不同酶切方式引發(fā)大豆蛋白構(gòu)象變化及功能特性評(píng)價(jià)

鄭環(huán)宇， 趙曉明， 張 夢(mèng)， 孫遠(yuǎn)達(dá)， 和銘鈺， 李 楊， 滕 飛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030) (黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院2，哈爾濱 150028) (國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心3，哈爾濱 150000)

大豆是世界重要糧食作物之一，因其高蛋白、低脂肪含量及低生產(chǎn)成本成為優(yōu)質(zhì)蛋白來源[1]。大豆蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，持水性、凝膠性等加工特性應(yīng)用廣泛，但大豆蛋白易受環(huán)境影響，溶解性及抗氧化性能較差[2]，限制其作為低成本、高品質(zhì)乳化劑在食品加工中的應(yīng)用。酶促水解是改善大豆蛋白利用率的有效途徑，其通過酶催化作用將蛋白分解成小分子物質(zhì)，作用條件溫和，保護(hù)蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，有效降低大豆蛋白致敏性，提高功能特性，是一種極具潛力的蛋白改性方法。

蛋白酶法改性過程受酶水解時(shí)間、pH、溫度及酶的專一性等因素影響，其中酶的專一性是影響肽的數(shù)目及相應(yīng)的酶切位點(diǎn)的關(guān)鍵因素之一，不同酶水解獲得蛋白水解物的乳化性及其抗氧化性對(duì)蛋白乳化劑在加工中的影響不可忽視。依據(jù)蛋白酶活性中心關(guān)鍵性氨基酸可將其分為4類，即絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶及天門冬氨酸蛋白酶[3]?？莶輻U菌堿性蛋白酶及胰蛋白酶均為常見絲氨酸蛋白酶，其活性中心處絲氨酸內(nèi)部的親核基團(tuán)常與底物親電基團(tuán)發(fā)生共價(jià)催化，產(chǎn)物功能特性得到顯著改善。大豆蛋白經(jīng)枯草桿菌絲氨酸蛋白酶水解后，其乳化性、起泡性及表面疏水特性均有改善[4]。大豆蛋白經(jīng)胰蛋白酶進(jìn)行部分肽鍵斷裂，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子展開成多肽鏈，暴露埋藏于蛋白內(nèi)部的具有抗氧化性氨基酸殘基，發(fā)揮其清除自由基能力[2]。胰蛋白酶與胃蛋白酶及堿性蛋白酶2.4 L FG水解大豆蛋白獲得的水解產(chǎn)物相比具有最高的ABTS+清除活性，且與水解時(shí)間不相關(guān)[5]。菠蘿蛋白酶的活性中心為半胱氨酸，其通過內(nèi)部富含電子的基團(tuán)攻擊底物親電子基團(tuán)，進(jìn)而發(fā)揮共價(jià)催化作用。經(jīng)菠蘿蛋白酶處理黑豆蛋白水解產(chǎn)物能顯著抑制亞油酸體系中過氧化物形成，增強(qiáng)水包油乳液氧化穩(wěn)定性，可以作為食品中天然抗氧化劑成分[6]。金屬蛋白酶類常以酶原形式出現(xiàn)，其活性中心處保留定量金屬離子，既可以維持酶活性，又參與金屬催化反應(yīng)，促進(jìn)底物在反應(yīng)中正確定向?？莶輻U菌中性蛋白酶作為典型的金屬蛋白酶，其斷裂由疏水性大分子的氨基酸的羧基形成的肽鍵[3]，將大分子蛋白分解為小分子肽段，改善溶解度，降低黏度，提升性能及生物效價(jià)[4]。胃蛋白酶為活性中心含天門冬氨酸的酸性內(nèi)切蛋白酶，內(nèi)部?jī)蓚€(gè)天門冬氨酸殘基交替充當(dāng)酸堿催化劑，進(jìn)行酸堿催化反應(yīng)。經(jīng)胃蛋白酶水解制得大豆蛋白水解產(chǎn)物中β亞基相對(duì)組成最高，顯示出良好的混合乳液穩(wěn)定性和快速融化速率[7]。酶的專一性是影響產(chǎn)物功能特性的重要因素，但有關(guān)酶的專一性對(duì)大豆蛋白功能特性的影響及其與構(gòu)象變化相關(guān)性的研究還有待探索。

本實(shí)驗(yàn)以5種商用酶制劑(枯草桿菌堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶)水解大豆蛋白產(chǎn)物為研究對(duì)象，對(duì)水解產(chǎn)物的理化指標(biāo)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞基組成進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)其乳化性、抗氧化性進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在揭示酶的專一性引起的水解產(chǎn)物構(gòu)象變化與功能特性間的關(guān)系，為制備高抗氧化性大豆蛋白乳化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(SPI)，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.45%；枯草桿菌堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型分析天平，PL303型電子天平，HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，JJ-1型精密增力電動(dòng)攪拌器，PHS-3C型雷磁pH計(jì)，S22-2型恒溫磁力攪拌器，TDL-408型臺(tái)式離心機(jī)，F(xiàn)-4500型熒光分光光度計(jì)，Mini-PROTEAN Trtra型垂直電泳槽，MAGNA-IR560型傅里葉紅外光譜儀。

1.3 方法

1.3.1 大豆蛋白水解物制備

參照Zheng等[8]的方法略作修改，使用去離子水配制5%(W/V)SPI溶液，于90 ℃加熱5 min，酶底物質(zhì)量比為1∶50，pH值及水解溫度設(shè)置為酶最適pH值及最適水解溫度(具體數(shù)值見表1)，以保證酶充分發(fā)揮作用，水解時(shí)間設(shè)置為4 h。水解4 h后，水解產(chǎn)物置于90 ℃水浴鍋中進(jìn)行10 min滅酶處理。溶液冷卻后調(diào)節(jié)pH至中性，并于冷凍高速離心機(jī)中以10 000×g和4 ℃離心15 min，所得上清液置于冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，既得水解產(chǎn)物?？莶輻U菌堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶獲得的水解產(chǎn)物分別簡(jiǎn)稱為Alc-SPIH、Bro-SPIH、Neu-SPIH、Pep-SPIH、 Try-SPIH，經(jīng)杜馬斯定氮儀測(cè)定，其蛋白純度分別約為(94.98±0.12)%、(88.73±0.11)%、(86.39±0.04)%、(82.38±0.21)%、(91.84±0.13)%。

1.3.2 蛋白水解度測(cè)定

依據(jù)NIELSEN等[9]的方法，采用鄰苯二甲醛(Ortho-phthalaldehyde，OPA)法進(jìn)行水解度測(cè)定。取冷凍干燥后粉末用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4)配制為1 mg/mL蛋白溶液，將400 μL上述溶液與3 mLOPA試劑充分混合2 min，并使用光譜儀于340 nm處測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品測(cè)定3次平行后根據(jù)下式計(jì)算水解度(DH)。

式中：htot為肽鍵總數(shù)，等于7.8[10]；h為水解鍵數(shù)目

1.3.3 溶解度的測(cè)定

參考郭榮佳[4]的方法稍作修改進(jìn)行溶解度的測(cè)定。將蛋白粉末溶于去離子水中，使其質(zhì)量濃度為5 mg/mL，適當(dāng)稀釋后采用微量凱氏定氮法測(cè)定上清液蛋白含量。溶解度表示為上清液中蛋白含量占總蛋白含量的比例。

1.3.4 濁度的測(cè)定

參照J(rèn)ean等[11]的方法測(cè)定蛋白質(zhì)濁度，將大豆蛋白水解物稀釋成3 mg/mL，用漩渦振蕩器混合均勻后，于波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定水解物吸光度，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)后取平均值，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.5 SDS-PAGE凝膠電泳

參考施蒙[12]的方法稍作調(diào)整，將不同酶水解大豆蛋白水解物采用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4)稀釋為2 mg/mL，在25 ℃下孵育1 h后，沸水中煮沸5 min，嚴(yán)格按照分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%、濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%配制電泳膠，上樣量為10 μL，保持初始電壓80 V約1 h，待樣品進(jìn)入分離膠上沿，調(diào)整電壓至120 V直至電泳結(jié)束。利用固定液染色0.5～1 h后，使用考馬斯亮藍(lán)R-250染色3～4 h，隨后脫色液進(jìn)行脫色直至條帶清晰。脫色完成后，采用Gel Doc EZ imager型凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶。

1.3.6 疏水性氨基酸濃度測(cè)定

采用自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定疏水性氨基酸濃度。儀器特制水解管內(nèi)加入20 mg樣品及8 mL濃度為6 mol/L的純鹽酸，抽真空條件下封口，于110 ℃條件下水解24 h，待水解完成，用雙層濾紙過濾，置于真空干燥器中蒸干并用緩沖液溶解，待儀器測(cè)定使用[13]。

疏水性氨基酸濃度=

1.3.7 紫外吸收光譜測(cè)定

依據(jù)Du等[14]的方法，將樣品稀釋后使用紫外-可見分光光度計(jì)在200～800 nm范圍內(nèi)測(cè)定紫外吸收光譜。所有樣品均在室溫下制備并測(cè)定。

1.3.8 熒光光譜測(cè)定

參照Sun等[15]的熒光光譜測(cè)定方法，樣品稀釋到質(zhì)量濃度為2 mg/mL，設(shè)置參數(shù)為：激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為290～450 nm，掃描速度為100 nm/min，激發(fā)波長(zhǎng)狹縫和發(fā)射波長(zhǎng)狹縫均為5 nm。每種樣品測(cè)定3次，所有試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

利用溴化鉀壓片法測(cè)定傅里葉紅外光譜。將冷凍干燥后的大豆蛋白水解物與適量溴化鉀充分研磨，實(shí)驗(yàn)波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，波數(shù)精度0.01 cm-1，掃描次數(shù)64次，環(huán)境溫度25 ℃。利用Peakfit Version 4.0軟件對(duì)譜帶范圍1 600～1 700 cm-1擬合，確定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。以透射率為縱坐標(biāo)，以波數(shù)為橫坐標(biāo)繪圖[16]。

1.3.10 乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)測(cè)定

參考Molina等[17]的方法稍作修改測(cè)定蛋白酶解物樣品的乳化活性指數(shù)(Emulsifying activity index，EAI)及乳化穩(wěn)定性指數(shù)(Emulsifying stability index，ESI)，配制1%蛋白溶液100 mL，吸取75 mL蛋白溶液與25 mL大豆油充分混合，利用高速均質(zhì)機(jī)在10 000 r/min下均質(zhì)2 min，在0、30 min時(shí)分別從燒杯底部吸取20 μL乳狀液，加入至5 mL 0.1%的SDS溶液中混合均勻，并在500 nm波長(zhǎng)下，以0.1%的SDS溶液為空白樣品，測(cè)定水解產(chǎn)物吸光值。根據(jù)式(1)和式(2)計(jì)算EAI和ESI。

(1)

(2)

式中：N為稀釋倍數(shù)；c為乳化液未形成前蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量濃度/g/mL；φ為乳化液中油相體積分?jǐn)?shù)/%；t為間隔時(shí)間/min；A0為0 min時(shí)吸光度；A30為30 min時(shí)吸光度。

1.3.11 ABTS+自由基清除活性

將7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的K2S2O8溶液等體積混合并在室溫避光條件下靜置12～16 h，將混合液以磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.4)稀釋至734 nm處吸光度為0.70±0.02，吸取4.0 mL上述形成的ABTS+測(cè)定液，加入100 μL樣品溶液，待充分混勻后測(cè)定在734 nm處的吸光值[18]。按式(3)計(jì)算ABTS自由基清除率

(3)

式中：A0為ABTS+測(cè)定液于734 nm處的吸光度；A1為ABTS+測(cè)定液和樣品混合后于734 nm處的吸光度；A2為樣品于734 nm處的吸光度。

1.3.12 DPPH自由基清除活性

參考Zhou等[19]的方法，配制20 μmol/L的DPPH乙醇溶液并保存在暗處備用。將樣品稀釋至其吸光值在0.7以下。取1 ml DPPH乙醇溶液與2 mL(1 mg/ml)的樣品溶液在暗處混合均勻，充分反應(yīng)30 min后，測(cè)定其在517 nm處的吸光值，平行實(shí)驗(yàn)3次。按式(4)計(jì)算DPPH自由基清除率：

(4)

式中：AC為DPPH測(cè)定液于517 nm處的吸光度；AS為DPPH測(cè)定液和樣品混合后于517 nm處的吸光度；AB為樣品于517 nm處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行、重復(fù)測(cè)定3次，采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，通過SPSS 24.0進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，Peakfitting 4.12軟件對(duì)紅外吸收曲線進(jìn)行擬合處理，使用origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度、溶解度與濁度分析

蛋白質(zhì)酶解作用分為輕度酶解和深度酶解，現(xiàn)多用水解度作為產(chǎn)物特性的衡量指標(biāo)之一。結(jié)合蛋白酶不同作用位點(diǎn)可知，如在每種酶的最適pH、最適溫度及相同底物特性條件下，酶解程度由大到小依次為：菠蘿蛋白酶、枯草桿菌堿性蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶。表1顯示不同酶切方式下水解產(chǎn)物水解度及濁度間差異。Bro-SPIH和Alc-SPIH水解度無顯著差異且分別可達(dá)到(14.08±0.02)%和(14.07±0.21)%，其主要原因?yàn)榇蠖沟鞍自谥行约皦A性環(huán)境中溶解度明顯大于酸性環(huán)境，且pH位于7.0附近時(shí)，大豆蛋白溶解度可達(dá)到90%以上，酶與蛋白間相互作用得到極大提升?？莶輻U菌中性蛋白酶水解環(huán)境同樣為中性環(huán)境，蛋白溶解度增大，但其作用位點(diǎn)不及菠蘿蛋白酶作用位點(diǎn)寬泛，因此水解度為(12.36±0.16)%。胰蛋白酶水解產(chǎn)物Try-SPIH水解度最低，為(3.96±0.02)%，這與江連洲等[20]的研究結(jié)果一致，這可能是由于蛋白中胰蛋白酶抑制劑的作用。

溶解度及濁度變化如表1所示。酶解促進(jìn)蛋白結(jié)構(gòu)展開，由于蛋白質(zhì)間存在疏水相互作用、二硫鍵及靜電相互作用等作用力，會(huì)對(duì)酶解后蛋白聚集方式產(chǎn)生影響[12]。濁度可以間接反映蛋白水解物聚集狀態(tài)。研究表明經(jīng)過4 h酶解處理產(chǎn)物濁度值均小于SPI濁度值，趙沙沙等[21]指出酶反應(yīng)到一定階段后，酶降解蛋白及肽段聚集體速率大于肽聚集速率是濁度下降的主要原因。此外，溶解度情況也是濁度變化的重要原因，如表1所示，SPI溶解度顯著低于水解產(chǎn)物溶解度，內(nèi)部大顆粒物質(zhì)懸浮，濁度值可達(dá)到0.74±0.00。水解產(chǎn)物中Try-SPIH濁度值最大為0.17±0.02，這可能是由于大豆蛋白中胰蛋白酶抑制劑的存在有效抑制蛋白水解，蛋白水解程度及溶解度均較低，光線在溶液中的漫反射程度較大，導(dǎo)致濁度值最大。

表1 不同酶切方式下蛋白水解度及濁度差異

2.2 SDS-PAGE凝膠電泳分析

SPI主要由大豆球蛋白(11S)和β-伴大豆球蛋白(7S)組成，其中11S由酸性亞基A(29～33 ku)和堿性亞基B(22 ku)經(jīng)過二硫鍵結(jié)合而成，7S則是由α(63 ku)，α′(67～72 ku)，β(47 ku)3種亞基通過非共價(jià)鍵連接而成[22]。為解析酶解作用效果、水解產(chǎn)物亞基組成，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。圖1為SPI及不同酶解條件下蛋白水解物的SDS-PAGE凝膠電泳圖。與SPI相比，水解產(chǎn)物均發(fā)生不同程度的降解，且組成β-伴大豆球蛋白的α，α′，β這3種亞基均基本被降解，這可能是因?yàn)楦鞣N蛋白酶優(yōu)先酶解7S組分[4]。其中Neu-SPIH、Pep-SPIH及Try-SPIH對(duì)應(yīng)于SPI酸性亞基A和堿性亞基B條帶處強(qiáng)度均有不同程度降低，Alc-SPIH和Bro-SPIH相應(yīng)酸性亞基A處條帶則徹底消失，生成小分子肽段，這是由于蛋白酶先酶解處于蛋白外部的酸性亞基A，因此位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的堿性亞基B不易進(jìn)行水解[24]。由圖1可得出，枯草桿菌堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解程度大于其他3種酶類，這也印證了水解度測(cè)定結(jié)果正確性。

圖1 不同酶切方式下蛋白水解物的SDS-PAGE凝膠電泳圖

2.3 疏水性氨基酸濃度分析

疏水性氨基酸為側(cè)鏈具有高疏水性氨基酸的總稱。采用自動(dòng)氨基酸分析儀監(jiān)測(cè)不同酶切方式下疏水性氨基酸濃度變化，用于評(píng)估酶作用位點(diǎn)對(duì)蛋白氨基酸組成的影響，且與蛋白功能特性密切相關(guān)。如圖2所示，SPI疏水性氨基酸包裹于球狀蛋白內(nèi)部，較水解樣品疏水性氨基酸濃度呈現(xiàn)最小值，這是由于水解產(chǎn)物制備過程中經(jīng)過離心除去大分子雜質(zhì)，蛋白溶解度得到顯著提升，疏水性氨基酸較SPI得到較大程度保留，從而疏水性氨基酸濃度均高于SPI樣品溶液。隨著酶切方式的改變，酶特異性作用位點(diǎn)導(dǎo)致酶解作用效果最強(qiáng)的菠蘿蛋白酶水解產(chǎn)物疏水性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)最高值(27.10±0.08)%?？莶輻U菌堿性蛋白酶和胃蛋白酶主要水解含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)或類似苯環(huán)結(jié)構(gòu)的芳香族氨基酸形成的肽鍵，且芳香族氨基酸多為疏水性氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，因此這兩種酶水解產(chǎn)物中疏水性氨基酸含量較高。胰蛋白酶水解產(chǎn)物疏水性氨基酸所占濃度呈現(xiàn)最低值，可能由兩個(gè)原因?qū)е拢环矫?，胰蛋白酶抑制劑限制蛋白展開，水解程度受到抑制，導(dǎo)致疏水性氨基酸比例降低，這可以通過水解度的測(cè)定結(jié)果來證明；另一方面，胰蛋白酶主要作用于賴氨酸/精氨酸(Lys/Arg)的羧基端，作用位點(diǎn)限制其疏水性氨基酸含量。

圖2 不同酶切方式下蛋白水解物的疏水性氨基酸濃度變化

2.4 紫外吸收光譜分析

圖3為SPI及大豆水解產(chǎn)物的紫外吸收光譜圖。大豆蛋白的紫外吸收主要來自色氨酸和酪氨酸殘基所在側(cè)鏈基團(tuán)，其次來自苯丙氨酸、組氨酸、苯丙氨酸殘基的側(cè)鏈[24]。由圖3可知，與SPI相比，所有大豆蛋白水解產(chǎn)物峰值均向長(zhǎng)波方向紅移，表明大豆蛋白空間構(gòu)象發(fā)生變化，蛋白質(zhì)內(nèi)部部分分子鍵斷裂，造成特征峰移動(dòng)[25]。在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，大豆蛋白具有相似的紫外吸收光譜形狀，但水解產(chǎn)物其吸收強(qiáng)度與SPI相比均有明顯增強(qiáng)，該結(jié)果表明埋藏于分子內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸經(jīng)蛋白酶作用后暴露于外部[26]。

圖3 不同酶切方式下蛋白水解物的紫外光譜圖

2.5 熒光光譜分析

為探究不同酶切方式對(duì)大豆蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，測(cè)定SPI及其水解產(chǎn)物熒光光譜變化，如圖4所示。大豆蛋白熒光吸收主要來自蛋白內(nèi)色氨酸殘基，因此熒光變化可直接反映色氨酸殘基及其微環(huán)境變化，進(jìn)一步確定大豆蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)變化情況[27]。研究表明，最大熒光波長(zhǎng)與色氨酸殘基存在微環(huán)境存在相關(guān)性，λmax小于330 nm和大于330 nm分別代表色氨酸殘基位于非極性和極性環(huán)境中[27, 28]。圖4表明，酶解處理后的Alc-SPIH、Bro-SPIH、Neu-SPIH、Pep-SPIH及Try-SPIH的λmax分別為351、346、346、344、339 nm，由此可知不同酶切方式下處理大豆蛋白水解物色氨酸殘基均存在于蛋白質(zhì)極性環(huán)境中，表明酶解處理改變蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)及構(gòu)象，埋藏在內(nèi)部的色氨酸殘基暴露于蛋白質(zhì)外部環(huán)境。與未處理樣品比較可知，酶解處理樣品熒光光譜峰值向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向發(fā)生移動(dòng)，同時(shí)酶解處理均對(duì)SPI產(chǎn)生了熒光淬滅，可能是因?yàn)槊附獯龠M(jìn)蛋白結(jié)構(gòu)展開，疏水氨基酸暴露，疏水相互作用增強(qiáng)，導(dǎo)致肽段部分聚集，進(jìn)而使SPI發(fā)生熒光淬滅[21]。

圖4 不同酶切方式下蛋白水解物的熒光光譜圖

2.6 傅里葉變換紅外光譜分析

圖5為SPI及不同酶切方式下大豆蛋白水解產(chǎn)物的紅外光譜(FT-IR)圖。經(jīng)過不同酶切方式處理，蛋白樣品3 305.39 cm-1及1 654.63 cm-1左右的峰寬變窄、峰強(qiáng)增強(qiáng)，可知SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。其中酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)是大豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)研究的主要范圍，判斷紅外峰值與二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)關(guān)系：1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1為β-折疊結(jié)構(gòu)；1 646～1 664 cm-1為α-螺旋結(jié)構(gòu)；1 637～1 645 cm-1為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；1 664～1 681 cm-1為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。確定各樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量，整理結(jié)果見表2。大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊為主，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(34.22±0.04)%，β-轉(zhuǎn)角質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(23.24±0.04)%，α-螺旋質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(25.63±0.06)%，無規(guī)則卷曲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(16.91±0.03)%。總體而言，酶解處理降低α-螺旋及β-折疊含量，向β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。α-螺旋及β-折疊結(jié)構(gòu)中有較多氫鍵，是維持蛋白剛性結(jié)構(gòu)的重要來源，若二者比例下降，則蛋白柔性結(jié)構(gòu)單元增多，肽段間自由度增大，形成松散有序結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)變化與酶切位點(diǎn)密切相關(guān)，枯草桿菌堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶及枯草桿菌中性蛋白酶作用位點(diǎn)主要為疏水性氨基酸殘基，且疏水性氨基酸殘基主要包埋于蛋白內(nèi)部α-螺旋及β-折疊結(jié)構(gòu)中，因此其水解產(chǎn)物形成明顯柔性結(jié)構(gòu)單元。

圖5 不同酶切方式下蛋白水解物的紅外光譜圖

表2 不同酶解蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量

2.7 乳化活性指數(shù)(EAI)與乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)評(píng)價(jià)

圖6為不同酶解條件對(duì)大豆蛋白乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)的影響。EAI值反映了蛋白質(zhì)在油和水界面吸附的能力，而ESI值則表明蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。如圖6所示，SPI由于其低溶解度嚴(yán)重限制其乳化性。酶解有效促進(jìn)SPI構(gòu)象變化，通過酶切位點(diǎn)的變化，乳化性得到不同程度提升。酶切位點(diǎn)最廣泛的菠蘿蛋白酶EAI及ESI相較于SPI均顯著增加(P<0.05)，這主要是因?yàn)榈鞍變?nèi)部疏水性氨基酸暴露，電荷數(shù)目增加，抑制油滴間相互靠近聯(lián)結(jié)，進(jìn)而乳化性得到提高。水解程度最低的胰蛋白酶水解產(chǎn)物呈現(xiàn)優(yōu)異乳化特性[29, 30]，主要是因?yàn)榇蠖怪幸鹊鞍酌敢种苿┮种频鞍走^度水解，提升蛋白溶解度同時(shí)，肽段長(zhǎng)度適宜穩(wěn)定包裹油滴，因此其EAI及ESI均滿足乳液要求。

圖6 不同酶切方式對(duì)蛋白乳化活性指數(shù)及乳化穩(wěn)定性指數(shù)的影響

2.8 ABTS+與DPPH自由基清除活性評(píng)價(jià)

ABTS自由基有機(jī)溶劑呈無色狀態(tài)，易被各種試劑氧化，生成藍(lán)綠色自由基陽離子ABTS+并通常在734 nm處有最大吸收峰，廣泛用于抗氧化活性測(cè)定。酶解大豆蛋白樣品ABTS+自由基清除率如圖7所示。大豆分離蛋白ABTS+自由基清除率為(35.30±0.05)%，各酶解產(chǎn)物自由基清除率均高于SPI。結(jié)果表明，酶處理可有效提高大豆分離蛋白ABTS+自由基清除率，增強(qiáng)抗氧化活性。這種作用可能歸因于酶解對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，蛋白酶促進(jìn)蛋白質(zhì)解折疊，形成柔性結(jié)構(gòu)單元，為蛋白酶提供更多作用位點(diǎn)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解成肽段。各水解產(chǎn)物ABTS+自由基清除率的差異可能來源于酶作用位點(diǎn)和水解度的影響。部分酶酶解釋放疏水性氨基酸殘基，改變?nèi)芤何h(huán)境，不易于水溶性ABTS反應(yīng)，導(dǎo)致ABTS+自由基清除率較低。DPPH溶液穩(wěn)定狀態(tài)呈紫色，遇抗氧化劑轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，并于517 nm處有最大吸收峰。SPI的DPPH自由基清除率為(61.99±0.07)%，各水解產(chǎn)物DPPH自由基清除率相似且無顯著差異。推測(cè)原因是蛋白酶切割位點(diǎn)的影響，造成具有DPPH自由基清除活性肽段的釋放。

圖7 不同酶切方式對(duì)蛋白ABTS+與DPPH自由基清除活性的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)比對(duì)SPI與不同酶切方式下蛋白水解度、溶解度、濁度、SDS-PAGE凝膠電泳、疏水性氨基酸濃度、紫外吸收光譜、熒光光譜及傅里葉紅外光譜間的差異，并針對(duì)乳化性及抗氧化性進(jìn)行評(píng)價(jià)，探討酶的專一性引起的水解產(chǎn)物構(gòu)象變化與功能特性間的關(guān)系。結(jié)果表明：未處理及不同酶切處理?xiàng)l件下大豆蛋白溶解度、濁度、SDS-PAGE凝膠電泳均隨水解度變化相應(yīng)改變；氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，酶解后疏水性氨基酸濃度隨酶解程度逐漸增大，且均高于SPI內(nèi)疏水性氨基酸濃度；紫外吸收光譜及熒光光譜進(jìn)一步佐證酶解作用位點(diǎn)及酶解對(duì)微環(huán)境改變的影響；傅里葉紅外光譜分析則表征蛋白水解物呈現(xiàn)柔性結(jié)構(gòu)，對(duì)發(fā)揮功能特性提供依據(jù)；菠蘿蛋白酶水解產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)展開，疏水性基團(tuán)暴露，形成柔性結(jié)構(gòu)單元，其乳化性及抗氧化性都得到明顯改善。