耐鹽堿溶磷菌的篩選鑒定及其在大豆生長中的功能驗證

張美珍，王麗娜，劉 權(quán)，黃玉蘭，張玉先，殷奎德

（1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 大慶分院，黑龍江 大慶 163316；3. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

土壤鹽堿化是一個威脅生態(tài)環(huán)境的世界性難題，據(jù)調(diào)查統(tǒng)計，全球近3%的土壤資源受到了鹽分的影響[1]。我國鹽漬土面積約3 460 萬hm2，鹽堿化耕地面積為760萬hm2，占耕地總面積的1/5[2]。有效開發(fā)利用鹽堿土壤可以增加耕地面積，維持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。鹽堿土壤往往表現(xiàn)磷素缺乏，磷元素是僅次于氮的第二大限制作物生長的元素，其在作物生長發(fā)育過程中以及提高作物抗性方面發(fā)揮著重要作用[3-6]。磷元素缺乏會抑制作物細(xì)胞的形成，導(dǎo)致植株矮小、根系不發(fā)達(dá)、生長遲緩，最終影響作物產(chǎn)量。鹽堿土中以Na+、Cl-為主，土壤孔隙度減小，更容易板結(jié)，磷循環(huán)也受到了限制，導(dǎo)致土壤養(yǎng)分利用率降低，從而抑制作物的正常生長發(fā)育。此外，土壤的高pH 值和高鹽度會影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能，降低土壤微生物堿性磷酸酶等多種酶活性，嚴(yán)重抑制土壤中磷的有效性[7]。土壤中的磷元素分為有機磷和無機磷，其中有機磷含量占全磷的29%～90%[8]，但由于土壤的固定作用，有效磷含量很低，僅占全磷的0.1%[9]，使作物的生長發(fā)育受到了限制。農(nóng)業(yè)上常采用施用磷肥的方式解決缺磷問題，但是施入的磷肥大部分會形成難溶性的磷酸鹽積累在土壤中，從而降低磷肥的利用率[10]，因此，提高磷素利用率可以降低化肥的施用量。

溶磷菌可以將難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷供作物生長利用，在磷循環(huán)中起著重要作用。土壤中磷素的移動大部分呈有機磷形態(tài)，進(jìn)入植物根際的有機磷僅有一小部分可以被植物直接吸收，其余的都要經(jīng)過礦化變成無機磷才可以被吸收[11]。土壤中的有機磷需要溶磷菌分泌磷酸酶、植酸酶等進(jìn)行分解，phoD基因是細(xì)菌編碼堿性磷酸酶的3 個同源基因（phoA、phoD、phoX）之一[12]，并且最為關(guān)鍵。栗麗等[13]在土壤中加入溶磷菌，其可以分泌磷酸酶，使土壤磷酸酶活性顯著增加，進(jìn)而促進(jìn)植物對磷素的吸收。植酸（即肌醇六磷酸）是植物的磷酸儲存庫，植酸酶可以降解土壤中的植酸鹽釋放出磷素，其是由appA或phyA基因編碼的一種重要的有機磷礦化酶，負(fù)責(zé)土壤中有機磷的釋放[14]。有研究表明，植酸酶可以促進(jìn)植酸的水解釋放磷素，進(jìn)而促進(jìn)植物生長[15]。分離得到高效、耐鹽堿的溶磷促生菌對于鹽堿土壤的開發(fā)利用意義重大，以往研究得到的耐鹽堿溶磷菌多為溶解無機磷菌株。如劉萍等[16]篩選出的耐鹽堿高效溶磷菌屬于泛菌屬，其溶無機磷量為300 mg/L；楊海霞等[17]篩選出的耐鹽堿溶磷菌為鹽單胞菌屬，其溶無機磷量為247.6 mg/L；ZHU 等[18]分離到1 株中度嗜鹽細(xì)菌，該菌溶無機磷量為283.16 μg/mL，溶有機磷量僅為45.52 μg/mL。

目前關(guān)于耐鹽堿溶磷菌的報道大多是溶解無機磷能力強的菌株，而耐鹽堿溶解有機磷量高的菌株較少。鑒于此，從生長于鹽堿土的苜蓿根際土中分離、篩選具有溶磷功能的耐鹽堿菌株，選擇溶有機磷量較高的菌株，在缺磷條件下通過盆栽試驗驗證所選菌株的溶磷效應(yīng)及對大豆的促生效果，為在輕度鹽堿土壤上種植大豆、降低化肥使用量提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 土壤樣品采集

1.1.1.1 分離耐鹽堿溶磷菌的土壤采集 苜蓿根際、非根際鹽堿土樣品采集于黑龍江省大慶市高新區(qū)的鹽堿地（46°36′23″N，125°10′44″E）。選取長勢旺盛的苜蓿，將距其根系5～10 cm 的土壤作為非根際土；非根際土壤收集好后，挖取苜蓿，采用抖落法采集根際土壤。將根際土壤與非根際土壤樣品分別混合均勻，裝入無菌袋中冷藏帶回實驗室，取部分根際、非根際土樣用于Biolog-Eco板分析，另取部分根際土用于耐鹽堿溶磷菌的分離，剩余土壤風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)分析。根際和非根際土壤理化性質(zhì)如表1所示。

表1 苜蓿根際和非根際土壤理化性質(zhì)Tab.1 Physical and chemical properties of rhizosphere and bulk soil of alfalfa

1.1.1.2 盆栽試驗的土壤采集 種植土壤采集于黑龍江省大慶市龍鳳區(qū)植被生長較好的鹽堿地草原，選擇堿草生長較好的草地，采用五點取樣法挖取植被下20 cm 土壤，去除根系，混勻，帶回實驗室，土壤過篩備用，其理化性質(zhì)如表2 所示。將土壤與沙子等體積混合后有效磷含量為6.6 mg/kg，制成缺磷土壤用于大豆盆栽試驗。

表2 盆栽試驗土壤理化性質(zhì)Tab.2 Physical and chemical properties of soil in pot experiment

1.1.2 培養(yǎng)基 菌株篩選采用蒙金娜有機磷培養(yǎng)基[19]和PKO 無機磷培養(yǎng)基[20]；菌種保存采用LB 培養(yǎng)基[21]；其他促生功能的鑒定采用阿須貝無氮培養(yǎng)基[22]、解鉀培養(yǎng)基[23]、DF 培養(yǎng)基、ADF 培養(yǎng)基[24]、CAS鐵載體檢測培養(yǎng)基[25]、金氏培養(yǎng)基[26]。

1.1.3 供試大豆品種 供試大豆品種為綏農(nóng)28。

1.2 方法

1.2.1 根際與非根際土壤微生物對碳源的利用測定 分別稱取苜蓿根際、非根際土樣5 g 置于無菌三角瓶中，加入50 mL 無菌水，175 r/min 振蕩搖勻10 min。將裝有土壤稀釋液的三角瓶平緩地放進(jìn)超凈工作臺中，稀釋103倍后，按每個孔115 μL 加入Biolog-Eco 板中，30 ℃培養(yǎng)，每隔12 h 測定一次590 nm 和750 nm 處的吸光值，連續(xù)測定10 d（共計240 h）。

1.2.2 菌株的分離純化及其溶磷能力測定 稱取苜蓿根際土10 g 置于裝有50 mL 無菌水的三角瓶中，170 r/min 振蕩10 min，以此為原液，吸取上清液稀釋到10-3、10-4、10-5后分別涂布于蒙金娜有機磷培養(yǎng)基和PKO無機磷培養(yǎng)基上，于28 ℃倒置培養(yǎng)7 d，3 次重復(fù)。挑取帶有溶磷圈的單菌落劃線培養(yǎng)，傳代至少3次，直至獲得純菌種，用30%的甘油保存菌種，于-80 ℃冰柜中備用。

在有機磷培養(yǎng)基和無機磷培養(yǎng)基上接種20 μL菌懸液，28 ℃條件下培養(yǎng)7 d，觀察菌株有無透明圈出現(xiàn)，并對菌落直徑（d）和溶磷圈直徑（D）進(jìn)行測量，根據(jù)比值（D/d）對菌株溶磷能力大小進(jìn)行初步判斷[27]。將菌懸液濃度調(diào)節(jié)到107cfu/mL，按1%接種量接種到有機磷液體培養(yǎng)基和無機磷液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、170 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)7 d，分別采用鉬藍(lán)比色法[28]和鉬銻抗比色法[29]測定上清液中的有機磷含量和無機磷含量。

1.2.3 菌株其他促生功能鑒定 將分離得到的菌株制成菌懸液后，取20 μL 菌懸液分別接種于阿須貝固體培養(yǎng)基、解鉀固體培養(yǎng)基、ADF 固體培養(yǎng)基、CAS 鐵載體檢測固體培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)7 d，觀察菌株的生長情況，能夠在阿須貝固體培養(yǎng)基、ADF 固體培養(yǎng)基上生長即視為具有固氮功能、產(chǎn)ACC 脫氨酶的功能，根據(jù)菌落生長直徑的大小判斷其固氮、產(chǎn)ACC 脫氨酶功能的大小，并將具有產(chǎn)ACC脫氨酶功能的菌株按照趙龍飛等[30]的方法進(jìn)行定量測定；能在解鉀培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈的菌株即視為具有解鉀功能；能夠在菌落周圍產(chǎn)生橘黃色暈圈即視為具有產(chǎn)鐵載體的功能。

將分離得到的菌株制成菌懸液后，分別取50 μL 接種于5 mL 金氏培養(yǎng)基中，28 ℃避光培養(yǎng)3 d 后，取發(fā)酵液于1 000 r/min 離心5 min，吸取上清與PC 比色液（IAA 顯色液）各100 μL 滴在白瓷板上混勻，對照采用10 μg/mL IAA 溶液與PC 比色液混勻，避光反應(yīng)15 min 觀察顏色變化，顏色變成粉紅色表明菌株具有分泌IAA 的能力，溶液顏色深淺與IAA 分泌能力呈正比；不變色說明菌株不具有分泌IAA的能力。

1.2.4 菌株形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定和16S rRNA基因序列分析 將篩選得到的溶磷菌接種到蒙金娜有機磷固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，參照GEORGE 等[31]的方法對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；菌株的生理生化試驗參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[32]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[33]進(jìn)行，主要包括接觸酶試驗、唯一碳源試驗、唯一氮源試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、產(chǎn)氨試驗、淀粉水解試驗、硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、石蕊牛奶試驗、膿青素試驗。

用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒對菌株總DNA進(jìn)行提取，隨后使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ ）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對其16S rRNA 基因進(jìn)行擴增。PCR 反應(yīng)體系：DNA 2 μL，2×EsTaq Master Mix 25 μL，上、下 游 引 物（10 μmol/L）各1 μL，用ddH2O 補至50 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃1 min，55 ℃30 s，72 ℃2 min，35 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，將純化后PCR 產(chǎn)物送至吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行BLAST 分析后，利用MEGA-X 對序列進(jìn)行Clustal W 比對，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，Test of Pylogery 設(shè)置為Bootstrap method 檢驗倍數(shù)1 000，模型設(shè)置為Maximum Composite Likelihood，Gap/Missing Data Treatments設(shè)置為Pairwise deletion。

1.2.5 菌株溶磷基因鑒定 分別以各個菌株的基因組為模板，進(jìn)行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系：2×EsTaq Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2 min，35 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 擴增后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。引物來自文獻(xiàn)[34-35]，如表3所示。

表3 基因引物序列Tab.3 Gene primer sequences

1.2.6 菌株耐鹽堿試驗 耐堿試驗：首先將菌懸液接種在LB 液體培養(yǎng)基中搖種子液，使菌液的OD600達(dá)到0.65 后，按1%的接種量接種到不同pH 值（8、9、10、11）的LB 液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、170 r/min 振蕩培養(yǎng)，每隔24 h測定1次OD600值，測7 d。

耐鹽堿試驗：將菌懸液接種在LB 液體培養(yǎng)基中搖種子液，使菌液OD600達(dá)到0.65 后，根據(jù)耐堿試驗中OD600選定菌株生長較好的最高pH 值，按1%的接種量接種到不同NaCl 含量（1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%）的LB 液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、170 r/min 振蕩培養(yǎng)，每隔24 h 測定1 次OD600值，測7 d。

1.2.7 溶磷菌溶磷功能驗證 大豆盆栽試驗所用輕度鹽堿土壤采集于大慶市龍鳳區(qū)植被生長較好的鹽堿地草原。將取回的鹽堿土過篩，沙子用水清洗3 遍后烘干，將鹽堿土與沙子等體積混勻后裝入盆中，每盆沙土的質(zhì)量為7.2 kg。盆栽試驗于2021年8月在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)盆栽場進(jìn)行。

盆栽試驗共設(shè)置5個處理，包括2個對照和3個溶磷菌處理，3 次重復(fù)。對照1（CK1）澆灌缺磷營養(yǎng)液、對照2（CK2）澆灌全磷營養(yǎng)液、處理Z1為澆灌缺磷營養(yǎng)液并施入菌株Y7（缺磷營養(yǎng)液+Y7）、處理Z2為澆灌缺磷營養(yǎng)液并施入菌株Y31（缺磷營養(yǎng)液+Y31）、處理Z3 為澆灌缺磷營養(yǎng)液并施入菌株W5（缺磷營養(yǎng)液+W5）。每盆播種30 株大豆，出苗后，先施入1/4 霍格蘭營養(yǎng)液250 mL（缺磷營養(yǎng)液中用氯化鉀替代磷酸二氫鉀）和107cfu/mL 的菌液500 mL（菌株用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后收集菌體，用無菌水調(diào)節(jié)濃度），置于室外培養(yǎng)；出苗10 d 后再補澆1 次250 mL 營養(yǎng)液和500 mL 菌液。日常管理中處理與對照澆灌相同的水量，大豆生長40 d 后測定大豆生長指標(biāo)和葉片SPAD值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2019 和SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際與非根際土壤微生物對碳源的利用情況

選擇在鹽堿土壤中生長較好的苜蓿，取其根際土和非根際土作為試驗材料，采用Biolog-Eco 板分析根際與非根際土壤微生物群落對不同碳源底物的利用情況。Biolog-Eco 板中有31 種不同的碳源底物，光值平均變化率（AWCD）代表土壤細(xì)菌的代謝強度，通過酶標(biāo)儀對0～240 h AWCD 值進(jìn)行測定。結(jié)果（圖1）表明，根際土與非根際土的微生物群落對底物的利用率存在明顯差異。2 種土在0～24 h

圖1 土壤細(xì)菌平均吸光值變化曲線Fig.1 Variation curve of average absorbance value of soil bacteria

AWCD 值增加均較為緩慢，24～96 h 迅速增加，之后呈現(xiàn)緩慢增加。這表明微生物適應(yīng)環(huán)境后對不同碳源底物的利用能力越來越強，最后趨于穩(wěn)定狀態(tài)。從代謝整體趨勢看，根際土的AWCD 值明顯高于非根際土，說明根際土的微生物群落比非根際土更加豐富且兩者之間的代謝功能也存在明顯差異。由于根際土微生物群落豐富，代謝功能強，更容易篩選出耐鹽堿溶磷菌，因此選用根際土來分離溶磷菌株。

2.2 耐鹽堿溶磷菌的篩選及其溶磷量

以在鹽堿土上生長良好的苜蓿的根際土為材料，在蒙金娜有機磷培養(yǎng)基和PKO 無機磷培養(yǎng)基上篩選溶磷菌株，通過平板篩選，挑取有溶磷圈的菌株，最終獲得98個不同形態(tài)且具有溶磷功能的細(xì)菌菌株，其中溶有機磷菌株54 個，編號為Y01—Y54；溶無機磷菌株44個，編號為W01—W44。

通過平板反復(fù)篩選，確定菌株具有溶磷功能后，對菌株進(jìn)行溶磷能力的定量測定，挑選出3個溶磷能力較高的菌株（Y7、Y31、W5）作為后續(xù)試驗用菌株，3個菌株的溶磷量見表4。

表4 篩選菌株的溶磷量Tab.4 The capacity of phosphorus solubilized by the screened strains mg/L

2.3 耐鹽堿溶磷菌的促生功能

對篩選得到的3個溶磷菌株進(jìn)行固氮、解鉀、鐵載體功能定性檢測和產(chǎn)IAA、產(chǎn)ACC 脫氨酶的定量檢測，結(jié)果如表5 所示。Y7 菌株具有固氮和產(chǎn)ACC脫氨酶的功能，Y31 菌株具有固氮、解鉀、產(chǎn)IAA 的功能，W5菌株具有固氮、產(chǎn)IAA和鐵載體的功能。

表5 3個溶磷菌株的促生功能Tab.5 Growth-promoting functions of the three phosphorus-soluble strains

2.4 耐鹽堿溶磷菌的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將這3個溶磷菌株接種到蒙金娜有機磷固體培養(yǎng)基上進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，如表6 所示，Y7、Y31 菌落均為乳白色，W5 菌落為淡黃色，3個菌株的菌落均為圓形，邊緣光滑，表面濕潤，有凸起，生長速度較快。

表6 3個溶磷菌株菌落的表型特征Tab.6 Colony morphologies of the three phosphorus-soluble strains

2.4.2 生理生化鑒定 對這3個溶磷菌株進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果見表7。3 個溶磷菌株在唯一碳源（葡萄糖、蔗糖）、唯一氮源（硝酸鉀、硫酸銨）條件下均能生長；產(chǎn)氨試驗均為陽性；除W5 外，Y7、Y31 接觸酶試驗、吲哚試驗均為陽性，V-P 試驗均為陰性；3 個溶磷菌株膿青素試驗均為陰性；除Y31 外，W5、Y7 淀粉水解試驗、硝酸鹽還原試驗均呈陽性，甲基紅試驗均為陰性；石蕊牛奶試驗顯示Y7 產(chǎn)堿，W5、Y31均產(chǎn)酸。

表7 3個溶磷菌株的生理生化特性Tab.7 Physiological and biochemical characteristics of the three phosphorus-soluble strains

2.4.3 分子生物學(xué)鑒定 將這3個溶磷菌株測序得到的16S rRNA 基因序列在NCBI 上進(jìn)行BLAST 分析，利用鄰接法通過MEGA-X 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2。綜合菌株的形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定和菌株與模式菌株的相似性（表8）判斷菌株最終的種屬分類情況，Y7 為假單胞菌（Pseudomonassp.），同源性為99.79%；Y31 為不動桿菌（Acinetobacter soli），同源性為100%；W5 為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis），同源性為100%。

表8 3個溶磷菌株16S rRNA 基因相似性比對結(jié)果Tab.8 Results of 16S rRNA gene similarity comparison of the three phosphorus-soluble strains

圖2 3個溶磷菌株基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the three strains based on 16S rRNA gene sequences

2.5 耐鹽堿溶磷菌的溶磷基因

根據(jù)文獻(xiàn)[34-35]設(shè)計了堿性磷酸酶和植酸酶基因的PCR 引物，提取Y7、W5、Y31 三個菌株的DNA 進(jìn)行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電 泳，結(jié)果如圖3 所示。Y7 和W5 在約1 500 bp 處有條帶，證明有phoD基因；而Y31 在約1 300 bp 處有條帶，證明Y31有appA基因。

圖3 3個溶磷菌株phoD基因與appA基因PCR擴增結(jié)果Fig.3 Results of PCR amplification of phoD gene and appA gene of the three phosphorus-soluble strains

2.6 耐鹽堿溶磷菌的耐鹽堿能力

將3 個溶磷菌株分別接種到不同pH 值的LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，每隔24 h 進(jìn)行1 次OD600值的測定，測定7 d；選擇菌株最適pH值（pH值=9），將菌株接種到不同含鹽量的LB 培養(yǎng)基中，同樣每24 h測定1次OD600值，測定7 d。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，前3 d菌株的吸光值均呈現(xiàn)上升趨勢，第4 天或第5 天后，吸光值趨于穩(wěn)定，選取最高OD600值作為菌株耐鹽堿性指標(biāo)，結(jié)果如表9 所示。3 個菌株均能在pH 值為8、9、10 的LB 培養(yǎng)基中生長，pH 值為11 時不能生長；Y7、Y31 在pH 值為8 和9 時生長旺盛而W5 在pH 值為9 時生長最旺盛。3 個菌株均能在1%、3%、5%、7%、9% NaCl 中生長，W5 在NaCl 含量為11%、13%時均能夠生長，而另外2個菌株不能生長。

表9 3個溶磷菌株的耐鹽堿測定結(jié)果Tab.9 Results of saline-alkali tolerance of the three phosphorus-soluble strains

2.7 耐鹽堿溶磷菌在大豆生長中的溶磷功能驗證

將輕度鹽堿土與沙子等體積混合后，制成缺磷土壤（有效磷含量6.6 mg/kg）用于大豆盆栽試驗。通過接種不同菌株和澆灌缺磷營養(yǎng)液對盆栽土進(jìn)行處理，40 d 后測定大豆植株的生長指標(biāo)，結(jié)果如表10 所示。盆栽試驗結(jié)果顯示，與2 個對照相比，澆灌Y7、Y31、W5 菌液的大豆幼苗葉綠素含量、株高、根長、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量均呈現(xiàn)不同程度的增加。與CK1相比，Z1、Z2、Z3處理葉綠素含量分別增加了23.03%、25.85%、24.24%，株高分別增加了48.64%、53.60%、42.01%，根長分別增加了83.93%、68.51%、46.92%，葉鮮質(zhì)量分別增加了73.42%、72.15%、74.68%，葉干質(zhì)量均增加了62.50%，根鮮質(zhì)量增加最為明顯，分別增加了233.33%、209.52%、147.62%，根干質(zhì)量分別增加了250.00%、250.00%、200.00%；與CK2 相比，Z1、Z2、Z3 處理葉綠素含量分別增加了6.39%、8.83%、7.44%，株高分別增加了32.46%、36.88%、26.56%，根長分別增加了27.02%、16.37%、1.46%，葉鮮質(zhì)量分別增加了30.48%、29.52%、31.43%，葉干質(zhì)量均增加了18.18%，根鮮質(zhì)量分別增加了125.81%、109.68%、67.74%，根干質(zhì)量分別增加了250.00%、250.00%、200.00%。根據(jù)差異顯著性分析，Z1 處理對大豆根部的促生效果最為明顯，大豆根系更為發(fā)達(dá)；Z2 處理對大豆地上部分的促生效果較為明顯。3個溶磷菌株對缺磷介質(zhì)培養(yǎng)的大豆均表現(xiàn)出促生作用，說明3個菌株均有很好的溶磷作用。

表10 耐鹽堿溶磷菌對大豆生長的影響Tab.10 Effect of salt-alkali-tolerant phosphorus-solubilizing bacteria on the growth of soybean

3 結(jié)論與討論

磷是植物生長發(fā)育過程中必需的礦質(zhì)元素之一，缺磷作物將不能正常生長。鹽堿土中有效磷含量比較低，作物生長受到限制。溶磷菌是一種有益的植物促生菌，它可以通過酶解、酸化、螯合和離子交換反應(yīng)等溶解土壤中的不溶性磷酸鹽[36-37]，供植物生長。通過人工接種溶磷菌可以提高土壤中有效磷含量，促進(jìn)植物生長。耐鹽堿植物根部往往存在著耐鹽堿促生菌，研究表明，與非根際土相比，根際土壤微生物多樣性存在較大差異[38]，本研究利用Biolog-Eco 板分析鹽堿土中生長良好的苜蓿根際與非根際土壤微生物對碳源的利用情況，發(fā)現(xiàn)根際土壤微生物對不同碳源的利用率更高，說明根際土壤微生物種類更豐富，代謝能力更強，分離出溶磷效果好的菌株的可能性更大。本研究從生長于鹽堿土壤的苜蓿根際土中分離得到98個溶磷菌株，通過對菌株的溶磷能力測定，最終篩選出Y7、W5 和Y31 3個高效耐鹽堿溶磷菌株，3個溶磷菌株均能溶有機磷和無機磷，其溶有機磷能力更強，通過鑒定，這3個菌株分別為假單胞菌（Pseudomonassp.）、不動桿菌（Acinetobacter soli）、暹 羅 芽 孢 桿 菌（Bacillus siamensis）。

目前，關(guān)于溶磷菌的報道多是芽孢桿菌屬和假單胞菌屬[39-40]，且大多數(shù)研究篩選的溶磷菌是溶無機磷量高的菌株，關(guān)于溶有機磷量高并具有耐鹽堿能力的菌株報道較少。如SULEMAN 等[41]從小麥根際土中分離出2 個溶無機磷高的菌株，其中假單胞菌屬菌株的溶磷量為280 μg/mL，腸桿菌屬菌株的溶磷量為136 μg/mL。本研究分離得到的3 個菌株溶有機磷能力強，其中假單胞菌（Pseudomonassp.）溶磷量為456.35 mg/L；不動桿菌（Acinetobacter soli）溶磷量為400.44 mg/L；暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）溶磷量為128.63 mg/L。多數(shù)植物和微生物在高鹽強堿且養(yǎng)分含量低的鹽堿土壤中生存困難，這3 個菌株均可以在pH 值為9、NaCl 含量9%時生長，說明所分離得到的菌株溶有機磷能力強且具有耐鹽堿性。

WU 等[42]從油茶根際土中分離得到芽孢桿菌屬和假單胞菌屬菌株，將其回接至油茶中，發(fā)現(xiàn)土壤營養(yǎng)元素含量均有提高，植物的光合能力、生物量也有提升，促進(jìn)了植物生長。本研究盆栽結(jié)果顯示，澆灌耐鹽堿溶磷菌菌懸液的大豆可以在鹽堿脅迫和缺磷環(huán)境下正常生長，說明在大豆生長過程中，溶磷菌具有很好的溶磷效果，可以保證大豆正常生長發(fā)育所需的磷素并且能夠緩解鹽堿脅迫對大豆生長的抑制作用；同時，與未接菌澆灌全磷營養(yǎng)液相比，其葉綠素含量和生物量均顯著增加，說明耐鹽堿溶磷菌還具有較好的促生作用。磷酸酶和植酸酶是微生物溶磷酶解機制的主要合成酶[43]，本研究對菌株是否具有堿性磷酸酶基因（phoD）和植酸酶基因（appA）進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Y7 和W5具有堿性磷酸酶phoD基因，Y31具有植酸酶appA基因，說明Y7 和W5 菌株通過堿性磷酸酶溶解有機磷，Y31通過植酸酶溶解有機磷。

本研究從生長于鹽堿土的苜蓿根際土中篩選得到3 個耐鹽堿高效溶磷菌株，其溶解有機磷量較高，在鹽堿土與沙子混合的缺磷土壤中對大豆表現(xiàn)出很好的溶磷促生效果，證明這3 個菌株能夠適應(yīng)鹽堿環(huán)境，在鹽堿條件下能發(fā)揮溶磷作用，緩解鹽堿脅迫和缺磷對大豆生長的危害。