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      PM2.5誘導大鼠肺組織miRNAs表達譜失調(diào)及相關信號通路變化研究

      2022-07-23 10:23:34潘柏如張海軍王楊楊娟
      西部醫(yī)學 2022年7期
      關鍵詞:染色通路基因

      潘柏如 張海軍 王楊 楊娟

      (達州市中心醫(yī)院胸外科,四川 達州 635000)

      細顆粒物指環(huán)境空氣中空氣動力學當量直徑小于等于 2.5 μm的顆粒物[1],PM2.5能夠避開呼吸系統(tǒng)屏障進入血液循環(huán),擾亂先天免疫機制[2]。能較長時間懸浮于空氣中,其在空氣中含量濃度越高,就代表空氣污染越嚴重[3]。2010年~2015年,全球總體PM2.5水平由每平方米39.7 mg增加至每平方米44.2 mg,同時期可歸因于PM2.5的死亡人數(shù)估計增加了約20%[4]。臨床和實驗研究都已經(jīng)證實,PM2.5暴露與肺癌,特別是非小細胞肺癌(Non small cell lung cancer,NSCLC)之間存在因果關系[5]。一項針對1890萬人進行的流行病學研究表明,接觸PM2.5后12個月和60個月,肺癌死亡風險分別增加1.13倍和1.33倍[6]。大鼠經(jīng)氣管內(nèi)注入PM2.5后,異常變化的miRNAs會通過調(diào)節(jié)免疫細胞導致大鼠免疫功能失衡[7]。英國的一項實驗研究發(fā)現(xiàn),對行走在污染街道上2 h的非吸煙人群的循環(huán)miRNA基因組進行了分析,結果顯示,54種miRNA在血漿中有高表達,其中7種miRNA在肺中高表達[8]。本研究通過建立PM2.5暴露大鼠模型,檢測大鼠血清及肺組織中miRNA的表達,探討PM2.5對表觀遺傳學及肺組織損傷的影響,以期為PM2.5誘發(fā)肺癌的早期診斷提供更多策略,并對PM2.5誘發(fā)肺癌的可能機制進行研究。

      1 材料與方法

      1.1 主要細胞、試劑與儀器 蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司,人支氣管上皮細胞16HBE購自上海拜力生物科技有限公司,CCK-8檢測試劑盒購自上??瓢┥锛夹g有限公司,CD34免疫熒光染色試劑盒購自北京瑟斯騰環(huán)境科技有限公司,兔抗大鼠Notch1、兔抗大鼠HES1、兔抗大鼠Beclin1(1:800,美國Abcam)、兔抗大鼠Hes1、兔抗大鼠cleaved-Caspase3、兔抗大鼠GAPDH抗體購自美國Abcam公司、辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自Sigma公司,RIPA 裂解液購自北京索萊寶科技有限公司。凝膠成像掃描儀購自上海信帆生物科技有限公司,酶標儀購自美國Thermo公司,微??諝膺^濾器(Heap過濾器)購于蘇州威洛斯特過濾設備有限公司,PM2.5特氟龍濾膜購于美國TISCH公司。

      1.2 實驗動物 40只6周齡雄性Wistar大鼠,體重180~220 g,購于成都中醫(yī)藥大學[生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2019-11]。所有大鼠均飼養(yǎng)在SPF級動物房中,室溫(22±1)℃,相對濕度40%~70%,晝夜循環(huán)12 h,大鼠可自由進食、飲水。本研究符合動物倫理要求,并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準。

      1.3 方法

      1.3.1 PM2.5采集與純化 利用Heap過濾器采集本市繁華路段空氣中顆粒物,采用濾膜進行采樣。將載有PM2.5的特氟龍濾膜剪成3 cm×3 cm大小后放入錐形瓶,加入200 mL蒸餾水后超聲震蕩30 min,醫(yī)用紗布過濾5次,在4℃、12000 rpm條件下離心30 min,干燥處理得到的細顆粒物,-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)實驗要求,在實驗開始前配置PM2.5溶液。

      1.3.2 動物分組及模型制備 適應性喂養(yǎng)一周后,將大鼠隨機分為對照組和PM2.5干預組:低劑量組(2.5 mg/kg)、中劑量組(10 mg/kg)、高劑量組(20 mg/kg),每組10只。麻醉滿意后,PM2.5干預組大鼠分別經(jīng)氣管內(nèi)滴注PM2.5混懸液2.5、10、20 mg/kg,對照組注射50 μL生理鹽水,每3 d一次,連續(xù)70 d,模擬慢性PM2.5暴露。氣管內(nèi)滴注后第70天處死大鼠,取雙側肺作進一步研究。之后,矢狀面切除左肺中間帶進行病理檢查。右肺保存在液氮中,用于RNA和蛋白質(zhì)的提取和定量。

      1.3.3 肺組織病理學檢查 取大鼠左肺門附近肺組織進行病理檢查,光鏡觀察。光鏡下,將肺組織固定在4%多聚甲醛溶液中。石蠟包埋后,取4 μm切片,進行蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察肺組織病理改變。

      1.3.4 miRNA的RNA-seq高通量測序和數(shù)據(jù)分析 采用TRLzol試劑(Invitrogen,USA)提肺大鼠臟組織中總RNA。對RNA的濃度和質(zhì)量進行測定。利用瓊脂糖凝膠電泳法測定RNA完整性。應用安捷倫微RNA芯片對肺臟中miRNA進行分析。選擇不同的index標簽建庫后。采用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS試劑在cBot上生成簇,而后利用測序平臺進行單端測序。

      1.3.5 人支氣管上皮細胞16 HBE培養(yǎng)及CCK-8檢測 人支氣管上皮細胞16HBE在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的Dulbecco's改良Eagle's培養(yǎng)基中培養(yǎng),并在含5% CO2的37℃孵育箱中培養(yǎng)。用100 μg/mL濃度的PM2.5處理16 HBE細胞24~48 h,連續(xù)5代,模擬慢性暴露。miR-296-5p inhibitor及其陰性對照轉染16 HBE細胞12 h后,每代加PM2.5(100 μg/mL),連續(xù)傳5代。細胞干預完畢后,加入含CCK-8的培養(yǎng)基,CCK-8溶液約占細胞培養(yǎng)基體積的1/10。放入孵箱培養(yǎng)40 min,觀察顏色變?yōu)槌壬_始檢測。將孔板取出,放入酶標儀檢測,波長設為450 nm。處理分析數(shù)據(jù)。

      1.3.6 CD34免疫熒光染色 將制備好的大鼠肺臟切片放入濕盒中,濕盒底部加水,注意防止干片。 在玻片標本中央滴加50 μL的CD34一抗,室溫孵育1 h,PBS洗三遍,每次5 min。小心吸去PBS,加入二抗,室溫孵育45 min,PBS洗四遍,每次5 min。小心吸去PBS,加入0.5 μg/mL DAPI染色10 min,用PBS洗三遍,去除多余的DAPI。加入20 μL封片劑封片。立即在熒光顯微鏡下觀察。

      1.3.7 Western blot檢測 用RIPA裂解緩沖液處理細胞后提取總蛋白,細胞裂解液在4℃、12000 rpm條件下離心15min,收集上清液。采用BCA蛋白檢測試劑盒,測定蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)樣品轉移到NC膜上,用5%脫脂牛奶封閉。然后,用Notch1(1∶1000,美國Abcam)、HES1(1∶1000,美國Abcam)、Beclin1(1∶800,美國Abcam)、Hes1(1∶1000,美國Abcam)、cleaved-Caspase3(1∶1000,美國Abcam)、GAPDH抗體(1∶1000,美國Abcam)在4℃的搖床上孵育過夜,然后在室溫下與二抗孵育2 h,對蛋白質(zhì)進行量化和可視化。

      2 結果

      2.1 各組大鼠體重及精神狀態(tài) 在實驗期間的各個時間點,與對照組相比,低、中、高劑量組大鼠的體重始終較低,且PM2.5干預劑量越高,大鼠體重越低(P<0.05)。對照組大鼠精神狀態(tài)活躍,二便正常,皮毛有光澤,反應靈敏,活潑好動。PM2.5干預組精神狀態(tài)差,活動減少,毛色灰暗,對刺激的反應性下降。見圖1。

      圖1 各組大鼠實驗期間體重變化

      2.2 大鼠肺臟大體觀及HE染色 對照組大鼠肺臟呈均勻粉紅色,質(zhì)地柔軟,表面無明顯異常;干預組大鼠肺臟顏色灰暗無光澤,可見多處白色隆起,質(zhì)地不均勻、不光滑。其中高劑量組大鼠肺切片HE染色可見大量巨噬細胞浸潤并有顆粒物沉積,細支氣管上皮不典型增生,部分腺體乳頭狀增生,部分管腔腺體擁擠、紊亂。見圖2。

      圖2 各組大鼠肺臟大體觀及HE染色

      2.3 免疫熒光染色檢測 與對照組相比,PM2.5干預組大鼠肺組織中CD34表達升高,干預濃度越高,CD34表達密度越高。表明PM2.5可誘導大鼠肺部血管增生活躍,微血管密度增加。見圖3。

      圖3 大鼠肺組織CD34免疫熒光染色

      2.4 各組大鼠肺組織差異性表達的miRNA miRNA的RNA-seq 高通量測序顯示,與對照組比較,PM2.5干預組大鼠肺組織差異表達 miRNAs有67個,其中上調(diào)48個,下調(diào)的19個,表達量差異倍數(shù)高于5倍的有4個,即miR-296-5p、miR-27a、miR-182、miR-92a-1-p5。其中miR-296-5p上調(diào)了7.85倍,是表達差異最大的miRNA。見圖4。

      圖4 四組大鼠肺組織差異性miRNA表達熱圖

      2.5 CCK-8檢測 正常對照組、PM2.5干預組、miRNA陰性對照組、miR-296-5p inhibitor組的OD值分別為0.76±0.13、0.38±0.08、0.41±0.09、0.59±0.12。與正常對照組相比,PM2.5干預組的細胞活性顯著下降(P<0.05),經(jīng)miR-296-5p inhibitor干預后,細胞活性明顯升高(P<0.05)。 見圖5。

      圖5 各組細胞CCK-8活性檢測

      2.6 Western blot檢測 與對照組比較,經(jīng)PM2.5干預后,細胞中的Notch1蛋白、HES1蛋白表達量降低,Beclin1蛋白、cleaved-Caspase3蛋白表達量升高(P<0.05);與miRNA陰性對照組比較,轉染miR-296-5p inhibitor后,細胞中的Notch1蛋白,HES1蛋白、Beclin1蛋白的相對表達量均明顯升高(P<0.05)。表明在肺上皮細胞中,抑制miR-296-5p表達,可抑制Notch1信號通路激活。見圖6。

      圖6 Western blot檢測肺上皮細胞中Notch通路相關蛋白表達

      3 討論

      流行病學的證據(jù)表明,肺癌與PM2.5暴露之間存在正相關關系[9]?,F(xiàn)已證實PM2.5致肺部癌變的機制與肺上皮細胞釋放細胞因子、產(chǎn)生活性氧、DNA損傷[10]和細胞骨架重塑[11]有關。本研究中,大鼠在PM2.5暴露10W后,在肺組織中發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關的病理改變,包括肺泡間隔增厚和肺組織細支氣管上皮增生。

      PM2.5暴露影響血液、唾液、心臟和肺等不同組織/器官的miRNAs表達調(diào)控[12]。此外,血清miRNA可作為非小細胞肺癌、結直腸癌和糖尿病早期檢測和診斷的生物標志物[13]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)血清和肺中miRNAs表達異常,這些miRNAs與PM2.5暴露8周誘發(fā)的肺癌等肺部疾病有關。以往的研究表明[14],PM2.5及其組分可以進入血液循環(huán),誘導表觀遺傳學改變,在不改變核苷酸序列的情況下影響基因表達。英國學者發(fā)現(xiàn),在實驗中僅僅吸入汽車尾氣2 h,志愿者細胞的基因組DNA上約有2800個位點的DNA甲基化過程發(fā)生了改變,影響了大約400個基因的表達,其中包含了與過敏性疾病、炎癥、氧化應激有關的基因。同時,這項實驗顯示,受試者在離開尾氣環(huán)境后,尾氣帶來的DNA甲基化改變至少持續(xù)30 h,這與其它研究的結果一致。PM2.5的組成和含量十分復雜,包括金屬、多環(huán)芳烴、多氯二苯并二惡二苯并呋喃和多氯聯(lián)苯等,這些都是造成基因組不穩(wěn)定的原因[15]。高水平的PM2.5結合的多環(huán)芳烴可能具有誘變和致癌的潛力[16]。接觸多環(huán)芳烴與DNA損傷增加、微核形成增加和異常細胞周期停滯有關[11]。在本研究中,PM2.5暴露后針對Bax和RASSF5基因的miR-296-5p和miR-27a表達增加,這可能與DNA修復和細胞增殖失控有關。以往的研究表明[17],PM2.5的金屬含量和組成通過直接或間接誘導活性氧產(chǎn)生和增加氧化應激來促進DNA損傷[18]。PM2.5來源的多環(huán)芳烴引起的脂質(zhì)代謝反應可能與大鼠或人的肺部病變有關[19]。同時,PM2.5對機體基因表達有顯著的調(diào)控作用[20]。有研究者收集PM2.5污染物后,讓小鼠暴露在這些PM2.5污染的空氣中,檢測對小鼠基因的影響。結果發(fā)現(xiàn),PM2.5暴露并不改變基因的序列,即并不引起DNA突變,但是會影響DNA上化學修飾的變化,主要是DNA甲基化,進而影響了基因的表達[21]。

      在本研究中,miRNA 的RNA-seq 高通量測序顯示,干預組大鼠肺組織差異表達 miRNAs有67個,其中上調(diào)48個,下調(diào)的19個,表達量差異倍數(shù)高于5倍的有4個,即miR-296-5p、miR-27a、miR-182、miR-92a-1-p5。在固體組織中高豐度的miRNAs通常也存在于血液中,但總是有顯著的變異[22]。全血中miRNAs的總體模式不僅由特定的實體器官決定,還受其他因素的影響。有必要考慮到血清和肺組織中miRNAs的豐度差異,靶器官中的miRNAs反映了特定組織的損傷[23]。肺組織中miRNAs的差異表達也可提示PM2.5暴露后肺外組織可能存在損傷[16]。

      Notch基因編碼一類高度保守的細胞表面受體[24],它們調(diào)節(jié)從海膽到人等多種生物細胞的發(fā)育[25]。Notch基因編碼一種膜蛋白受體,由Notch受體、Notch配體(DSL蛋白)及細胞內(nèi)效應器分子(CSL-DNA結合蛋白)三部分組成[26]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組比較,經(jīng)PM2.5干預后,細胞中的Notch1蛋白、HES1蛋白表達量降低,Beclin1蛋白、cleaved-Caspase3蛋白表達量升高,表明PM2.5可顯著激活肺上皮細胞中Notch信號通路。不同于其他信號通路,Notch信號通路中Notch的受體和配體都是膜蛋白[27],它介導的是兩個細胞相互靠近接觸之后的活化效應,而不是由分泌型的蛋白作為配體[26]。有研究表明[28],miRNA可通過抑制Notch信號中DII1受體表達而促進小鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化。同時在本研究中,經(jīng)miR-296-5p inhibitor干預后,細胞中的Notch1蛋白,HES1蛋白、Beclin1蛋白的相對表達量均明顯升高。表明在肺上皮細胞中,抑制miR-296-5p表達,可抑制Notch1信號通路激活。因此我們推測,miR-296-5p可能是通過與Notch受體結合后觸發(fā)Notch信號的活化,導致Notch受體發(fā)生蛋白水解,并進一步轉移到細胞核,從而激活靶基因的轉錄,發(fā)揮生物學功能。Notch信號調(diào)節(jié)機體正常發(fā)育的一些關鍵步驟,所以,該通路的某些分子發(fā)生突變,或者其下游事件發(fā)生改變,都會導致細胞生物學功能的顯著變化,影響上皮細胞功能。

      4 結論

      暴露于PM2.5環(huán)境中,大鼠肺組織中miRNAs的表達譜發(fā)生了紊亂,以miR-296-5p的表達失衡最明顯,且miR-296-5p的表達失衡可通過Notch信號通路發(fā)揮效應,影響上皮細胞功能。

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