赤芍中24種無機元素分析

尹亞玲，姚藝新，王曉曉*，李祥蘭，孫 刻

(1.德陽市食品藥品檢驗檢測中心，四川 德陽 618000；2.康美藥業(yè)股份有限公司，廣東 普寧 515300)

赤芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactiforcPali.或川赤芍PaeoniaveitchiiLynch的干燥根，具有清熱涼血、散瘀止痛的功效[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，赤芍主要含有芍藥苷等為代表的單萜苷類，此外，還含有酚類、鞣質和黃酮等化合物[2-3]。近年來，赤芍被廣泛應用于治療心血管系統(tǒng)疾病，還具有抗腫瘤、保肝、鎮(zhèn)痛、降壓、抗?jié)兊人幚碜饔肹4-7]。目前的研究中，關于赤芍有效成分、指紋圖譜和藥理作用的研究較多，但關于赤芍中無機元素的研究報道較少。

無機元素雖然不是中藥治療疾病的主要藥效物質，但卻對有效成分的積累和藥效的發(fā)揮起著重要的作用。高濃度的鎘處理對丹參有效成分的積累有一定的促進作用，適度的缺乏Cu和K可促進蒼術次生代謝產物的積累[8-11]。Zn、Ca和Fe元素是止血類中藥的共同特征無機元素；K和Mg元素能夠影響活血化瘀藥的藥性；Fe和Mn元素的含量差異是“寒涼溫熱”的藥性物質基礎等[12-14]。因此，明確中藥中無機元素的組成和含量可為中藥的質量評價提供科學依據(jù)。本研究擬以中江種植的赤芍作為研究對象，采用ICP-MS測定其中24種無機元素的含量，探索其無機元素的分布規(guī)律，為赤芍中無機元素組成和藥效關系研究提供參考。

1 儀器與試劑

電子天平(SX205，MS205DU，max=220 g/121 g，d=0.01 mg，梅特勒-托利多有限公司)；KQ-700DV數(shù)控超聲清洗儀(昆山市儀器超聲有限公司)；CEM微波消解儀(奧地利安東帕公司)；電熱消解儀(EHD-24，北京東航科技儀器有限公司)；ICP-MS 7900電感耦合等離子體質譜儀(安捷倫科技有限公司)。

多元素標準溶液(Al、As、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、Hg、K、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Ti、V、Zn)(100 μg·mL-1)由國家有色金屬及電子材料分析測試中心提供。Bi、Ge、In、Li、Sc和Tb的混合內標溶液(安捷倫有限公司，10 μg·mL-1)，硝酸為離子級(成都市科隆化學品有限公司)；超純水由優(yōu)普超純水器(ULPHW-111-10T型，四川優(yōu)普超純科技有限公司)制備。37份藥材樣品均從四川中江縣集鳳鎮(zhèn)和石泉鄉(xiāng)采集，經(jīng)李茂森主任中藥師鑒定為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的根，樣品信息見表1。

表1 37份赤芍樣品來源

2 方法

2.1 多元素混合對照品溶液的制備

根據(jù)樣品中無機元素的水平分別配制三個水平濃度的混合對照溶液。用多元素混合標準母液，以5%優(yōu)級純HNO3為介質配制質量分數(shù)為0、0.5、2、5、10、20 ng·mL-1的溶液，供測定Hg使用；用質量分數(shù)為0、5、20、50、80、120 ng·mL-1的溶液，供測定Ti、V、Co、Cu、Ga、As、Se、Rb、Cd、Pb用；其余無機元素供質量分數(shù)為0、20、50、100、200、500 ng·mL-1的對照溶液使用。配制好的對照品溶液均過0.45 μm的微孔濾膜。

2.2 內標溶液的制備

精密量取混合內標液適量，用水稀釋制成每1 mL各含200 ng的混合溶液，即得。

2.3 ICP-MS的測定條件

等離子射頻功率1 550 W，等離子氣體15 L·min-1，輔助氣體流量1.03 L·min-1，霧化氣流量1.03 L·min-1，補償/稀釋氣體1 L·min-1，霧化室溫度2 ℃，蠕動泵速度0.1 rps。采樣深度8.0 mm，積分時間1 s，延遲時間1 s，重復次數(shù)3次；測量方式：標準曲線法；讀數(shù)方式：峰強。以73Ge、115In、209Bi為內標，監(jiān)測信號的變動情況，能有效克服儀器信號的漂移和校正基體效應。

2.4 供試品溶液制備

取赤芍樣品粉末0.2 g(過5號篩)，精密稱定，倒入聚四氟乙烯消解罐中，置于通風櫥，加入濃硝酸8 mL，放置過夜。第2天放入微波消解儀中，按設定的消解程序處理：先經(jīng)10 min由室溫升至130 ℃，并維持5 min消解，然后10 min由130 ℃升至165 ℃，并維持10 min消解，然后15 min由165 ℃升至180 ℃，并維持40 min消解。消解完畢后，冷卻至室溫，取出消解罐，在通風櫥中將消解罐中液體揮發(fā)至2～3 mL，轉移，用去離子水定容至50 mL。同步以濃硝酸8 mL做空白試驗，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后上機測定。

2.5 標準曲線繪制

取多元素的混合標準品母液，依次測定24種無機元素的系列質量濃度標準溶液，內標進樣管始終插入內標溶液。以標準品質量濃度為橫坐標(X)，以重金屬元素分析峰信號值與內標元素參比峰響應值的比值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得無機元素標準品的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍。結果各無機元素在對應范圍內線性良好，詳見表2。

表2 24種無機元素標準曲線

2.6 樣品的重金屬元素測定

按照“2.4”項下方法制備供試品溶液。在設定的實驗條件下，測定37份樣品中24種無機元素的含量，結果采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。在方法學考察方面，參考項目組已發(fā)表的文章[15-16]。

3 結果與分析3.1 赤芍中無機元素的測定結果

赤芍中含有豐富的無機元素，其中24種無機元素的含量差異較大，根據(jù)無機元素在體內的含量高低，可分為常量元素和微量元素。常量元素中，K的平均含量最高，質量分數(shù)為3 797.10 mg·kg-1；其次含量較高的為Ca(1 041.17 mg·kg-1)、Mg(985.55 mg·kg-1)和Na(450.64 mg·kg-1)。微量元素中含量最高的是Fe(696.48 mg·kg-1)，其次是Cr(117.11 mg·kg-1)、Al(106.18 mg·kg-1)、Sb(86.05 mg·kg-1)；含量最低的是Hg(0.004 7 mg·kg-1)。

就重金屬而言，平均含量由高到低依次為Cu、Pb、As、Cd、Hg。在測定的37份赤芍樣品中，Cu在4.94～10.90 mg·kg-1，均值7.56 mg·kg-1；Pb在0.26～2.03 mg·kg-1，均值為0.80 mg·kg-1；As在0.12～2.00 mg·kg-1，均值為0.54 mg·kg-1；Cd在0.01～0.83 mg·kg-1，均值為0.26 mg·kg-1；Hg在0.001 0～0.021 6 mg·kg-1，均值為0.004 7 mg·kg-1。參照《中草藥重金屬限量國際標準ISO 18664：2015》以及《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》規(guī)定重金屬的限量標準，Pb≤5.0 mg·kg-1，Cd≤0.3 mg·kg-1，Hg≤0.2 mg·kg-1，As≤2.0 mg·kg-1，Cu≤20.0 mg·kg-1。37份赤芍樣品中，有12份樣品的Cd超標，超標率達33%，結果見表3。

表3 赤芍中24種無機元素的質量分數(shù) (mg·kg-1)

續(xù)表3(mg·kg-1)

3.2 赤芍特征圖譜的建立

為了便于元素之間含量的比較分析，把一些無機元素含量差異極大的原始值同時擴大或縮小相同倍數(shù)至同一數(shù)量級，24種無機元素的相對含量略有差異，但其整體無機元素分布規(guī)律卻呈現(xiàn)相似的分布態(tài)勢。故質量分數(shù)分布圖可作為赤芍的無機元素特征圖譜，見圖1、圖2。

圖1 37份赤芍中24種無機元素的特征圖譜

圖2 赤芍中24無機元素的平均特征圖譜

3.3 無機元素間相關性分析

無機元素之間存在一定的相互作用，在一定程度上能夠起到相互協(xié)同或拮抗的作用。為明確赤芍中具體的無機元素作用關系，本研究對24種無機元素含量進行了相關性分析。在正態(tài)性檢驗結果中僅Mg、Al、V、Cu、Zn、Se、Rb和Sr含量服從正態(tài)分布，因此采用Spearman等級相關系數(shù)法計算元素間相關系數(shù)；其中76對元素呈極顯著的正相關(P<0.01)：Sr與Na；Al、K、V、Mn、Co、Cu、Zn、Ga、As、Rb、Sr、Pb與Mg，Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Ga、As、Rb、Pb與Al；Ca、V、Zn、Sr與K，Sr與Ca；V、Cr、Fe與Ti；Cr、Fe、Co、Zn、Ga、As、Pb與V；Fe、Co、Zn、Ga、As、Pb與Cr；Co、Ni、Zn、Se、Rb與Mn；Co、Ga、As、Pb與Fe；Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Pb與Co；Se、Cd 與Ni；Zn、As、Rb與Cu；Ga、As、Rb、Sr、Pb 與Zn；As、Rb與Ga；As與Pb；Sr、Cd與Se。21對元素呈顯著正相關(P<0.05)：Cd-Na、As-K、Pb-K、Ca-Sb、Ca-Pb、V-Cu、Mn-Cr、Cu-Cr、Ba-Cr、Cu-Mn、As-Mn、Rb-Mn、Cd-Mn、Pb-Mn、Sr-Ni、Hg-Ni、Ga-Cu、Pb-Cu、Zn-Pb、Ba-Se、Pb-Ba。1對元素Na-Ti呈極顯著負相關(P<0.01)，4對元素Na-Fe、Ca-Cd、V-Cd、Fe-Cd呈顯著負相關(P<0.05)。正相關表明赤芍樣品中上述元素在被吸收累積過程中具有很好的協(xié)調作用；而負相關表明上述5對元素在被吸收積累過程中具有拮抗作用。見表4。

表4 24種無機元素的相關性分析

3.4 無機元素的主成分分析

為了研究赤芍樣品中各元素的分布規(guī)律，本研究對24個元素進行了主成分分析，前7個主成分的特征值均>1，且累積貢獻率達85.176%>80%，可以代表赤芍無機元素的整體信息，客觀反映樣品中無機元素的內在質量，故選擇前7個主成分因子進行分析。表5是經(jīng)方差最大正交旋轉后的因子載荷矩陣，用以鑒別有實際意義的因子。從中可以看出，與第1主成分密切相關的是元素Al、V、Fe，與第2主成分密切相關的是Ga、Ni、Co，并且系數(shù)都超過0.8，與第3、4、5、6、7主成分密切相關的無機元素分別是Se、Ca、Ti、Sb、Hg、Ba。因此，選擇Al、V、Fe、Ga、Ni、Co、Se、Ca、Ti、Sb、Hg和Ba作為赤芍的特征無機元素，即赤芍無機元素組成特征的構成要素。見表6。

表5 主成分初始特征值和累積貢獻率

表6 旋轉的成分矩陣

4 討論

本研究采用ICP-MS法測定赤芍共37批次樣品中24種無機元素，明確了赤芍中無機元素的分布規(guī)律。赤芍以常量元素K、Mg、Ca、Na等較豐富，微量元素以Fe、Al、Cr、Sb等較為豐富。24種無機元素的相對含量存在一定的差異，但其整體無機元素分布規(guī)律卻呈現(xiàn)相似的分布態(tài)勢，故質量分數(shù)分布圖可作為赤芍的無機元素特征圖譜。在相關性分析中，多數(shù)無機元素呈正相關，說明元素在被吸收累積過程中具有很好的協(xié)調作用；少量無機元素呈負相關，表明無機元素在被吸收積累過程中具有拮抗作用。此外，通過主成分分析，得出Al、V、Fe、Ga、Ni、Co、Ca、Ti、Sb、Hg和Ba為赤芍的特征無機元素。

無機元素的存在對中藥臨床療效有重大的影響作用，一方面直接參與調節(jié)人體的必須元素，影響機體功能，發(fā)揮不同功效。K、Mg、Na和Ca是人體必需的常量元素，F(xiàn)e、Se、Cr、Co、Ni、Ga和V這6種微量元素對人體健康有重要的調控作用；而Cd、Ti、Pb、Sb、Hg、Al則為有害微量元素。K能維持人體的滲透壓平衡，擴張血管，有助于受傷部位瘀血消散，參與細胞代謝和酶促反應；Cr是胰島激素的輔助因子，Co是維生素B12的重要組成部分，主要功能是調節(jié)血糖代謝，促進蛋白質代謝合成。Fe參與能量代謝和造血功能，Se的主要生物學功能是血液和組織中谷胱甘肽過氧化物酶的必須組成成分[17-18]。Al超標對兒童的影響主要表現(xiàn)為影響孩子骨骼的生長，孩子智力也會受到一定的影響；Cd對兒童的成長具有明顯的毒害作用[19]。無機元素作為生長因子之一，通過環(huán)境脅迫影響植物的次生代謝產物，間接影響中藥有效成分的積累。有關學者研究發(fā)現(xiàn)，適度缺乏Cu和K可促進蒼術的生長發(fā)育及次生代謝產物的積累[9，20-21]。龍膽中龍膽環(huán)烯醚萜類成分含量與土壤中K含量有關[22]，土壤中B、Fe含量提高，土壤中含有少量的Cu、Mn和Zn元素，可促進人參中人參皂苷的積累[23-24]。

重金屬元素及有害元素是安全性評價的重要指標，根據(jù)《綠色行業(yè)標準》的規(guī)定，37份赤芍樣品中5種重金屬元素中僅Cd超標，超標率為33%。有研究表明，不少藥用植物對重金屬元素都有富集作用。川芎和半夏對土壤中Cd富集性強，蔞蒿對Cd的富集系數(shù)>1，莖葉類藥材艾納香、青蒿、紅花、羊耳菊中Cd含量超標率也比較高[25-27]，說明Cd元素超標現(xiàn)象在我國不同產地及藥用部位的中藥材中普遍存在。雖然赤芍的Cd超標，但以水溶態(tài)為主的Cd能夠被水溶洗的方式去除，因此，芍藥在加工成白芍的過程在，經(jīng)過水洗和水煮，Cd含量已降低。為更客觀地評價赤芍的安全性，建議進一步研究Cd在赤芍加工為白芍和炮制過程的轉移率及殘留量。