MEBT／MEBO聯合八珍湯加減對Ⅲ～Ⅳ期壓瘡創(chuàng)面組織中CK19表達水平的影響

馮曉琪 侯玉潔 王玉玲 劉 寧 向麗萍

壓瘡是指由于壓力或壓力結合剪切力導致的局部上皮、真皮和皮下組織損傷［1］，感染風險較高、愈合時間較長，給患者造成了較大的身心痛苦及經濟負擔，嚴重影響了患者的生活質量。目前，臨床常用的西醫(yī)壓瘡治療方法中常規(guī)清創(chuàng)換藥的治療效果緩慢，敷料外敷、干細胞療法及負壓封閉引流的治療效果雖有所提高，但費用高昂，且適用范圍較小。而中醫(yī)以內治補益氣血、扶正托毒為法，外治拔毒生肌為要，辨證施治、內外結合，在促進壓瘡愈合中發(fā)揮了重要作用，逐漸被臨床所重視。如創(chuàng)瘍再生醫(yī)療技術 （moist exposed burn therapy／moist exposed burn ointment， MEBT／MEBO） 作為中醫(yī)外治療法之一被諸多研究證實可促進表皮干細胞的增殖，加快創(chuàng)面愈合［2－3］；八珍湯加減作為中醫(yī)內治療法之一被多項研究證實在Ⅲ～Ⅳ期壓瘡的治療中具有較好的臨床療效。本研究主要探析 MEBT／MEBO與八珍湯加減聯合治療Ⅲ～Ⅳ期壓瘡的臨床效果及其對創(chuàng)面組織中細胞角蛋白19（cytokeratin?19，CK19）表達水平的影響，現報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取2021年3月至2022年1月湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院收治的45例Ⅲ～Ⅳ期壓瘡患者作為研究對象，采用隨機數表法將其隨機分為治療組23例和對照組22例。兩組患者性別、年齡、創(chuàng)面面積等一般資料對比，P均＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性 （表1）。本研究經湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準 （批號2021?KY?017），且所有患者或家屬均簽署了知情同意書。

表1 兩組Ⅲ～Ⅳ期壓瘡患者一般資料對比Table 1 Comparison of general data of patients with stageⅢ－Ⅳ pressure ulcer between the two groups

1.2 納入與排除標準

納入標準：符合美國國家壓瘡顧問小組壓瘡指南中壓瘡的診斷標準［4］，且分期為Ⅲ～Ⅳ期；符合《中醫(yī)外科學》［5］中氣血虧虛證型的診斷標準；年齡在18歲以上；對本研究知情同意；生命體征平穩(wěn)；壓瘡病程小于1年。排除標準：創(chuàng)面存在竇道，無法準確測量創(chuàng)面面積；合并有嚴重營養(yǎng)不良、重度貧血、臟器功能衰竭、凝血功能障礙；長期接受放化療或免疫抑制劑、激素治療；創(chuàng)面存在嚴重感染或已出現全身感染癥狀；對本研究所用藥物成分過敏或為過敏體質；患有精神疾病，依從性差，無法配合完成全程治療；妊娠期或哺乳期女性。

1.3 主要儀器與藥品

濕潤燒傷膏 （moist exposed burn ointment，MEBO）：汕頭市美寶制藥有限公司生產，國藥準字Z20000004；中藥八珍湯加減：黃芪30 g、薏苡仁30 g、茯苓20 g、黨參15 g、當歸10 g、白術10 g、白芍10 g、川芎10 g、金銀花10 g、白芷10 g、甘草6 g加入1500 ml純凈水煎40 min得150 ml藥液濾出，再次加入1200 ml純凈水煎30 min得150 ml藥液濾出，兩次藥液混合，每袋150 ml包裝，4℃冰箱冷藏備用，湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院煎藥室自動煎藥機煎制；羊抗兔?辣根過氧化物酶標記二抗：北京博奧森生物技術有限公司生產， 貨號 bs?0295G?HRP； 羊抗兔?CK19： 英國abcam生產，貨號ab52625；羊抗兔?甘油醛?3?磷酸脫氫酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase， GAPDH）、電泳儀、電轉儀：安諾倫 （北京）生物科技有限公司生產， 貨號 10494?1?AP、 1645070、 BE6085；2， 2?聯喹啉?4， 4?二甲酸二鈉 （bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司生產，貨號PC0020；放射免疫沉淀法 （radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、Tris?甘氨酸電泳緩沖液、超敏電化學發(fā)光 （electro?chemi?luminescence， ECL）發(fā)光液：上海碧云天生物技術有限公司生產，貨號P0013B、 P1045、 P0015L、 P0018S?2； 四甲基乙二胺：美國Amresco生產，貨號Amresc00761；三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司生產，貨號 30188216、62011519、30166428；膜再生液：北京普利萊基因技術有限公司生產，貨號P1650；聚偏氟乙烯膜：美國Millipore生產，貨號IPVH00010；酶標儀：美國Biotek生產，貨號800TS；Tanon 5200型全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)：上海天能科技有限公司生產。

2 方法

2.1 治療方法

所有患者根據具體病情予以調節(jié)血壓、血糖，改善微循環(huán)等基礎治療，以及使用氣墊床，定時翻身等護理。

對照組：局部創(chuàng)面及創(chuàng)周5.0 cm范圍內于絡合碘消毒、無菌干紗布拭凈創(chuàng)面分泌物后，以不破壞正常組織、無明顯疼痛及出血為準，用鑷子和刀片逐步清除創(chuàng)面壞死組織，并再次用無菌紗布拭凈創(chuàng)面后，均勻涂抹濕潤燒傷膏 （厚約0.2 cm），依次覆蓋濕潤燒傷膏藥紗及無菌敷料包扎，每天換藥2次，連續(xù)治療4周。

治療組：在濕潤燒傷膏換藥治療的基礎上加服八珍湯加減治療，每次150 ml溫服，每天2次，連續(xù)治療4周。

2.2 Western blotting法檢測創(chuàng)面組織中CK19表達水平

分別于治療前及治療后第1、2、3、4周，創(chuàng)面常規(guī)消毒清創(chuàng)后，切取8.0 mm×2.0 mm×1.0 mm創(chuàng)緣組織，迅速置于－80℃液氮中保存；標本收集完畢后，取適量組織，裂解、離心后取上清液，嚴格按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液和磷酸鹽緩沖液調整蛋白濃度，保證不同組別間濃度一致，95℃煮5 min上樣。制作電泳膠，每孔加入10 μl上樣，80 V濃縮膠、120 V分離膠，恒壓電泳至目的蛋白處于分離膠面下1／3時停止；PVDF轉膜、搖床、封閉，4℃一抗孵育過夜，TBST充分洗膜3次；封閉液10000∶1稀釋辣根過氧化物酶標記二抗，二抗孵育1 h，TBST洗膜3次；1∶1比例混勻ECL發(fā)光液與過氧化物酶溶液，滴于PVDF膜上，用全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)曝光，TBST洗膜3次；加入膜再生液，室溫搖床30 min洗脫，再次封閉、內參孵育 （GAPDH?1∶5000）；最后，使用Image J圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。

2.3 觀察指標及評價標準

（1）使用壓瘡愈合計分量表 （pressure ulcer scale for healing， PUSH）［6］評估壓瘡創(chuàng)面愈合情況，主要包括壓瘡面積、24 h滲液量、創(chuàng)面組織類型3個維度，總分為17分，分值越低表示愈合情況越好。

（2）治療4周后，評估兩組患者臨床療效：創(chuàng)面愈合為痊愈；創(chuàng)面面積明顯縮小，PUSH評分降低，滲液量減少或滲液消失，肉芽組織生長良好為有效；創(chuàng)面無明顯變化或擴大為無效；總有效率＝（痊愈例數 ＋有效例數） ／總例數 ×100%［7－8］。

2.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對所得數據進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數 （下四分位數，上四分位數） 即 Q2（Q1，Q3） 表示， 采用 Mann?Whitney檢驗；計數資料以頻數或百分比表示，采用卡方檢驗或等級資料的秩和檢驗；均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 創(chuàng)面組織中CK19表達水平對比

治療后，兩組患者創(chuàng)面組織中CK19表達水平均呈先降低后升高又降低的趨勢，且治療2、3、4周時治療組患者創(chuàng)面組織中CK19表達水平均明顯高于對照組 （P均＜0.05），詳見表2、圖1。

圖1 創(chuàng)面組織中CK19表達水平條帶圖Fig.1 Histogram of CK19 expression levels in wound tissues

表2 兩組Ⅲ～Ⅳ期壓瘡患者創(chuàng)面組織中CK19表達水平對比 ［Q2（Q1，Q3）］Table 2 Comparison of expression levels of CK19 in wound tissues of patients with stageⅢ－Ⅳ pressure ulcer ［Q2 （Q1， Q3）］

3.2 創(chuàng)面PUSH評分對比

治療前，治療組患者創(chuàng)面PUSH評分為（13.04±2.14）分，對照組患者創(chuàng)面PUSH評分為（13.86±1.78）分，兩組間無明顯差異 （t＝－1.393，P＝0.171），具有可比性；治療4周后，治療組患者創(chuàng)面PUSH評分為 （9.21±2.15）分，明顯低于對照組患者的創(chuàng)面PUSH評分 （11.77±1.85）分（t＝ －4.262，P＜0.001）。

3.3 臨床療效對比

治療4周后，治療組患者中有效22例、無效1例，總有效率為95.65%，明顯優(yōu)于對照組患者的有效12例、無效10例，總有效率54.55% （Z＝－3.172，P＝0.002）。

4 討論

隨著我國人口老齡化的不斷加劇，壓瘡的發(fā)病率也隨之升高。有研究數據顯示，我國壓瘡患病率為1.577%，已成為危害人類健康及社會發(fā)展的重要影響因素。中醫(yī)學中，壓瘡又稱 “席瘡” “褥瘡”，認為氣血虧虛、運行不暢致局部經絡阻滯、肌膚失養(yǎng)而破潰是其主要病機，感染毒邪而正虛無力驅邪外出可致久病難愈，補益氣血、扶正托毒（“補托”）為內治之則，化腐生肌為外治之法?！把a托法”體現了中醫(yī)扶正祛邪之整體觀念，在清解毒邪時，重視扶助正氣以祛邪外出，謹防毒邪內陷，病情遷延。同時，運用補益藥還有助于后期腐肉盡去后斂瘡生肌。本研究筆者鑒于八珍湯作為治療氣血兩虧諸證之經典方，具有補氣養(yǎng)血、扶正托毒之效，且現代醫(yī)學研究發(fā)現其有改善血液流變性、抗氧化和抗衰老、增強免疫力等效果，在貧血、創(chuàng)傷、腫瘤、疲勞等慢性損耗性疾病的治療中取得了較為滿意的臨床療效［9］，將其與 MEBT／MEBO聯合應用于壓瘡患者的治療。

MEBT／MEBO作為中醫(yī)外治法化腐生肌的典型代表，最初應用于燒傷的救治，后被廣泛應用于各種急慢性創(chuàng)面的治療，可促進表皮干細胞的增殖、血管的新生、炎癥的消退［3］，且其內含有的黃連、黃芩、黃柏除可清熱解毒燥濕外，還具有較強的抑制金黃色葡萄球菌的作用［10］；地龍除可活血化瘀外，還可促進創(chuàng)面巨噬細胞聚集［11］。八珍湯加減以八珍湯為基礎，加入黃芪增強補氣、金銀花清熱解毒、薏苡仁清熱利濕、白芷斂瘡生??；人參更換為黨參，和緩其作用，如 《本草綱目拾遺》記載黨參不如人參有 “甘溫竣補之功”卻有 “甘平清肺之力”，更適體質虛弱的患者，以避免虛不受補。且現代藥理學認為，金銀花對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等致病菌有明顯抑制作用［12］；白芷、薏苡仁亦具有廣譜抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛作用［13－14］；黨參與人參作用相似，可互相替代［15］。本研究結果顯示，治療2、3、4周時采用MEBT／MEBO聯合八珍湯加減治療的治療組患者創(chuàng)面組織中CK19表達水平均明顯高于單純采用MEBT／MEBO治療的對照組，治療4周后治療組患者創(chuàng)面PUSH評分明顯低于對照組、臨床療效明顯優(yōu)于對照組。

CK19是表皮干細胞分化為單層上皮細胞后特異性表達的一種結構蛋白［16］，可用于檢測創(chuàng)面組織中表皮干細胞的增殖和分化能力，評估創(chuàng)面愈合情況。表皮干細胞主要存在于表皮基底層和汗腺、毛囊周圍，可分化為皮膚基底層細胞和毛囊、腺體細胞以及表皮細胞。本研究說明，與單純應用MEBT／MEBO相比，MEBT／MEBO聯合八珍湯加減更有利于表皮干細胞的增殖分化，且考慮與八珍湯可促進表皮生長因子的釋放［17］有關。另外，八珍湯溫補作用緩和不竣烈，臨床中治療氣血不足等虧損性證候多需2周以上時間［18］，故初期作用不明顯，2周后兩組間才出現明顯差異。此外，兩組組內不同時間點CK19表達水平變化趨勢大致相同，說明八珍湯并未改變CK19的基本變化趨勢。而既往相關動物實驗中CK19變化趨勢與本研究結果有一定差異，如單云龍［19］研究結果顯示的慢性難愈合創(chuàng)面大鼠經 MEBT／MEBO治療后創(chuàng)面組織中CK19表達水平為先降低后升高趨勢，唐乾利等［20］研究結果顯示的慢性難愈合創(chuàng)面大鼠經MEBT／MEBO治療后創(chuàng)面組織中CK19表達水平為先升高后降低趨勢。分析其原因可能與研究對象不同以及壓瘡病程、基礎情況個體差異較大有關。另外，患者入院后需視情況進行清創(chuàng)，難以避免造成的微小新創(chuàng)傷可對CK19總體變化趨勢產生影響。

綜上所述，MEBT／MEBO聯合八珍湯加減可促進Ⅲ～Ⅳ期壓瘡創(chuàng)面愈合，其機制可能與兩者聯合應用促進表皮干細胞分化及CK19表達的作用更強有關。因現實條件限制，本研究樣本量有限，兩組患者個體差異難以精確控制，仍需進一步增加樣本量、擴大研究方向深入研究驗證。