天然產(chǎn)物及三氮唑類化合物與溴結(jié)構(gòu)域BDR4的分子對(duì)接研究

孔祥薇，馮宇翔，張?jiān)萍t，戴 康

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430074)

賴氨酸殘基的乙?；徽J(rèn)為在組蛋白的翻譯后修飾中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。人類基因組編碼46種蛋白質(zhì)，包含61個(gè)BRD，包括溴結(jié)構(gòu)域和末端外(BET)蛋白質(zhì)家族[2]。該BET家族包括四個(gè)蛋白：BRD2、BRD3、BRD4和BRDT(睪丸特異性表達(dá)，它們?cè)谡{(diào)節(jié)RNA聚合酶II(Pol II)的轉(zhuǎn)錄方面發(fā)揮著不同的作用[3])。所有四種BET蛋白的共同點(diǎn)是兩個(gè)保守的N端溴結(jié)構(gòu)域(BD1和BD2)，它們是染色質(zhì)相互作用模塊，可識(shí)別組蛋白尾部和其他核蛋白上的乙?；嚢彼釟埢鵞4]。因此，BET蛋白是正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表觀遺傳信息的關(guān)鍵“閱讀器”。

BET家族中研究最多的是BRD4，與其他BET蛋白的染色質(zhì)結(jié)合特性一致，BRD4優(yōu)先結(jié)合乙?；M蛋白H3和H4，不同的是BRD4與染色質(zhì)的結(jié)合在整個(gè)細(xì)胞周期中保持不變[5-6]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明BRD4與PTEFb相關(guān)，PTEFb是一種已知的RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，能夠通過(guò)磷酸化 RNA聚合酶II延伸復(fù)合物來(lái)激活暫停的RNA聚合酶II[7]。BRD4阻止 PTEFb與7SK/HEXIM相關(guān)聯(lián)，從而使PTEFb保持其活性形式，從而實(shí)現(xiàn)RNA聚合酶II延伸和基因轉(zhuǎn)錄。因此，BRD4作為乙?；M蛋白和基因轉(zhuǎn)錄之間的紐帶。

BET蛋白被證實(shí)是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑取代染色質(zhì)中的溴結(jié)構(gòu)域以影響基因表達(dá)變化的有希望的治療靶點(diǎn)。因此，開(kāi)發(fā)用于癌癥治療的新型BET抑制劑代表了尋找抗癌癥藥物的一種新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 研究工具和材料

本研究采用Tripos的SYBYL-X2.1.1軟件進(jìn)行分子對(duì)接。使用ChemBioDraw繪制小分子結(jié)構(gòu)，并用 ChemBio3D轉(zhuǎn)換小分子的結(jié)構(gòu)格式。7MLQ的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)自PBD數(shù)據(jù)庫(kù) (https：//www1.rcsb.org/structure/7MLQ)。

1.2 小分子配體文件準(zhǔn)備

在PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(kù)中查找和三氮唑有一定結(jié)構(gòu)相似性的藥物如花青素(Anthocyanin)、苦參堿(Matrine)、喜樹(shù)堿(Camptothecin)和紫杉醇(Taxol)結(jié)構(gòu)。根據(jù)文獻(xiàn)將26個(gè)4-甲基-1，2，3-三氮唑小分子配體文件通過(guò)Chemoffice軟件畫出2D結(jié)構(gòu)圖[8]，再用ChemoBio 3D軟件將2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)保存下來(lái)留作備用。文件格式轉(zhuǎn)換為mol2。最后利用SYBYL軟件對(duì)小分子配體文件化合物進(jìn)行優(yōu)化：①給小分子配體文件加電荷；②對(duì)小分子配體文件進(jìn)行能量?jī)?yōu)化。接著把所有小分子配體文件保存成配體文件數(shù)據(jù)庫(kù)備用。

1.3 受體文件準(zhǔn)備

在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載編號(hào)為7MLQ的含溴結(jié)構(gòu)域蛋白 4(BDR4)受體文件，再在SYBYL軟件中處理受體文件：①先刪除受體文件中的水分子；②分析大分子結(jié)構(gòu)；③對(duì)受體文件添加氫；④對(duì)受體文件添加電荷；⑤提取復(fù)合物晶體中的配體小分子。

1.4 分子對(duì)接

通過(guò)SYBYL軟件，將已經(jīng)處理好的配體文件化合物分子作為配體和7MLQ晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對(duì)接運(yùn)算。對(duì)接設(shè)置包括分別以sfxc和Mol2文件格式上傳準(zhǔn)備好的蛋白質(zhì)和配體。對(duì)接研究使用默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行。

2 結(jié)果與討論

受體與配體活性位點(diǎn)之間的結(jié)合親和力的穩(wěn)定性用打分函數(shù)判定，即分?jǐn)?shù)越高，配體和受體結(jié)合也就越穩(wěn)定。四個(gè)天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和分子對(duì)接打分函數(shù)見(jiàn)表1，26個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)和分子對(duì)接打分函數(shù)分別見(jiàn)圖1和表2。同時(shí)也用BET抑制劑iBET-151作為對(duì)照，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2，對(duì)接打分函數(shù)為6.495 1。結(jié)果表明四個(gè)天然化學(xué)產(chǎn)物中結(jié)果都大于6.4，其中花青素得分最高為7.451 4，紫杉醇得分最低為6.440 3。另外在26個(gè)化合物中有16個(gè)化合物的打分結(jié)果大于7，有20個(gè)化合物的打分函數(shù)高于對(duì)照分子，其中化合物8的打分結(jié)果最高為8.704 0。

圖1 4-甲基-1，2，3-三唑母核結(jié)構(gòu)

圖2 抑制劑iBET-151結(jié)構(gòu)

表1 天然產(chǎn)物打分結(jié)果

表2 化合結(jié)構(gòu)和對(duì)接打分結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明這些化合物與靶點(diǎn)蛋白BRD4有良好的親和力。該類抑制劑的分子結(jié)構(gòu)主要由4-甲基-1，2，3-三氮唑組成，在1位有一個(gè)哌啶環(huán)上的取代基，5位有一個(gè)吡啶環(huán)上的取代基。通過(guò)打分函數(shù)，發(fā)現(xiàn)5位有一個(gè)吡啶環(huán)上的取代基為芳基取代時(shí)最好。

化合8與靶蛋白BDR4的對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。從復(fù)合物的三維模擬圖(見(jiàn)圖3)上可以看出氫鍵主要形成在PRO87、VAL87和CYS136 3個(gè)氨基酸殘疾上，說(shuō)明3個(gè)氨基酸殘基在相互作用中起到了關(guān)鍵性的影響。在二維圖(見(jiàn)圖3)中可看出，除了3個(gè)氨基酸殘基參與形成氫鍵以外，ALA89、TYR98、TYR97和PRO104形成了Pi-Alkyl作用。通過(guò)研究其他25個(gè)分子的分子對(duì)接，也得到了相似的結(jié)果(文中未列出)。

圖3 化合物8對(duì)接三維模擬圖

圖4 化合物8對(duì)接二維模擬圖

3 結(jié)論

本文選取了4個(gè)天然化學(xué)產(chǎn)物和已報(bào)道的26個(gè)合成三氮唑類BET抑制劑為配體分子，將其與BET的BDR4的三維結(jié)構(gòu)(7MLQ)進(jìn)行了分子對(duì)接，并用BET抑制劑iBET-151作為對(duì)照。分子對(duì)接的結(jié)果表明，4個(gè)天然化學(xué)產(chǎn)物結(jié)果都大于6.4，其中花青素得分最高為7.451 4，紫杉醇得分最低為6.440 3。王華等[9]發(fā)現(xiàn)花青素是通過(guò)抑制分裂素蛋白致活酶的活性從而發(fā)揮抗癌作用。目前關(guān)于花青素等天然產(chǎn)物的研究不完整，關(guān)于它們抗癌作用機(jī)制還不明確，需要進(jìn)一步研究。

26個(gè)化合物中16個(gè)化合物的打分結(jié)果大于7，20個(gè)化合物的打分函數(shù)高于對(duì)照分子，其中化合物8的打分結(jié)果最高為8.704 0。三氮唑類5位吡啶環(huán)上取代基為芳基取代時(shí)，能與周圍的氨基酸殘基形成穩(wěn)定的氫鍵和螯合鍵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，這26個(gè)藥物能夠較好地抑制BDR4的活性。

BRD4不僅對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控至關(guān)重要，而且還是基因組穩(wěn)定性的守護(hù)者[10]。由于BET 蛋白的溴結(jié)構(gòu)域在家族成員之間具有約75%的同一性，因此能否實(shí)現(xiàn)高選擇性化學(xué)探針仍不確定。靶向BRD4相互作用蛋白的小分子可能是一種以提高選擇性的方式治療性干擾轉(zhuǎn)錄的額外策略。因此，BET抑制劑在治療癌癥方面具有廣泛的應(yīng)用前景。