前提[7]。本研究中，咖啡因δ13C產(chǎn)生的CO2本底值(BGD 44)平均為(3.8 ± 0.4) mV。測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)C質(zhì)量< 1 ng或m/z44信號(hào)<100 mV時(shí)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)樣品的檢測(cè)，但是過低的信噪比會(huì)導(dǎo)致咖啡因δ13C測(cè)定值精度較差；當(dāng)C質(zhì)量≥1 ng或m/z44信號(hào)≥100 mV時(shí)，咖啡因δ13C的測(cè)定精度和準(zhǔn)確度可達(dá)到實(shí)驗(yàn)室分析要求[5,12-13]，其平均精度為0.16‰，平均分析誤差為0.09‰。值得注意的是，即使C質(zhì)量高達(dá)70 ng或m/z44信號(hào)高達(dá)7 800 mV以上，該系統(tǒng)仍能保證δ13C的測(cè)定精準(zhǔn)度，表明在進(jìn)樣量較大時(shí)，GC-C-IRMS仍可將目標(biāo)化合物完全燃燒轉(zhuǎn)化。

圖1 GC-C-IRMS測(cè)定咖啡因δ13C的進(jìn)樣量(a)和信號(hào)強(qiáng)度(b)響應(yīng)特征Fig.1 Response of GC-C-IRMS on caffeine δ13C measurement to sample size (a) and signal intensity (b)

GC-C-IRMS測(cè)定IAEA-600咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)δ15N的進(jìn)樣量和信號(hào)強(qiáng)度響應(yīng)特征示于圖2。隨著進(jìn)樣N質(zhì)量從1.44 ng 增加到101.01 ng，N2信號(hào)強(qiáng)度由18 mV逐漸增大到1 926 mV。本研究測(cè)定δ15N時(shí)，本底值(BGD 28)平均為(38±4) mV。由于本底效應(yīng)的影響較大，而且IRMS對(duì)N2的離子化效率較低[21,23]，GC-C-IRMS在小樣品量條件下測(cè)定咖啡因δ15N時(shí)的精準(zhǔn)度相對(duì)δ13C略低。測(cè)定結(jié)果表明，只有當(dāng)N質(zhì)量≥ 5 ng或m/z28信號(hào)≥ 100 mV時(shí)，該系統(tǒng)對(duì)咖啡因δ15N的測(cè)定精度和準(zhǔn)確度才能滿足實(shí)驗(yàn)室測(cè)試要求[7,14-15]，其平均精度為0.27‰，平均分析誤差為0.13‰。當(dāng)進(jìn)樣量較大(N質(zhì)量≥100 ng)時(shí)，該系統(tǒng)仍然可以將目標(biāo)化合物中的N完全轉(zhuǎn)化為N2，并能夠保證δ15N的精準(zhǔn)度。

圖2 GC-C-IRMS測(cè)定咖啡因δ15N的進(jìn)樣量(a)和信號(hào)強(qiáng)度(b)響應(yīng)特征Fig.2 Response of GC-C-IRMS on caffeine δ15N measurement to sample size (a) and signal intensity (b)

2.2 GC-C-IRMS測(cè)定氨基酸混合體系δ13C

GC-C-IRMS測(cè)定12種氨基酸混合體系中δ13C的色譜圖示于圖3。由于氨基酸極性強(qiáng)、不易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差，在進(jìn)行GC-C-IRMS分析之前需要將其衍生化為弱極性、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好的氨基酸衍生物。測(cè)定結(jié)果表明，12種氨基酸的出峰時(shí)間在750～1 700 s之間，峰寬一般在10～15 s之間。每種特定氨基酸重復(fù)測(cè)量的出峰時(shí)間漂移一般不超過1 s，每種氨基酸m/z44的信號(hào)強(qiáng)度在100～1 000 mV之間，根據(jù)2.1節(jié)分析結(jié)果，上述12種氨基酸δ13C的測(cè)定精度和準(zhǔn)確度均可達(dá)到實(shí)驗(yàn)室分析要求。增加進(jìn)樣量有助于提高單一體系氨基酸δ13C的測(cè)定精準(zhǔn)度，但進(jìn)樣量過高會(huì)導(dǎo)致混合體系內(nèi)色譜保留時(shí)間相近的氨基酸不能實(shí)現(xiàn)完全的峰-峰分離。為確保每個(gè)特定化合物的色譜峰能夠完全基線分離，在滿足GC-C-IRMS實(shí)驗(yàn)室測(cè)試精準(zhǔn)度要求的前提下，由待測(cè)化合物轉(zhuǎn)化的CO2信號(hào)強(qiáng)度應(yīng)盡量低[5,10]。

注：1～4為CO2參比峰，5～16分別為丙氨酸、甘氨酸、α-氨基丁酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸的CO2樣品峰圖3 GC-C-IRMS測(cè)定混合體系中特定氨基酸δ13C的色譜圖Fig.3 Chromatogram of specific amino acid δ13C by GC-C-IRMS

GC-C-IRMS測(cè)定12種氨基酸混合體系中δ13C的信號(hào)強(qiáng)度依賴性特征示于圖4。氨基酸δ13C測(cè)定過程中CO2本底(BGD 44)值較低，其平均值為(7.0±7.5) mV。在不同進(jìn)樣模式下，12種氨基酸的m/z44信號(hào)強(qiáng)度主要在50～5 000 mV范圍內(nèi)呈梯度變化。其中，甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸的m/z44信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)低于50 mV的情況，α-氨基丁酸、天冬氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸的m/z44信號(hào)強(qiáng)度可達(dá)3 000 mV以上。當(dāng)m/z44信號(hào)強(qiáng)度≥ 100 mV，上述12種氨基酸δ13C的測(cè)定值依次為(-22.73 ± 0.85)‰、(-29.56 ± 0.85)‰、(-25.44 ± 0.99)‰、(-21.37 ± 0.32)‰、(-21.44 ± 0.73)‰、(-21.96 ± 0.31)‰、(-24.28 ± 0.35)‰、(-24.14 ± 0.62)‰、(-23.80 ± 0.58)‰、(-27.56 ± 0.50)‰、(-6.89 ± 0.21)‰和(-18.94 ± 0.44)‰，δ13C測(cè)定結(jié)果的平均精度為0.56‰，且未表現(xiàn)出對(duì)m/z44信號(hào)強(qiáng)度的依賴性(斜率接近0)?？梢?，GC-C-IRMS可以實(shí)現(xiàn)對(duì)混合體系中特定氨基酸δ13C的有效測(cè)定。需要注意的是，氨基酸衍生化過程中會(huì)引入新的碳源，GC-C-IRMS測(cè)定氨基酸衍生物δ13C后，可依據(jù)同位素質(zhì)量守恒原理扣除外源碳δ13C所占權(quán)重，得到氨基酸δ13C校準(zhǔn)值[22]。

圖4 GC-C-IRMS測(cè)定混合體系中特定氨基酸δ13C的信號(hào)強(qiáng)度依賴性特征Fig.4 Signal intensity dependence of specific amino acid δ13C by GC-C-IRMS

2.3 GC-C-IRMS測(cè)定氨基酸混合體系δ15N

GC-C-IRMS測(cè)定12種氨基酸混合體系中δ15N的色譜圖示于圖5。12種氨基酸的出峰時(shí)間在750～1 700 s之間，峰寬一般在15～25 s之間。每種特定氨基酸重復(fù)測(cè)量的出峰時(shí)間漂移為3 s左右，每種氨基酸樣品峰對(duì)應(yīng)的本底值(BGD 28)約為50 mV。僅絲氨酸產(chǎn)生的m/z28信號(hào)強(qiáng)度略低于100 mV，其余11種氨基酸的m/z28信號(hào)強(qiáng)度均在100～400 mV之間，能夠保證氨基酸δ15N的分析精準(zhǔn)度。為實(shí)現(xiàn)氨基酸峰-峰之間的最佳基線分離，由樣品轉(zhuǎn)化的N2信號(hào)強(qiáng)度同樣不應(yīng)過高。需要指出的是，氨基酸δ15N測(cè)定過程中，m/z28信號(hào)強(qiáng)度會(huì)受到GC-C-IRMS使用年限以及衍生化方式等因素影響[9-10,16,20]。

注：1～4為N2參比峰，5～16分別為丙氨酸、甘氨酸、α-氨基丁酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸的N2樣品峰圖5 GC-C-IRMS測(cè)定混合體系中特定氨基酸δ15N的色譜圖Fig.5 Chromatogram of amino acid δ15N by GC-C-IRMS

GC-C-IRMS測(cè)定12種氨基酸混合體系中δ15N與EA-IRMS單獨(dú)測(cè)定的一致性特征示于圖6。GC-C-IRMS在較低檢測(cè)信號(hào)(即較低柱上進(jìn)樣量)條件下對(duì)特定氨基酸δ15N測(cè)定結(jié)果表明，12種氨基酸δ15N連續(xù)4天(間隔12 h)的測(cè)定值依次為(40.52±1.04)‰、(-25.51±1.05)‰、(8.17±0.57)‰、(0.46±0.91)‰、(1.90±0.89)‰、(-1.99±0.97)‰、(-0.92±1.13)‰、(1.86±1.50)‰、(4.31±1.33)‰、(-2.48±0.92)‰、(43.63±0.63)‰和(3.15±0.57)‰，平均精度為0.96‰。GC-C-IRMS對(duì)混合體系內(nèi)12種氨基酸δ15N測(cè)定結(jié)果與EA-IRMS單獨(dú)測(cè)定結(jié)果相當(dāng)，平均偏差僅為(0.77±0.34)‰，2種方法的氨基酸δ15N測(cè)定值具有較高的一致性(R2=0.997)，驗(yàn)證了GC-C-IRMS測(cè)定混合體系中氨基酸δ15N的可信性。GC-C-IRMS具有高靈敏度、寬檢測(cè)范圍和極低耗樣量等優(yōu)勢(shì)[5,9,12]，將為特定化合物同位素技術(shù)在地球化學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)揮重要作用。

圖6 GC-C-IRMS與EA-IRMS測(cè)定氨基酸δ15N的對(duì)比Fig.6 Comparison of amino acid δ15N by GC-C-IRMS and EA-IRMS

3 結(jié)論

本研究基于GC-C-IRMS系統(tǒng)測(cè)定了咖啡因化合物和氨基酸混合體系中δ13C和δ15N。結(jié)果表明，在極小進(jìn)樣量和極低信號(hào)強(qiáng)度的情況下，該系統(tǒng)對(duì)于測(cè)定δ13C和δ15N具有良好的精準(zhǔn)度。在對(duì)氨基酸混合體系δ13C和δ15N的測(cè)定過程中，GC-C-IRMS可保證m/z44和m/z28具有足夠的信號(hào)強(qiáng)度并避免了峰-峰交互干擾現(xiàn)象。在不同進(jìn)樣模式下，12種特定氨基酸δ13C測(cè)定值為-29.56‰～-6.89‰，平均測(cè)定精度為0.56‰。在較低檢測(cè)信號(hào)條件下，GC-C-IRMS可以保證氨基酸δ15N測(cè)定結(jié)果具有良好的時(shí)間重現(xiàn)性，與EA-IRMS測(cè)定結(jié)果的平均偏差為0.77‰。

致謝：感謝中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)張忠義博士對(duì)本研究中氨基酸樣品前處理及其同位素測(cè)定提供的幫助。