MEBT／MEBO 對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面 NF?κB p65、 IκBα、IKK及其磷酸化蛋白表達(dá)水平的影響

田馨如 賀佐分 岑麗君 郭文聞 童丹蕾 黃金梅 葛星月 楊雅量 李文武 唐乾利

慢性難愈合創(chuàng)面是指由各種原因?qū)е碌慕?jīng)長(zhǎng)時(shí)間治療后仍未愈合也無明顯愈合傾向的創(chuàng)面。創(chuàng)瘍?cè)偕t(yī)療技術(shù)由燒傷濕潤(rùn)暴露療法 （moist exposed burn therapy，MEBT）與濕潤(rùn)燒傷膏 （moist exposed burn ointment，MEBO）發(fā)展而來，經(jīng)臨床證實(shí)對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面具有較好的治療效果［1－4］，且既往研究表明多種炎癥因子參與創(chuàng)面愈合過程中炎癥反應(yīng)的發(fā)生及發(fā)展，而MEBO可通過下調(diào)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)因子的表達(dá)而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合［5－6］。為進(jìn)一步證實(shí)MEBT／MEBO促進(jìn)創(chuàng)面愈合的分子生物學(xué)作用機(jī)制，本研究筆者鑒于核因子κB （nuclear factor?κB，NF?κB） p65、 NF?κB 抑制蛋白 （inhibitor?κ binding probein， IκB）、 IκB 激酶 （IκB kinase， IKK） 是經(jīng)典炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 IKK／IκB／NF?κB 的關(guān)鍵因子［7］，探討了 MEBT／MEBO對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面組織中 NF?κB p65、 IKK、 IκBα 蛋白 以 及磷酸化（phosphorylation， p） 蛋白 p?NF?κB p65、 p?IKK、p?IκBα 表達(dá)水平的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2月齡健康SPF級(jí)雄性Wistar大鼠90只，體質(zhì)量220～250 g，均購自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK （湘）2014?0011。本研究經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與設(shè)備

濕潤(rùn)燒傷膏：汕頭市美寶制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)2101603A；重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子凝膠：珠海億勝生物制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)04200309；水合氯醛：成都市科隆化學(xué)品有限公司生產(chǎn)，批號(hào)2021021501；醋酸氫化可的松：山西兆益生物有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20110102；呋喃西林：上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)，CAS號(hào)59?87?0；Masson三色染色試劑盒、RIPA組織細(xì)胞裂解液：北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)G1340、R0020；化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)， 貨號(hào) sc?2048、 ZB2301、 ZB2305；聚偏二氟乙烯 （polyvinylidene fluoride，PVDF）膜：美國(guó) Millipore公司生產(chǎn)，貨號(hào) IPVH00010；p?IκBα、 p?NF?κB p65、 p?IKK aβ、 NF?κB p65、IκBα、 IKK aβ 一抗： 澳大利亞 Affinity Biosciences公司生產(chǎn)，貨號(hào)Af2002、Af2006、Af3013、AF5006、AF5002、 AF6014。

低溫高速離心機(jī)、移液器：德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)，離心機(jī)型號(hào)centrifuge5417R，移液器規(guī)格10、 20、 200、 1000 μl； 超低溫冰箱： 日本 Sanyo公司生產(chǎn)，型號(hào)MDF?U72V；電泳儀：北京六一生物科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)DYCZ?24DN；半干轉(zhuǎn)膜儀：日本ATTO公司生產(chǎn)，型號(hào)WSE?4040；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀：上海天能科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)Tanon1600。

2 方法

2.1 模型制備與分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)表法將其隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組、模型組、MEBO組和貝復(fù)新組，每組18只。所有大鼠均于腹腔注射10%水合氯醛3 ml／kg麻醉后，電動(dòng)剃刀剃去背部毛發(fā)，充分暴露背部皮膚，并用直徑30 mm圖章標(biāo)記造模面積；對(duì)照組、模型組、MEBO組和貝復(fù)新組在無菌條件下參照趙京禹等［8］的全層皮膚缺損法和沈氏改良塑料環(huán)肉芽腫定量法沿脊椎兩側(cè)做2個(gè)直徑30 mm深達(dá)筋膜的開放性全層皮膚缺損創(chuàng)面，建立急性全層皮膚缺損創(chuàng)面模型；繼而模型組、MEBO組和貝復(fù)新組即刻注射醋酸氫化可的松（8 mg／100 g），建立慢性難愈合創(chuàng)面模型。

2.2 創(chuàng)面處理

空白組大鼠備皮處皮膚、對(duì)照組大鼠急性創(chuàng)面、模型組大鼠慢性難愈合創(chuàng)面均于1／5000呋喃西林溶液清潔后，依次覆蓋2層生理鹽水紗布、2層無菌干紗布，膠布 “豐”形固定；MEBO組大鼠創(chuàng)面于1／5000呋喃西林溶液清潔后，依次覆蓋2層MEBO藥紗 （0.2 g／cm2）、2層無菌干紗布，膠布 “豐”形固定；貝復(fù)新組大鼠創(chuàng)面于1／5000呋喃西林溶液清潔后，依次覆蓋2層重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子藥紗 （60 U／cm2）、2層無菌干紗布，膠布 “豐”形固定，每天換藥2次。

2.3 觀察指標(biāo)

（1）分別于干預(yù)第3、7、14天，每組隨機(jī)選取6只大鼠，在固定焦距下對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行拍照，并使用Image J軟件測(cè)量創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率＝ （初始創(chuàng)面面積－時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面面積） ／初始創(chuàng)面面積×100%。

（2）分別于干預(yù)第3、7、14天，每組隨機(jī)選取6只大鼠處死，從深筋膜下層切取距離創(chuàng)緣0.5 cm處的創(chuàng)面及創(chuàng)周組織，無張力平展于濾紙上，平分后一半用濾紙包裹置于包埋盒，并放入10%中性緩沖福爾馬林溶液中浸泡24 h后，再次浸泡于70%酒精中置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫灰话胫糜趦龃婀苤?，放入液氮罐?0℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）取4℃冰箱保存?zhèn)溆媒M織，分別進(jìn)行Masson染色及HE染色后觀察組織病理學(xué)變化情況。

（4）?。?0℃液氮保存?zhèn)溆媒M織，采用免疫印跡法檢測(cè) NF?κB p65、 IKK、 IκBα、 p?NF?κB p65、p?IKK、 p?IκBα 蛋白表達(dá)水平。 用勻漿器將冷凍組織磨碎后，于低溫環(huán)境中加入組織裂解液，提取總蛋白，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總蛋白濃度，繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；取蛋白上樣與聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液混勻后100℃下加熱5 min進(jìn)行蛋白變性，后置于－20℃冰箱中保存；在聚丙烯酰胺凝膠中加入等體積蛋白上樣，100 V恒壓電泳、250 mA恒流轉(zhuǎn)膜、封閉后，置于4℃環(huán)境下孵育一抗過夜；一抗孵育后，磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered solution，PBST） 洗膜3次，然后加入二抗，室溫下孵育60 min；二抗孵育后，PBST洗膜3次，并曝光顯影；最后，使用Image J圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q檢驗(yàn)；均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率對(duì)比

干預(yù)第3、7天，各組大鼠創(chuàng)面愈合率均無明顯差異 （P均＞0.05）；干預(yù)第14天，模型組大鼠創(chuàng)面愈合率明顯低于對(duì)照組、MEBO組 （P均＜0.05），其余各組間創(chuàng)面愈合率均無明顯差異 （P均＞0.05）， 詳見表1、 圖1。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面愈合情況對(duì)比圖Fig.1 Comparison of wound healing condition of rats in each group at different time points

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面愈合率對(duì)比 （%，±s）Table 1 Comparison of wound healing rate of rats in each group at different time points（%， ±s）

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面愈合率對(duì)比 （%，±s）Table 1 Comparison of wound healing rate of rats in each group at different time points（%， ±s）

注：MEBO為濕潤(rùn)燒傷膏；對(duì)照組與模型組大鼠創(chuàng)面采用生理鹽水紗布換藥處理，MEBO組大鼠創(chuàng)面采用MEBO換藥處理，貝復(fù)新組大鼠創(chuàng)面采用重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子凝膠換藥處理。各組大鼠創(chuàng)面愈合率組間兩兩對(duì)比，與對(duì)照組對(duì)比，aP＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組對(duì)比，bP＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Note： MEBO －moist exposed burn ointment； The wounds of rats in control group and model group were treated with dressing change with normal saline gauze， while the rat wounds in MEBO group and rb?bFGF group were respectively treated with dressing change with MEBO gauze and recombinant bovine basic fibroblast growth factor（rb?bFGF） gel.The wound healing rate in each group were compared in pairs， and the differences were statistically significant as compared with the control group（aP＜0.05），and with the model group（bP＜0.05）

組別Group只數(shù)Number of rats第3天Day 3第7天Day 7第14天Day 14對(duì)照組Control group 6 0.31±0.03 0.79±0.02 0.97±0.02模型組Model group 6 0.22±0.05 0.74±0.05 0.86±0.07a MEBO組MEBO group 6 0.26±0.10 0.77±0.04 0.95±0.02b貝復(fù)新組rb?bFGF group 6 0.24±0.04 0.74±0.02 0.92±0.02 F值F value 2.387 2.939 9.049 P值P value 0.099 0.058 0.001

3.2 各組大鼠皮膚／創(chuàng)面組織病理學(xué)觀察

Masson染色病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，干預(yù)第3天，模型組、MEBO組、貝復(fù)新組大鼠創(chuàng)面組織中均可見少量膠原纖維；干預(yù)第7、14天，模型組、MEBO組、貝復(fù)新組大鼠創(chuàng)面組織中膠原纖維量均明顯增加，且MEBO組、貝復(fù)新組膠原纖維量明顯多于模型組，詳見圖2。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠皮膚／創(chuàng)面組織Masson染色圖 （×100）Fig.2 Masson staining of rat skin／wound tissues in each group at different time points （ ×100）

HE染色病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，干預(yù)第3天，對(duì)照組、模型組、MEBO組和貝復(fù)新組大鼠創(chuàng)面組織中均可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；干預(yù)第7天，對(duì)照組、MEBO組、貝復(fù)新組大鼠創(chuàng)面組織中炎癥細(xì)胞均明顯減少，且可見大量成纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管及少量毛囊結(jié)構(gòu)，而模型組大鼠創(chuàng)面組織中仍存在大量炎癥細(xì)胞，且成纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管較少；干預(yù)第14天，對(duì)照組、MEBO組、貝復(fù)新組大鼠創(chuàng)面組織中均可見整齊排列的毛細(xì)血管及成熟的毛囊、皮脂腺等，而模型組大鼠創(chuàng)面組織中仍可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但已有大量成纖維細(xì)胞生成，詳見圖3。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠皮膚／創(chuàng)面組織HE染色圖 （×200）Fig.3 HE staining of rat skin／wound tissues in each group at different time points （ ×200）

3.3 各組大鼠皮膚／創(chuàng)面組織中NF?κB p65、 IKK、IκBα、 p?NF?κB p65、 p?IKK、 p?IκBα 蛋白表達(dá)水平對(duì)比

干預(yù)第7、14天，空白組、對(duì)照組、MEBO組大鼠創(chuàng)面組織中NF?κB p65、IKK蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型組 （P均 ＜0.05）；干預(yù)第7天，MEBO 組大鼠創(chuàng)面組織中NF?κB p65、 IκBα 蛋白表達(dá)水平均明顯高于貝復(fù)新組 （P均＜0.05），IKK蛋白表達(dá)水平明顯低于貝復(fù)新組 （P＜0.05）；干預(yù)第14天，MEBO組大鼠創(chuàng)面組織中 IKK、IκBα蛋白表達(dá)水平均明顯低于貝復(fù)新組 （P均＜0.05）；其余各組間 NF?κB p65、 IKK、 IκBα 蛋白表達(dá)水平未見明顯規(guī)律，詳見表2、圖4。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠皮膚／創(chuàng)面組織中NF?κB p65、IKK、IκBα蛋白表達(dá)水平對(duì)比 （±s）Table 2 Comparison of expression levels of NF?κB p65， IKK and IκBα in skin or wound tissues of rats in each group at different time points（±s）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠皮膚／創(chuàng)面組織中NF?κB p65、IKK、IκBα蛋白表達(dá)水平對(duì)比 （±s）Table 2 Comparison of expression levels of NF?κB p65， IKK and IκBα in skin or wound tissues of rats in each group at different time points（±s）

注：MEBO為濕潤(rùn)燒傷膏，NF?κB為核因子κB，IκB為NF?κB抑制蛋白，IKK為IκB激酶；空白組、對(duì)照組與模型組大鼠皮膚／創(chuàng)面采用生理鹽水紗布換藥處理，MEBO組大鼠創(chuàng)面采用MEBO換藥處理，貝復(fù)新組大鼠創(chuàng)面采用重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子凝膠換藥處理。各組大鼠皮膚／創(chuàng)面組織中NF?κB p65、IKK、IκBα蛋白表達(dá)水平組間兩兩對(duì)比，與空白組對(duì)比，aP＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組對(duì)比，bP＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組對(duì)比，cP＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與MEBO組對(duì)比，dP＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Note： MEBO － moist exposed burn ointment， NF?κB － nuclear factor?κB， IκB － inhibitor?κ binding protein， IKK － IκB kinase； The skin or wounds of rats in blank group， control group and model group were treated with dressing change with normal saline gauze， while the rat wounds in MEBO group and rb?bFGF group were respectively treated with dressing change with MEBO gauze and recombinant bovine basic fibroblast growth factor（rb?bFGF） gel.The expression levels of NF?κB p65， IKK， and IκBα in rat skin or wound tissues in each group were compared in pairs， and the differences were statistically significant as compared with the blank group（aP＜0.05），with the control group（bP＜0.05），with the model group（cP＜0.05），and with the MEBO group（dP ＜0.05）

組別Group只數(shù)Number of rats NF?κB p65IKK IκBα第3天Day 3第7天Day 7第14天Day 14第3天Day 3第7天Day 7第14天Day 14第3天Day 3第7天Day 7第14天Day 14 Blank group 6 0.57±0.03空白組0.61±0.03 0.63±0.01 0.85±0.04 0.93±0.02 1.00±0.01 0.73±0.04 0.80±0.03 0.80±0.03 Control group 6 0.57±0.01對(duì)照組0.62±0.01 0.58±0.04 0.79±0.03a 0.76±0.02a 1.05±0.03 0.68±0.01a 0.69±0.01a Model group 6 0.64±0.03ab 0.60±0.04abc貝復(fù)新組0.67±0.03ab 0.75±0.01模型組0.69±0.01ab 0.96±0.01ab 0.96±0.02ab 1.23±0.08ab 0.75±0.01b 0.75±0.1ab MEBO Group 6 0.59±0.01c 0.72±0.03a MEBO組0.60±0.02c 0.55±0.04ac 0.79±0.02ac 0.89±0.01abc 0.84±0.05abc 0.74±0.01b 0.69±0.04ac rb?bFGF group 6 0.60 ±0.01c 0.68±0.03abd F值F value 11.857 20.560 18.180 59.806 113.471 47.489 11.550 45.210 38.860 0.55±0.02abcd 0.58±0.04c 0.93±0.01abcd 0.94±0.02bd 0.99±0.05cd 0.74±0.01b 0.63±0.01abcd P值P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

干預(yù)第7、14天，空白組、對(duì)照組、MEBO組、 貝復(fù) 新 組 大 鼠 創(chuàng) 面 組 織 中 p?NF?κB p65、p?IKK、 p?IκBα 蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型組（P均＜0.05），對(duì)照組、MEBO組、貝復(fù)新組大鼠創(chuàng)面組織中 p?NF?κB p65、 p?IKK、 p?IκBα 蛋白表達(dá)水平均明顯高于空白組 （P均＜0.05）；干預(yù)第7 天， MEBO 組大鼠創(chuàng)面組織中 p?NF?κB p65、p?IKK、 p?IκBα 蛋白表達(dá)水平均明顯低于貝復(fù)新組（P 均 ＜0.05）； 其余各組間 p?NF?κB p65、 p?IKK、p?IκBα蛋白表達(dá)水平未見明顯規(guī)律，詳見表3、圖4。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠皮膚／創(chuàng)面組織中 NF?κB p65、 IKK、 IκBα 及 p?NF?κB p65、 p?IKK、 p?IκBα蛋白表達(dá)水平條帶圖Fig.4 Bar chart of expression levels of NF?κB p65， IKK， IκBα and p?NF?κB p65， p?IKK， p?IκBα in skin or wound tissues of rats in each group at different time points

表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠皮膚／創(chuàng)面組織中 p?NF?κB p65、 p?IKK、 p?IκBα蛋白表達(dá)水平對(duì)比 （±s）Table 3 Comparison of expression levels of p?NF?κB p65， p?IKK and p?IκBα in skin or wound tissues of rats in each group at different time points（±s）

表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠皮膚／創(chuàng)面組織中 p?NF?κB p65、 p?IKK、 p?IκBα蛋白表達(dá)水平對(duì)比 （±s）Table 3 Comparison of expression levels of p?NF?κB p65， p?IKK and p?IκBα in skin or wound tissues of rats in each group at different time points（±s）

注： MEBO為濕潤(rùn)燒傷膏， p?NF?κB為磷酸化核因子κB， p?IκB為磷酸化NF?κB抑制蛋白， p?IKK為磷酸化IκB激酶； 空白組、 對(duì)照組與模型組大鼠皮膚／創(chuàng)面采用生理鹽水紗布換藥處理，MEBO組大鼠創(chuàng)面采用MEBO換藥處理，貝復(fù)新組大鼠創(chuàng)面采用重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子凝膠換藥處理。各組大鼠皮膚／創(chuàng)面組織中p?NF?κB p65、p?IKK、p?IκBα蛋白表達(dá)水平組間兩兩對(duì)比，與空白組對(duì)比，aP＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組對(duì)比，bP＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組對(duì)比，cP＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與MEBO組對(duì)比，dP＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Note： MEBO － moist exposed burn ointment， p?NF?κB － phosphorylation nuclear factor?κB， p?IκB － phosphorylation inhibitor?κ binding protein，p?IKK － phosphorylation IκB kinase； The skin or wounds of rats in blank group， control group and model group were treated with dressing change with nor?mal saline gauze， while the rat wounds in MEBO group and rb?bFGF group were respectively treated with dressing change with MEBO gauze and recombi?nant bovine basic fibroblast growth factor （rb?bFGF） gel.The expression levels of p?NF?κB p65， p?IKK and p?IκBα in rat skin or wound tissues in each group were compared in pairs，and the differences were statistically significant as compared with the blank group （aP ＜0.05）， with the control group（bP＜0.05），with the model group（cP＜0.05），and with the MEBO group（dP＜0.05）

組別Group只數(shù)Number of rats p?NF?κB p65p?IKK p?IκBα第3天Day 3第7天Day 7第14天Day 14第3天Day 3第7天Day 7第14天Day 14第3天Day 3第7天Day 7第14天Day 14 Blank group 6 0.18±0.03空白組0.21±0.02 0.18±0.02 0.45±0.01 0.47±0.04 0.45±0.03 0.29±0.01 0.21±0.03 0.29±0.03 Control group 6 0.40±0.09a 0.59±0.01a對(duì)照組0.39±0.02a 0.62±0.01a 0.94±0.03a 0.70±0.06a 0.55±0.03a 0.90±0.02a Model group 6 0.52±0.15a 0.65±0.02ac貝復(fù)新組0.81±0.01ab 0.60±0.03a模型組0.88±0.04ab 0.74±0.02ab 1.21±0.04ab 1.26±0.08ab 0.66±0.03ab 1.00±0.03ab MEBO Group 6 0.38±0.09a 1.16±0.06ab MEBO組0.52±0.01abc 0.42±0.03ac 0.66±0.02abc 0.86±0.02abc 0.71±0.03ac 0.52±0.03ac 0.72±0.03abc rb?bFGF group 6 0.40 ±0.11a 0.65±0.03ac F值F value 8.750 1376.455 477.143 352.600 441.700 184.930 206.172 517.661 436.800 0.68±0.02abcd 0.38±0.03ac 0.71±0.01abcd 0.97±0.02acd 0.73±0.05ac 0.60±0.01abcd 0.85±0.05acd P值P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

4 討論

慢性難愈合創(chuàng)面是各種因素導(dǎo)致皮膚完整性遭到破壞引起的局部組織損傷經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間治療后仍未愈合也無明顯愈合傾向的創(chuàng)面，且受損的皮膚或黏膜組織還可引發(fā)全身病理生理性改變。既往有研究表明， 炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 IKK／IκB／NF?κB 調(diào)節(jié)的炎癥反應(yīng)可參與創(chuàng)面的愈合過程，且部分藥物可影響NF?κB p65、 IKK、 IκBα 及 p?NF?κB p65、 p?IKK、p?IκBα 的表達(dá)水平［9－10］。

NF?κB幾乎存在于所有動(dòng)物細(xì)胞中，參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。 NF?κB p65作為 NF?κB家族成員之一，翻譯修飾后可調(diào)節(jié) IKK／IκB／NF?κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，并啟動(dòng)其靶基因轉(zhuǎn)錄，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)［11］。相關(guān)研究顯示， 慢性難愈合創(chuàng)面患者體內(nèi) IKK／IκB／NF?κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路持續(xù)異常激活，可促使多種促炎因子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)持續(xù)性細(xì)胞損傷和功能紊亂，影響創(chuàng)面的愈合進(jìn)程［12］。正常組織細(xì)胞中，NF?κB與其抑制物IκB結(jié)合構(gòu)成的NF?κB p65／p50 抑制蛋白激酶 IκB 二聚體復(fù)合物經(jīng)泛素降解后，IκB從二聚體上解聚，NF?κB p65被釋放進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)靶基因的表達(dá)［13－15］。 IκBα 作為 IKK／IκB／NF?κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的反應(yīng)因子， 其水平降低可抑制 IKK／IκB／NF?κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性， 且 NF?κB p65 表達(dá)水平也隨之降低［16－17］。 IKK作為 IKK／IκB／NF?κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活物， 可促使 NF?κB／IκBα 二聚體蛋白向 p?NF?κB、 p?IκBα轉(zhuǎn)化［18－20］， 機(jī)體受到刺激后， IKK／IκB／NF?κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的 IκBα在 IKK的作用下被磷酸化［12，21］。 本研究結(jié)果顯示， 干預(yù)第7、 14天模型組大鼠創(chuàng)面組織中 NF?κB p65、 IKK、 p?NF?κB p65、p?IKK、 p?IκBα 蛋白表達(dá)水平均明顯高于空白組及對(duì)照組。 可見， IKK／IκB／NF?κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活可能是慢性難愈合創(chuàng)面遷延不愈的機(jī)制之一。

MEBT／MEBO雖是慢性難愈合創(chuàng)面的有效治療方法， 但目前尚無 MEBT／MEBO 對(duì) IKK／IκB／NF?κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響的相關(guān)研究。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)第14天MEBO組大鼠創(chuàng)面愈合率明顯高于模型組，干預(yù)第7、14天 MEBO組大鼠創(chuàng)面組織中NF?κB p65、 IKK、 p?NF?κB p65、 p?IKK、 p?IκBα蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型組。創(chuàng)面形成后，IKK蛋白表達(dá)水平明顯升高，進(jìn)而促進(jìn)NF?κB二聚體蛋白降解， 激活 IKK／IκB／NF?κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響創(chuàng)面愈合，而MEBT／MEBO可能通過其藥理作用抑制IKK蛋白的表達(dá)，進(jìn)而降低IκBα、NF?κB p65含量，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面的再生修復(fù)。且研究結(jié)果顯示，干預(yù)第7天MEBO組大鼠創(chuàng)面組織中IKK、 p?NF?κB p65、 p?IKK、 p?IκBα蛋白表達(dá)水平均明顯低于貝復(fù)新組。可見，與貝復(fù)新相比，MEBO的作用更顯著。

綜上所述， MEBT／MEBO 可能通過降低NF?κB p65、IKK、 p?NF?κB p65、 p?IKK、 p?IκBα 蛋白表 達(dá)水平， 下調(diào) IKK／IκB／NF?κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。