“方-證”結(jié)合探討炮制品的復(fù)方運用

張 希，東方梓涵，李 江，戚琬若，劉 旭，胡昌江，余曉玲*

(1.昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650500；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

中藥臨床運用遵循七情配伍原則，其中除了少數(shù)單用能發(fā)揮治療作用外，其余大多數(shù)均需聯(lián)合配伍發(fā)揮藥效，這體現(xiàn)了中藥配伍的協(xié)同增效機制，體現(xiàn)了中醫(yī)藥的整體性特點。傳統(tǒng)中藥炮制理論一直指導(dǎo)中藥的工業(yè)生產(chǎn)和臨床運用，同時現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對傳統(tǒng)中藥炮制的研究已成為研究的核心和關(guān)鍵問題。研究發(fā)現(xiàn)，許多單味中藥經(jīng)炮制過后可“增效減毒”“緩和藥性”，但中藥配伍講究整體協(xié)同增效，因此炮制后的中藥在配伍運用中是否發(fā)揮同樣的療效值得探討。

近年來，成都中醫(yī)藥大學(xué)胡昌江教授致力于復(fù)方中藥炮制研究，同時進行了“方-證”結(jié)合對中藥炮制研究的可行性探索研究，已取得一系列進展，這為中藥炮制研究提供了新思路。

1 “方-證”結(jié)合

《傷寒論》中提出方證對應(yīng)理論，其曰：“有是證用是方”，該理論是中醫(yī)學(xué)研究常用的方法之一，強調(diào)方為證立、方隨證轉(zhuǎn)、方證對應(yīng)的原則。又古人云：“炮制不明，藥性不確，則湯方無準(zhǔn)，而病證不驗也”，表明中藥炮制理論同樣基于“方-證”理論，臨床不能僅僅根據(jù)患者之證，機械性地使用某一方劑，當(dāng)根據(jù)患者病證之變化，在辨證論治基礎(chǔ)上針對不同證候譴方用藥，對中藥進行炮制以增效減毒，避免“工于分離解析，疏于還原整合”的研究模式，充分體現(xiàn)其中醫(yī)臨證的精準(zhǔn)性[1]。

賈天柱等[2]提出“炮制組學(xué)”的假設(shè)，認(rèn)為任何單一化合物的改變都不能全面展現(xiàn)中藥炮制前后功效和藥性的變化，只有多種成分的比例、組成變化的綜合結(jié)果才能更好地解析炮制機理以及藥材炮制后功能變化對中藥多成分、多靶點整體協(xié)同作用的特點，從整體上全面表征中藥發(fā)揮藥效的作用特點。

圖1 中藥炮制復(fù)方配伍研究思路

1.1 基于復(fù)方功效拆方研究

在臨床使用炮制品入藥時，往往采用藥物炮制后的藥性入藥，但是許多藥物炮制前后的藥性和藥效變化巨大，如萊菔子“生升熟降”，所以選擇單味炮制藥配伍時需根據(jù)藥物在復(fù)方中發(fā)揮的藥效與炮制前后的藥材進行對比。

在確定復(fù)方中的藥物是否需要炮制時，需對其中的單味藥作炮制篩選，包括前期炮制方法和藥理藥效篩選；篩選的基礎(chǔ)需要根據(jù)“方-證”的具體臨床療效選擇合適的模型。對于模型的選擇，有兩種參考，第一，以藥物在復(fù)方中發(fā)揮的藥效為基礎(chǔ)進行選擇與造模，如李文兵等[3-4]根據(jù)益智仁在縮泉丸中溫補脾腎、澀精縮尿的功能，分別以水負(fù)荷多尿和腎陽虛多尿大鼠為模型，研究縮泉丸中益智仁鹽炙對模型大鼠縮尿及補腎作用的影響。張希等[5]根據(jù)五子衍宗丸中覆盆子溫腎固精縮尿的作用，以腺嘌呤復(fù)制腎陽虛多尿大鼠模型，研究五子衍宗丸中覆盆子鹽炙后的腎臟改善研究。第二，以復(fù)方證候為模型進行選擇，采用“證候-藥效-模型-相關(guān)藥理學(xué)指標(biāo)-闡明炮制機理”的研究模式。如補骨脂基于補骨脂丸治療脾腎陽虛型泄瀉，李凱等[6]將補骨脂與小茴香的炮制品相互組合(鹽補骨脂+生小茴香、生補骨脂+鹽小茴香、生補骨脂+生小茴香)，驗證鹽炙組成復(fù)方的合理性，同時探討對脾腎陽虛泄瀉模型大鼠干預(yù)作用的最佳炮制品組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)五靈脂、蒲黃相須合用，為臨床治療氣血瘀滯證的失笑散；周習(xí)[7]利用血瘀證模型大鼠研究蒲黃制炭前后與五靈脂組成復(fù)方失笑散的藥效差異。這類方法主要基于復(fù)方病證研究，以炮制品組成復(fù)方的藥效差異來驗證炮制的合理性。

1.2 將單味藥納入復(fù)方、生熟飲片互換，進行配伍作用研究

目前主要通過HPLC、UPLC、LC-MS、GC-MS等解析技術(shù)對藥物化學(xué)成分進行比較，以及通過藥效學(xué)比較增效與否來研究中藥飲片炮制前后差異，缺少基于相關(guān)病證的復(fù)方配伍研究。中藥炮制的主要目的是發(fā)揮復(fù)方藥效作用，因此需將單味藥納入復(fù)方，生熟飲片互換，進行配伍作用研究，以此驗證復(fù)方中采用炮制品的科學(xué)性。如吳珊珊[8]將益智仁鹽炙前后分別組成縮泉丸，通過觀察對水負(fù)荷多尿大鼠首次排尿時間和排泄率的影響，判斷縮泉丸中益智仁鹽炙的科學(xué)性及其縮尿機制。張希等[9]以單味篩選出的生、鹽覆盆子和生、鹽五味子分別組成五子衍宗丸進行生品和炮制品藥效比較，證實五子衍宗丸中藥物鹽制能提高腎精虧虛證大鼠的生精作用。魏江存[10]以大承氣湯的臨床功效泄下為基礎(chǔ)，將大黃不同炮制品配伍后的大承氣湯進行比較研究。肖宏斌等[11]利用大黃生片、熟片和炭片之間化學(xué)成分的組成及量比關(guān)系的差異進行三黃瀉心湯成分配伍研究，基于飲片炮制的成分配伍，從抗炎、活血化瘀及清熱等藥效學(xué)的角度，為三黃瀉心湯的合理、有效應(yīng)用提供理論依據(jù)。事實證明，“方-證”相結(jié)合，炮制品配伍組方進行研究更切合臨床用藥實際，符合中醫(yī)整體觀念思想。

2 復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究

有效物質(zhì)基礎(chǔ)是中藥復(fù)方發(fā)揮藥效的基本保證，其物質(zhì)基礎(chǔ)的明確與解析也是闡述炮制配伍合理性和科學(xué)性的有效途徑。對炮制品入復(fù)方后物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究更能明確其作用機制，其物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明也為炮制機理的證實奠定基礎(chǔ)。

2.1 基于譜-效關(guān)系的物質(zhì)基礎(chǔ)研究

中藥譜-效研究是根據(jù)中藥化學(xué)性質(zhì)利用溶劑分離等方式最大程度表征中藥成分信息，建立有效化學(xué)成分/群的特征峰的指紋圖譜，結(jié)合體內(nèi)外藥效檢測指標(biāo)，采用灰關(guān)聯(lián)度、偏最小二乘回歸、雙變量相關(guān)及多元回歸分析等數(shù)據(jù)處理技術(shù)將“譜”與“效”聯(lián)系起來，得到發(fā)揮有效藥效的活性成分或物質(zhì)基礎(chǔ)群，主要包括體外譜-效關(guān)系和血清譜-效關(guān)系[12]。如李夢琪等[13-14]將益智仁鹽炙后組成縮泉丸，采用溶劑分離富集分析得到各個部位指紋圖譜，灰關(guān)聯(lián)度分析對縮尿藥效的貢獻(xiàn)大小，又通過有效部位-石油醚部位的指紋圖譜，從物質(zhì)基礎(chǔ)上揭示益智仁鹽炙后增強縮泉丸縮尿藥效的機理。中藥復(fù)方由多味飲片組合而成，發(fā)揮藥效的同時也不一定是全部成分對機體產(chǎn)生作用，譜效關(guān)系從側(cè)面體現(xiàn)了中藥對機體病證的靶向性，體現(xiàn)了中藥成分發(fā)揮藥效的主次之分，這也與中醫(yī)傳統(tǒng)理論的“君臣佐使”相符合。定位中藥的有效物質(zhì)基礎(chǔ)/成分群，將中藥復(fù)方的復(fù)雜成分細(xì)化，使化學(xué)成分與藥理藥效相關(guān)聯(lián)，提取的有效物質(zhì)有利于代謝組學(xué)的研究。

2.2 基于代謝組學(xué)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究

中藥防治疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)在于有效成分，而有效成分大多為次生代謝產(chǎn)物，復(fù)雜的生成過程和生物合成機制，形成具有千變?nèi)f化的分子結(jié)構(gòu)的化合物[15]。另外藥物還可能與機體新陳代謝發(fā)生化學(xué)變化，產(chǎn)生生物活性。采用現(xiàn)代技術(shù)對復(fù)方炮制前后的物質(zhì)基礎(chǔ)進行化學(xué)成分的分析只能表觀其變化，并不能深入闡明炮制發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。另外，一些中藥僅經(jīng)過蒸、煮等加熱方式炮制，藥材化學(xué)成分基本一致，但在代謝過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可以作為藥效基團發(fā)揮藥理作用。因此，需要利用代謝組學(xué)的整體性和動態(tài)性，更加全面地揭示中藥復(fù)方炮制前后對藥物本身以及對機體代謝物的影響。王喜軍等[16]將中藥血清化學(xué)與代謝組學(xué)有機結(jié)合，利用中醫(yī)方證代謝組學(xué)分析確定證候生物標(biāo)記物，建立方劑藥效生物評價體系，揭示中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。代謝組學(xué)分析的目標(biāo)是所有的樣本整體中所有的代謝物(如血清、尿液、糞便等)，這種整體性的思想和傳統(tǒng)中醫(yī)藥注重整體觀相似。陳志敏等[17]以血清差異代謝物為標(biāo)志物，采用GC-MS分析并鑒定得到42種共有內(nèi)源性代謝物，最終篩選得到10個化合物，從血清代謝組學(xué)證實補骨脂鹽炙組成二神丸的物質(zhì)基礎(chǔ)。李夢琪等[18]提取縮泉丸的石油醚有效部位給大鼠灌胃后取血，利用HPLC聯(lián)合LC-MS對大鼠含藥血清和空白血清化學(xué)成分比較分析，確定縮泉丸石油醚部位在大鼠血中移行成分有7種，通過指認(rèn)峰判斷其可能是縮泉丸發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 基于藥物動力學(xué)-藥物效應(yīng)動力學(xué)(PK-PD)研究

PK-PD能夠比較炮制前后分別組成的復(fù)方中主要藥效成分在動物體內(nèi)的“時間-血藥濃度-效應(yīng)”之間三維關(guān)系的不同，客觀反映有效物質(zhì)的體內(nèi)吸收程度和生物利用度，監(jiān)測藥效成分動態(tài)變化規(guī)律，更加準(zhǔn)確客觀地評價中藥炮制復(fù)方在體內(nèi)的吸收、代謝、分布和排泄的動力學(xué)過程和產(chǎn)生藥理效應(yīng)的動態(tài)變化，闡明其藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前以有效部位提取物、復(fù)方水提取物、醇提取物給藥，腹腔、皮下、靜脈及肌肉注射四種給藥形式，以及眼睛、尾部、動脈采血等研究形式。但由于中藥復(fù)方傳統(tǒng)劑型大部分為水煎液，某些提取物/化合物入血較困難，有些甚至不能入血，導(dǎo)致檢測濃度過低，建立PK-PD模型時血藥濃度-時間很難擬合，這也是目前中藥復(fù)方炮制在此階段研究遇到的瓶頸之一。

2.4 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究

中藥作用的整體性、成分的復(fù)雜性和作用機制的多途徑、多靶點導(dǎo)致中藥藥效組分處于“黑箱體系”狀態(tài)。隨著組學(xué)技術(shù)(如基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、腸道菌群組學(xué)、代謝組學(xué)等)的發(fā)展，系統(tǒng)生物學(xué)視角的引入及生物信息學(xué)的應(yīng)用，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)運而生，并經(jīng)過不斷與中醫(yī)藥理論相融合，逐漸形成了“中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”[19-20]。采用組學(xué)技術(shù)和高通量檢測(蛋白質(zhì)表達(dá)譜及基因表達(dá)譜等)對復(fù)方進行生物信息學(xué)分析，篩選得到相關(guān)藥物靶點，構(gòu)建“藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)”，預(yù)測藥物的作用機制，另一種則是利用公共數(shù)據(jù)篩選藥物成分信息、藥效及藥理作用等預(yù)測藥物可能作用的靶點分子，進一步構(gòu)建“藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)”，再從分子網(wǎng)絡(luò)平衡角度解析藥物作用機制，從而預(yù)測藥物作用機制。中藥復(fù)方藥味多，成分復(fù)雜，可采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法對復(fù)方化學(xué)成分及作用靶點進行篩選和預(yù)測。對于炮制的中藥復(fù)方，可以先通過組學(xué)技術(shù)預(yù)測其作用靶點，初步篩選出藥物作用靶點，然后通過構(gòu)建中藥炮制前后的有效組分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)來預(yù)測炮制藥物作用機制。但目前關(guān)于中藥復(fù)方炮制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究較少，公共數(shù)據(jù)庫中炮制化學(xué)成分變化的信息不夠全面，因此傳統(tǒng)的用藥理論與現(xiàn)代技術(shù)是否能高度擬合闡明其作用機制還有待研究。

此外，還有基于線粒體為靶點進行的中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究，如采用離心超濾(CU)技術(shù)與液質(zhì)(LC/MS)相結(jié)合，對以線粒體為靶點的中藥活性成分進行篩選、分離與鑒定，對線粒體活細(xì)胞熒光標(biāo)記再對其熒光成像分析篩選中藥活性物質(zhì)，將篩選出的中藥有效成分組/群結(jié)合線粒體靶標(biāo)分析得到物質(zhì)基礎(chǔ)以及以線粒體能量代謝為靶標(biāo)研究中藥有效物質(zhì)基礎(chǔ)等[21]。目前這些方法正用于中藥及其復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究，但用于復(fù)方炮制品物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明是否合理還有待實驗研究。

3 復(fù)方炮制機制闡明

目前，有關(guān)中藥炮制機制的研究主要是通過化學(xué)成分改變和傳統(tǒng)藥效學(xué)改變的角度進行闡述，能夠較為明確地闡明部分中藥飲片的炮制機制，使中藥炮制機制研究取得了較大的突破和發(fā)展。

吳珊珊[8]以縮泉丸補腎縮尿為切入點，以腎陽虛多尿大鼠為模型，從腎相關(guān)臟器指數(shù)及病理形態(tài)、腎功能、免疫功能探究益智仁鹽炙后組方的“補腎”作用，又從機體水液代謝方面佐證腎主水，可調(diào)節(jié)全身水液代謝的作用。從復(fù)方證治角度闡述中醫(yī)藥理論“鹽炙入腎-腎主水”的作用機理，也證實了藥物炮制入藥增強療效的合理性。張希等[9]以五子衍宗丸補腎益精、澀精止瀉等功效為基礎(chǔ)，根據(jù)單味藥炮制篩選結(jié)果組成復(fù)方，以腎精虧虛模型大鼠的精子密度和活率為藥效表征，探討五味子、覆盆子鹽制前后組成五子衍宗丸的“補腎”作用。廖宇嬌等[22]通過檢測腎精虧虛模型大鼠睪丸中B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的表達(dá)水平探討不同炮制品組成五子衍宗丸的“生精”作用。楊卓等[23-24]以血清免疫球蛋白G(IgG)、白細(xì)胞介素Ⅱ(IL-2)、白細(xì)胞介素Ⅵ(IL-6)及T淋巴細(xì)胞亞群表征研究五子衍宗丸中藥物鹽制對以腎精虧虛模型大鼠免疫功能的調(diào)控效應(yīng)。通過其促進T淋巴細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)平衡以及對TGF-β1/Smads信號通路的調(diào)控作用，從復(fù)方角度共同闡明“鹽炙入腎-腎主生殖”的炮制作用機理。陳志敏等[17]闡述的利用代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合相應(yīng)的復(fù)方和中醫(yī)證候模型，以血清和尿液差異代謝物為標(biāo)志物，利用代謝組學(xué)體現(xiàn)二神丸中補骨脂、肉豆蔻炮制增效的機理，結(jié)果與傳統(tǒng)中藥炮制理論“補骨脂鹽炙溫補脾腎、肉豆蔻煨制免于滑腸”相符合。

目前，有關(guān)復(fù)方探討藥物炮制機制的研究較少，而炮制機制的研究與深入炮制運用于臨床的必要途徑。對于炮制前后中藥的變化以及對機體代謝途徑和網(wǎng)絡(luò)機制等方面的研究，不僅有利于臨床中藥炮制學(xué)的發(fā)展，更有利于中藥炮制理論科學(xué)內(nèi)涵的完善。

4 討論

隨著中醫(yī)藥理論的不斷發(fā)展，炮制品在臨床中的運用也愈加頻繁。對于中藥生熟異用的研究也越來越多，但是由于中藥本身由多種成分組成，某些中藥通過繁雜的炮制工藝化學(xué)成分會發(fā)生巨大變化。中藥復(fù)方藥味太多，煎煮過程中各成分間相互反應(yīng)、碰撞、聚集，導(dǎo)致對于物質(zhì)基礎(chǔ)的把控及炮制機理的研究難度增大。此外，中藥炮制過程不僅是通過加工方式使化學(xué)成分變化或藥物本身與輔料相互加和的簡單加工，還有在機體吸收發(fā)揮藥效過程中內(nèi)源性代謝性產(chǎn)物及其次生代謝產(chǎn)物機制的參與。另外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)需要對中藥數(shù)據(jù)庫進行大量搜索，但目前中藥炮制品的化學(xué)成分在數(shù)據(jù)庫中還未被完全發(fā)掘，藥理藥效與化學(xué)成分的關(guān)聯(lián)性還不足以形成“成分-靶點-疾病”的網(wǎng)絡(luò)機制，因此對于炮制品更多集中于物質(zhì)基礎(chǔ)研究階段，這也是中藥炮制研究中的巨大難題。相關(guān)學(xué)者也認(rèn)為將復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)與炮制機理相結(jié)合，利用現(xiàn)代相關(guān)組學(xué)技術(shù)來闡明炮制機制，才能更好地在臨床合理使用炮制品，使中醫(yī)臨床治療效果最大化。