高良姜素通過(guò)巨噬細(xì)胞極化及抑制鋅指蛋白 Zbed3誘導(dǎo)大鼠肝癌細(xì)胞凋亡的研究*

胡春蘭 周龍 田玲 鄧?yán)G

(1.重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，重慶 500101；2.重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，重慶 500101；3.重慶萬(wàn)州區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 404100)

誘發(fā)肝癌產(chǎn)生的因素較多，目前尚未完全掌握，但生活中一些因素會(huì)增加肝癌的發(fā)病率，如肝炎病毒、進(jìn)食含有黃曲霉毒素的食物、酗酒等[1]。肝癌早期無(wú)特異性特征，隨著病情的發(fā)展，患者會(huì)產(chǎn)生食欲不振、腹痛腹脹、消瘦等。常見的并發(fā)癥為惡心、意識(shí)不清、便秘、暈厥、膽固醇水平升高等[2]。尋找安全有效、靶點(diǎn)明確、低毒的天然抗腫瘤藥物是科學(xué)界研究的焦點(diǎn)，從中藥中篩選有效的活性物質(zhì)治療肝癌是中藥發(fā)展的中藥渠道。高良姜素是天然的黃酮醇類化合物，可從植物高良姜植株的地上部分及根莖和蜂膠中提取得到。研究發(fā)現(xiàn)[3]，高良姜素具有鎮(zhèn)痛、止嘔、抗氧化以及抗腫瘤作用，高良姜素可抑制皮膚癌、骨瘤等癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。腫瘤微環(huán)境與腫瘤的產(chǎn)生與發(fā)展聯(lián)系密切，巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中較為重要。腫瘤為逃避巨噬細(xì)胞的殺傷作用，迫使其極化狀態(tài)發(fā)生改變，以促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。巨噬細(xì)胞極化有兩種類型：M1型(殺傷腫瘤)與M2型(促進(jìn)腫瘤)?？煽闯?，巨噬細(xì)胞極化對(duì)腫瘤治療至關(guān)重要。涉及巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制也有很多，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。Wnt信號(hào)通路的異常與癌細(xì)胞生物學(xué)行為密切相關(guān)，該通路主要由Axin、GSK3β、β-catenin等組成，目前已有多項(xiàng)研究表明該通路中的相關(guān)因子(Axin、β-catenin等)在肝癌的轉(zhuǎn)移、凋亡中具有重要作用[4]。但影響該通路中因子活性的因素較為復(fù)雜，目前尚未完全明確。近年來(lái)，相關(guān)報(bào)道表明[5]，Zbed3(鋅指蛋白3)可與wnt號(hào)通路中的Axin結(jié)合，通過(guò)抑制Axin-GSK3β復(fù)合體功能，阻滯β-catenin降解，激活Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖。目前，關(guān)于Zbed3對(duì)人類腫瘤的相關(guān)文獻(xiàn)較少，因此本研究探討高良姜素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化對(duì)肝癌大鼠瘤體體積及鋅指蛋白Zbed3的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株 健康SD雄性大鼠74只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量250～300 g，常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食飲水，購(gòu)自杭州固拓生物公司。合格證號(hào)：SCXK(浙)2019-0024。Walker-256瘤株購(gòu)自無(wú)錫欣潤(rùn)生物公司。本研究經(jīng)重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：Y2018-009-12)。

1.2 藥品及配制 高良姜素購(gòu)自上海莼試生物公司，在使用時(shí)將高良姜素溶解于含5%吐溫80的生理鹽水中，并稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 Zbed3一抗(上海谷研公司)；GSK3β、Axin一抗(武漢菲恩公司)；β-catenin、c-myc、cyclin-D1一抗(貴州平生公司)；辣根過(guò)氧化物酶二抗(湖北貓爾沃公司)；TUNEL工作液(蘇州宇恒公司)；戊巴比妥鈉(湖北鴻運(yùn)隆公司)。

1.4 模型建立及分組 取4只大鼠，將Walker-256瘤株常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)擴(kuò)增、腹水傳代，將含腫瘤細(xì)胞的腹腔液注射到皮下種植幼鼠的腋下或腹股溝皮下，每個(gè)注射點(diǎn)用0.3～0.5 mL共注射15處。7 d后處死全部皮下種植鼠，手術(shù)切除皮下種植瘤塊，挑選出魚肉狀組織，并切成2 mm3大小若干塊。置于生理鹽水中備用，在2～3 h內(nèi)移植完。 取56只SD大鼠，麻醉后仰位固定，手術(shù)區(qū)用75%乙醇消毒。在腹正中皮膚切開5～10 mm用顯微組織鑷子將肝包膜捅一小口，將腫瘤塊沿隧道嵌入。移植完畢后檢查無(wú)滲血逐層縫合腹壁[6]。 移植成功1 W后，將未處理的14只健康大鼠作為對(duì)照組，常規(guī)飼養(yǎng)；56只模型大鼠意外死亡1只，建模失敗3只，剩余52只大鼠隨機(jī)分為模型組(模型大鼠常規(guī)飼養(yǎng))、高良姜素低劑量組(模型+25 mg/kg/d高良姜素灌胃)、高良姜素中劑量組(模型+50 mg/kg/d高良姜素灌胃)及高良姜素高劑量組(模型+100 mg/kg/d高良姜素灌胃)，每組13只，各組開始治療時(shí)間為移植1周后；治療時(shí)間為 28 d，即移植后 35 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 HE染色觀察各組大鼠病理形態(tài) 取各組大鼠戊巴比妥鈉麻醉后處死，取出肝臟組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)制作切片，并進(jìn)行HE染色，最后以中性樹膠封片，在偏光顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織中的病理改變。

1.5.2 TUNEL檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡 取各組大鼠肝癌組織石蠟切片脫蠟，加入20 μg/mL不含核酸內(nèi)切酶的蛋白酶K，常溫孵育15～30 min，PBS洗滌后加入TUNEL檢測(cè)液，常溫?zé)o光孵育1 h，PBS清洗，加50 μLconvertr-POD，常溫?zé)o光孵育0.5 h。PBS清洗，DAB液顯色，沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。熒光顯微鏡下觀察，并計(jì)數(shù)其中發(fā)熒光的陽(yáng)性細(xì)胞。凋亡率:凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5.3 各組大鼠瘤體體積檢測(cè) 治療結(jié)束后，取各組大鼠麻醉后處死，剖腹、暴露肝臟，在手術(shù)顯微鏡下用游標(biāo)卡尺測(cè)定腫瘤最大長(zhǎng)徑(a)和最短徑(b)。

1.5.4 免疫組化檢測(cè)腫瘤巨噬細(xì)胞中CD11c(M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白)、CD206(M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白)表達(dá) 采用免疫組化SP法檢測(cè)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(CD11c、CD206)的表達(dá)。制作2 μm厚度的肝癌石蠟組織連續(xù)切片，二甲苯脫蠟并在梯度乙醇中進(jìn)行水化，之后將組織切片置于 EDTA抗原修復(fù)溶液中進(jìn)行高壓抗原修復(fù)，將切片在3%過(guò)氧化氫中孵育20 min阻斷內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性。孵育一抗，即添加兔抗人多克隆抗體CD206、CD11c(1∶100)。然后4℃下孵育過(guò)夜， 用PBS溶液沖洗后加入通用型二抗在37℃下孵育30 min。PBS洗片后，進(jìn)行DAB顯色。終止顯色后，蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水、透明、封片及鏡下觀察。免疫組化結(jié)果的判定由兩名臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師雙盲下完成。隨機(jī)選擇切片組織上5個(gè)不重復(fù)視野進(jìn)行免疫組化評(píng)分，評(píng)分包括染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比，染色強(qiáng)度定義如下:棕褐色:3分、棕黃色:2分、淡黃色:1分、著色弱或不著色:0分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比即染色細(xì)胞占視野內(nèi)全部細(xì)胞的百分比評(píng)分。定義如下:≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分； >75%為4分。 切片最終評(píng)分=著色細(xì)胞強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分。最終評(píng)分0分記為陰性；1～3分記為弱陽(yáng)性；4～6分記為中等強(qiáng)度陽(yáng)性；400倍鏡下選取5處代表性區(qū)域，評(píng)估其陽(yáng)性細(xì)胞百分比，取平均值，最后大于平均值即定義為高表達(dá)，小于平均值定義為低表達(dá)。

1.5.5 Wbstern Blot檢測(cè)Zbed3與Wnt通路中GSK3β、Axin、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平 取各組大鼠肝組織，蛋白裂解液裂解，勻漿機(jī)勻漿，離心后收集上清。測(cè)定蛋白濃度。將組織裂解產(chǎn)物進(jìn)行電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Zbed3、GSK3β、Axin、β-catenin、c-myc、cyclin-D1一抗(1∶500)，后加入辣根過(guò)氧化物酶二抗(1∶1200)，雜交沖洗。后將膜浸入ECL工作液，隨后進(jìn)行檢測(cè)，獲取圖象。蛋白含量通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)并取其與B-actin的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列有序，形態(tài)正常；模型組大鼠瘤組織呈膨脹性生長(zhǎng)，癌細(xì)胞大小不一，肝細(xì)胞索擠壓，排列不齊，并可見纖維素樣結(jié)構(gòu)；高良姜素低、中、高劑量組大鼠均出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞間隙增寬，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的腫脹變性，呈現(xiàn)泡沫狀改變，腫瘤細(xì)胞巢可見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，各組均可見不同程度的腫瘤細(xì)胞壞死灶。見圖1。

圖1 HE染色結(jié)果(400×)

2.2 肝癌細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組大鼠無(wú)肝癌細(xì)胞；模型組細(xì)胞凋亡率(21.32±2.14)%低于高良姜素低劑量組(29.45±3.28)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.085，P<0.05)；高良姜素低劑量組細(xì)胞凋亡率低于高良姜素中劑量組(36.41±3.17)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.737，P<0.05)；高良姜素中劑量組細(xì)胞凋亡率低于高良姜素高劑量組(47.25±5.31)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.294，P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠肝癌細(xì)胞凋亡結(jié)果(400×)

2.3 各組大鼠瘤體體積檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組大鼠無(wú)瘤體，模型組瘤體體積(124.35±13.47)mm3高于高良姜素低劑量組(95.26±8.47)mm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.841，P<0.001)；高良姜素低劑量組瘤體體積高于高良姜素中劑量組(67.28±5.32)mm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.470，P<0.001)；高良姜素中劑量組瘤體體積高于高良姜素高劑量組(54.71±5.14)mm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.838，P<0.001)。見圖3。

圖3 各組大鼠瘤體體積對(duì)比

2.4 CD11c、CD206檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝癌組織中CD11c陽(yáng)性率降低、CD206升高(均P<0.05)。與模型組相比，高良姜素低劑量組CD11c升高、CD206降低(均P<0.05)。與高良姜素低劑量組相比，高良姜素中劑量組CD11c升高、CD206降低(均P<0.05)。與高良姜素中劑量組相比，高良姜素高劑量組CD11c升高、CD206降低(均P<0.05)。見表1、圖4。

表1 各組大鼠CD11c、CD206水平對(duì)比

2.5 Zbed3與Wnt通路中GSK3β、Axin、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織中GSK3β、Axin水平降低，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平升高(均P<0.05)。與模型組相比，高良姜素低劑量組GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低(均P<0.05)。與高良姜素低劑量組相比，高良姜素中劑量組GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低(均P<0.05)。與高良姜素中劑量組相比，高良姜素高劑量組GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低(均P<0.05)。見表2、圖5。

圖4 CD11c、CD206水平對(duì)比

表2 各組下列指標(biāo)水平對(duì)比

圖5 各組蛋白水平比較

3 討論

肝癌是我國(guó)最常見的腫瘤之一，根據(jù)國(guó)家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，2018年預(yù)估新發(fā)病例近50萬(wàn)人，死亡人數(shù)43萬(wàn)，發(fā)病后死亡比例較高[7]。本研究運(yùn)用高良姜素治療肝癌大鼠，探討對(duì)巨噬細(xì)胞極化以及瘤體體積、鋅指蛋白Zbed3的影響。

近年來(lái)，炎癥在腫瘤中扮演越來(lái)越重要的角色，腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用成為近些年來(lái)腫瘤研究的熱點(diǎn)。巨噬細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中至關(guān)重要，包含兩個(gè)表型，M1型巨噬細(xì)胞可抑制癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡、提高機(jī)體免疫能力，M2 型可以分泌細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，白介素1β等降低機(jī)體的免疫功能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，直接或間接地促進(jìn)血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤[10]、胰腺癌[11]等惡性腫瘤中，M2型巨噬細(xì)胞提示患者預(yù)后不良。高良姜素具有鎮(zhèn)痛、抗氧化，抗腫瘤等作用，且已有研究證實(shí)其在肝癌[12]、肺癌[13]、胃癌[14]、乳腺癌[15]等腫瘤中均可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本文研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌中，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD11c表達(dá)低于健康大鼠，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD206表達(dá)高于健康大鼠，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。且本文TUNEL檢測(cè)結(jié)果提示，在經(jīng)過(guò)高良姜素干預(yù)后，癌細(xì)胞凋亡增加。TUNEL的原理是利用細(xì)胞的凋亡使在細(xì)胞內(nèi)外各種誘導(dǎo)凋亡因素的作用下，經(jīng)一系列胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，該酶切開 DNA 而形成 180-200bp 或其整倍數(shù)的寡核苷酸片段，暴露出的 3'羥基在末端轉(zhuǎn)移酶(TDT)的作用下與生物素標(biāo)記的核苷酸結(jié)合，最終借助抗生物素抗體結(jié)合的過(guò)氧化物酶，使凋亡細(xì)胞被特異性地標(biāo)記和顯示出來(lái)。謝昌利等[16]在對(duì)肝癌的實(shí)驗(yàn)中提出，M1型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，在經(jīng)過(guò)干擾IRF1后，促進(jìn)了M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖。在石旭等[17]對(duì)肝癌的實(shí)驗(yàn)中提出，高表達(dá)的 hnRNP L可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD206的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌發(fā)展。汪俊劍等[18]在對(duì)肺癌細(xì)胞的研究中提出，高良姜素可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程,降低線粒體膜電位,打破細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)來(lái)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。本研究與上述研究結(jié)果相似，因此本文推測(cè)，高良姜素可能是通過(guò)提高CD11c表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，通過(guò)抑制CD206表達(dá)，阻滯巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制增殖。且本文中HE染色結(jié)果也表明在經(jīng)過(guò)高良姜素干預(yù)后腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)病死灶。

相關(guān)研究表明[19]，Zbed3在肺癌中高表達(dá)，并與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，影響患者的預(yù)后，提示其可能是維持肺癌惡性表型的分子，可能成為臨床治療靶點(diǎn)。Wnt信號(hào)通路的異常與腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前，已有研究證實(shí)[20]，Zbed3可通過(guò)抑制小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中的Axin-GSK3β復(fù)合體功能，阻滯β-catenin降解，使得Wnt通路激活后促進(jìn)細(xì)胞增殖。另有研究發(fā)現(xiàn)[21]，抑制Zbed3水平后，肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力下降，提示其參與腫瘤的預(yù)后。在肺癌中，降低Zbed3水平后β-catenin、c-myc、cyclin-D1表達(dá)降低，提示可能是癌細(xì)胞增殖能力下降的原因。相關(guān)研究提出[22]，Zbed3可能為調(diào)節(jié)Wnt通路中關(guān)鍵分子β-catenin及下游靶基因的重要分子，從而影響癌細(xì)胞的增殖及侵襲，促進(jìn)肺癌的惡性表型及患者預(yù)后。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明，高良姜素通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin通路可調(diào)控癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[23]。在李永峰等[24]對(duì)乳腺癌細(xì)胞的研究中提出，高良姜素通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。經(jīng)本文研究發(fā)現(xiàn)，與肝癌大鼠相比，在經(jīng)過(guò)高良姜素干預(yù)后，GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。范垂鋒[25]在對(duì)肺癌的研究中提出，抑制Zbed3表達(dá)后，通過(guò)促進(jìn)Axin-GSK313復(fù)合體的功能后，降低了β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平，從而抑制了肺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)了凋亡。劉明江等[26]在研究中提出，通過(guò)提高GSK3β水平后可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型分化，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡。本文研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，因此本文認(rèn)為，高良姜素可能是通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin通路，從而促使了巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，降低了Zbed3的表達(dá)。且本文瘤體體積檢測(cè)結(jié)果也表明在經(jīng)過(guò)高良姜素的治療后，體積減小。

4 結(jié)論

高良姜素通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化并抑制其向M2型轉(zhuǎn)化，降低了Zbed3水平從而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡并減小瘤體體積。