銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)的純化工藝研究

譚琪明，李 俊，何 珺

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.貴州大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

銀杏為銀杏科銀杏屬植物。銀杏是裸子植物類，是目前地球上唯一能幸存下來(lái)的銀杏科銀杏屬植物，又稱為“活化石”[1]。銀杏分布地廣泛，在中國(guó)、朝鮮、韓國(guó)、日本、加拿大、澳大利亞、新西蘭、法國(guó)、美國(guó)、俄羅斯等國(guó)家和地區(qū)均有種植。從地理資源分布來(lái)看，中國(guó)是世界上銀杏的主產(chǎn)區(qū)，主產(chǎn)于貴州、四川、湖南、河北、江蘇、山東、廣西、湖北、河南、浙江等省區(qū)。中國(guó)的銀杏跨越北緯2l°30′～41°46′，東經(jīng)97°～125°，遍及22個(gè)省及自治區(qū)和3個(gè)直轄市，主要分布于溫帶和亞熱帶氣候區(qū)[2]。銀杏既是國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物，也是我國(guó)傳統(tǒng)重要的經(jīng)濟(jì)林和綠化樹(shù)種。中國(guó)的銀杏資源占全世界的85%，銀杏種植面積約40萬(wàn)m2，栽培數(shù)量達(dá)25億株以上，銀杏種植每年都以2 000～2 500萬(wàn)株速度遞增[3]。銀杏葉是銀杏的干燥葉子，目前相當(dāng)多資料表明，銀杏葉具有斂肺、活血化瘀、止痛等功效，對(duì)冠心病、咳喘病、高脂血癥、心絞痛等疾病有一定的治療作用[4-5]。其最為主要的化學(xué)成分有黃酮類、萜內(nèi)酯類、有機(jī)酸、多糖類等[6]。目前，已知銀杏提取物的化學(xué)成分有200多種，其中藥用成分有170余種，主要有黃酮類、萜內(nèi)酯類、有機(jī)酸類、糖類、醇類、酮類、生物堿類、氨基酸微量元素及其他(維生素、葉綠體、生物堿類等)[7]。銀杏葉提取物及其制劑可用于健康食品、醫(yī)藥、化妝品及生物農(nóng)藥和生物飼料[8]，但銀杏葉提取物在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量廢棄液，而這些廢棄液都直接廢棄掉。

本研究對(duì)銀杏葉提取物生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄液中蛋白質(zhì)成分進(jìn)行綜合回收利用，從廢棄液中分離制備出含量較高的蛋白質(zhì)，一方面，銀杏葉蛋白質(zhì)含有豐富的亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸和色氨酸，該6種人體必需氨基酸的含量達(dá)424.89 mg/g蛋白質(zhì)[9]，故從銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液來(lái)提取蛋白質(zhì)，變廢為寶，為保健品、蛋白粉等開(kāi)發(fā)以及作為精飼料的添加提供原料保證；另一方面，由于銀杏葉生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)含量較高，因此，通過(guò)從銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液來(lái)提取蛋白質(zhì)，可以增加蛋白質(zhì)的來(lái)源途徑。蛋白質(zhì)是整個(gè)人類生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，無(wú)論是人類還是動(dòng)物都離不開(kāi)生命物質(zhì)蛋白質(zhì)，但是迄今為止，世界上仍然大約有1/5的人口缺乏蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)資源短缺和蛋白質(zhì)來(lái)源匱乏顯然已經(jīng)是當(dāng)今世界尤其是發(fā)展中國(guó)家亟須解決的重大問(wèn)題。

因此，探索新的蛋白質(zhì)資源途徑具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義，故采用廉價(jià)原料、試劑與儀器，設(shè)計(jì)出合適的工藝路線，為蛋白質(zhì)的生產(chǎn)打開(kāi)新的大門，為蛋白質(zhì)資源短缺提供緩沖的機(jī)會(huì)，同時(shí)也為廠家節(jié)約成本，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益最大化。因此有必要對(duì)銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)的純化工藝進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器及試劑 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京))、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Cary 60 UV-Vis Agilent Technologies)、分液漏斗(泰州市康之達(dá)實(shí)驗(yàn)器材)等；乙醇(分析純，重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠)，正丁醇(分析純，上海申博化工)，三氯甲烷(重慶川江化學(xué)試劑廠家)，氫氧化鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，酒石酸鉀鈉(成都金山化學(xué)試劑有限公司)，無(wú)水硫酸銅(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，乙酸乙酯(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)等。

1.1.2 供試材料 酪蛋白對(duì)照品(上海廣銳生物科技有限公司)；銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液(浙江和陜西：廠家要求保密，不便于透露)。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)定方法 本文選用雙縮脲比色法測(cè)定銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液中的蛋白質(zhì)，其原理是：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與銅離子產(chǎn)生紫紅色反應(yīng)，肽鍵越多反應(yīng)就越明顯。雙縮脲試劑使用的是“1.2.1”中①項(xiàng)下配制的。使用電子天平精密稱定浸膏并加純水稀釋，再加相應(yīng)的雙縮脲溶液反應(yīng)，然后在560 nm波長(zhǎng)處，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。根據(jù)回歸曲線方程：y=0.064 5x-0.000 4，R2=0.998計(jì)算相應(yīng)的濃度。再結(jié)合以下兩個(gè)公式即可算出蛋白質(zhì)的含量。

蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg)=測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)× 樣液體積(mL)

蛋白質(zhì)含量=蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg)/樣品的質(zhì)量(mg)×100%

(1)雙縮脲試劑的配制：使用電子天平精密稱定30.15 g氫氧化鈉溶于300 mL水中得到A液，使用電子天平精密稱定質(zhì)量為5.99 g的酒石酸鉀鈉和質(zhì)量為1.50 g的無(wú)水硫酸銅，然后溶解在500 mL的水中并混勻即得到B液，將A液和B液混合并搖勻即可得到雙縮脲試劑。

(2)0.05 mol/mL氫氧化鈉溶液使用電子天平精密稱取0.60 g氫氧化鈉溶于300 mL的蒸餾水中，攪拌混勻備用。

1.2.2 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 用分析天平精密稱定1.49 g酪蛋白于制備好的0.05 mol/mL的氫氧化鈉溶液當(dāng)中，攪拌混勻即可得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.3 樣品溶液制備 將來(lái)自不同廠家的銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄物料液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮得浸膏備用。

1.2.4 線性關(guān)系考察 取7支具塞試管，按梯度要求精密移取酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后向7支具塞試管中立即加入6 mL的雙縮脲試劑，振蕩均勻，各管加完后將其置于室溫下反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為30 min，然后在波長(zhǎng)為560 nm下，以0管為空白對(duì)照，迅速逐一測(cè)量各管的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品酪蛋白的濃度作為橫坐標(biāo)，以各管的吸光度值作為縱坐標(biāo)，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1：酪蛋白的線性范圍為(0.50～5.00) mg·mL-1，結(jié)果顯示R2>0.99具有良好的線性關(guān)系。

圖1 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

將不同廠家的銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液按上述“1.2.3”進(jìn)行前處理，然后精密移取5 mL純水加入“1.2.3”的樣品中，然后再移取2 mL溶液，分別加入6 mL的雙縮脲試劑，搖勻，靜置30 min，再按“1.2.1”進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩個(gè)廠家的銀杏葉提取物生產(chǎn)廢液中蛋白質(zhì)含量

結(jié)果表明：廠家不同，銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)含量不同，其中浙江廠家的蛋白質(zhì)含量為3.93%～5.09%，陜西廠家為8.34%～14.10%，原因是兩個(gè)廠家生產(chǎn)工藝不同，其中浙江廠家采用高濃度乙醇提取，而陜西廠家采用低醇提取。

2.2 銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)分離純化工藝研究

2.2.1 超濾純化研究 200 kg銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液浸膏，加純水200 kg，攪拌均勻后進(jìn)行超濾，中間補(bǔ)水3次，每次加200 kg純水，透過(guò)液為超濾液，將該超濾液濃縮為浸膏。然后取樣，在向裝有樣品的試管里加入5 mL純水稀釋，取出2 mL溶液，再加入雙縮脲試劑，反應(yīng)時(shí)間為30 min，再按“1.2.1”進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

結(jié)果顯示，原料1經(jīng)過(guò)超濾后含量由3.93%提升到14.29%，原料2經(jīng)過(guò)超濾后含量由8.34%提升到44.38%，采用超濾的純化方式可以將蛋白質(zhì)含量提升5倍左右，表明該方法對(duì)蛋白質(zhì)的分離純化有顯著的作用，可以運(yùn)用到蛋白質(zhì)的分離純化工藝當(dāng)中。

2.2.2 萃取純化研究 量取80 mL的純水加入到裝有64.70 g原料浸膏的燒杯中溶解，將溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，再加入20 mL乙酸乙酯，雙手托住分液漏斗，右手按住瓶塞，水平放置且上下振蕩，并將分液漏斗傾斜45°，打開(kāi)活塞，將氣泡排除。然后將其放置在鐵架臺(tái)上，靜置分層，等到分層足夠明顯時(shí)，將下層的液體從下面放出去，將上層的液體從上面倒出來(lái)，然后留樣。重復(fù)上述操作4次。將每次的樣品加入純水稀釋5倍，然后用移液管取出2 mL于比色管中，并加入6 mL的雙縮脲溶液，反應(yīng)30 min，再按“1.2.1”進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 萃取結(jié)果

結(jié)果表明，采用乙酸乙酯萃取來(lái)分離純化銀杏葉提取物柱層析廢棄液中的蛋白質(zhì)，是沒(méi)有純化效果，說(shuō)明該原料液中溶于乙酸乙酯的有機(jī)物含量很少。

2.2.3 醇沉純化研究 醇沉的原理：在蛋白質(zhì)溶液中加入一定量與水可以互溶的乙醇，使蛋白質(zhì)表面失去水化層相互聚集而沉淀[10]。精密稱取浸膏165 g，在溫度為80 ℃水浴中加入500 mL 95%乙醇。加入乙醇的同時(shí)要不停攪拌，然后在常溫靜置沉淀，到深棕色沉淀變?yōu)槊S色沉淀時(shí)，將上清液傾出，將沉淀部分進(jìn)行取樣。然后重復(fù)操作兩次并取樣。然后在向裝有樣品的試管里加入5 mL純水稀釋，取出2 mL溶液，再加入雙縮脲試劑，反應(yīng)30 min后，再按“1.2.1”進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 醇沉結(jié)果

從醇沉結(jié)果可以看出，含量從14.29%提升至34.62%，有顯著的提升。從表5可以看出，醇沉次數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的提升并沒(méi)有顯著的影響，結(jié)合生產(chǎn)成本、生產(chǎn)效率等方面的影響，選用醇沉次數(shù)為1次。

綜上，最終蛋白質(zhì)的分離純化選用超濾和醇沉這兩種方式。

3 結(jié)論

由上述結(jié)果可知，對(duì)銀杏葉生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化時(shí)，采用乙酸乙酯萃取不會(huì)提高蛋白質(zhì)的純度，有效提高蛋白質(zhì)純度的方法主要是超濾和醇沉，經(jīng)超濾和醇沉結(jié)合工藝進(jìn)行銀杏葉蛋白質(zhì)的純化，可以將蛋白質(zhì)含量為8.43%的原料純化蛋白質(zhì)含量86.20%的產(chǎn)品。綜上所述，對(duì)銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液中蛋白質(zhì)成分，采用超濾和醇沉進(jìn)行純化，就能夠大幅提高蛋白質(zhì)純度，且操作簡(jiǎn)單可行，工藝路線穩(wěn)定。

4 討論

對(duì)銀杏葉提取物生產(chǎn)的廢棄液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提純工藝研究，本論文采用銀杏葉提取物生產(chǎn)廢棄液為原料，分別采用萃取、超濾、醇沉三種方式進(jìn)行純化研究，萃取的方式對(duì)蛋白質(zhì)的分離純化沒(méi)有顯著的效果，說(shuō)明原料中有機(jī)類物雜質(zhì)很少；利用超濾的方式可以將蛋白質(zhì)含量提升5倍左右，是利用了蛋白質(zhì)分子量大，與小分子雜質(zhì)可以有效分離；而醇沉的方式可以將蛋白質(zhì)含量提高2倍左右，主要是利用了蛋白質(zhì)不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)來(lái)純化。