血清lncRNA GAS5水平與2型糖尿病患者心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

張偉 韓潔 孫茜 許婧 曹寧 彭麗雅

糖尿病患者心血管疾?。╟ardiovascular dis?ease，CVD）的患病風(fēng)險(xiǎn)較非糖尿病人群增加約2～4 倍，且許多研究表明，2 型糖尿病是CVD 的危險(xiǎn)因素［1?2］。因此，早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防性治療是降低糖尿病CVD 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵。長(zhǎng)鏈非編碼RNA生長(zhǎng)停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5（long non?coding RNA growth arrest specific transcript 5，lncRNA GAS5）不僅具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，還在自身免疫性疾病、內(nèi)分泌性疾病等非腫瘤疾病中發(fā)揮重要功能［3?5］。此外，lncRNA GAS5還參與心肌成纖維細(xì)胞的增殖、分化，與CVD 的發(fā)生發(fā)展可能有密切聯(lián)系［6］。本研究通過(guò)對(duì)2型糖尿病患者進(jìn)行為期兩年的隨訪，探究其血清lncRNA GAS5 與CVD 發(fā)生的相關(guān)性，以期為改善2 型糖尿病患者預(yù)后提供依據(jù)。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年8月至2019年6月河北中石油中心醫(yī)院收治的2 型糖尿病患者248 例，根據(jù)隨訪2年期間是否發(fā)生CVD 將患者分為CVD 組106 例和非CVD 組142 例，其中CVD 組患者年齡46～76歲；非CVD 組患者年齡45～77 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均符合《2 型糖尿病基層診療指南》［7］；②CVD 患者納入時(shí)需接受內(nèi)科醫(yī)師對(duì)其進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，主要包括：有缺血性心臟病、心絞痛、心肌梗死等冠狀動(dòng)脈疾病，短暫性腦缺血發(fā)作、出血性腦卒中等腦血管疾病，靜息痛、間歇性跛行等周?chē)苄圆∽?；此外還需對(duì)其進(jìn)行體格檢查，頸動(dòng)脈、心電圖及下肢超聲檢查等進(jìn)一步確診；③患者依從性較好，可配合完成實(shí)驗(yàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組時(shí)已有CVD 者；②1 型糖尿病或伴有其他內(nèi)分泌疾病；③有嚴(yán)重臟器功能不全、腫瘤、結(jié)核、感染及自身免疫性疾?。虎苋焉锛安溉槠趮D女。收集并整理2型糖尿病患者一般臨床資料，主要包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、糖尿病病程、吸煙、收縮壓、舒張壓、心血管疾病家族史?；颊吆炇饡?shū)面知情同意書(shū)。研究經(jīng)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測(cè)定

低密度脂蛋白膽固醇（low?density lipoprotein cholesterol，LDL?C）、高密度脂蛋白膽固醇（high?density lipoprotein cholesterol，HDL?C）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、肌酐水平采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)；空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）水平采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)（檢測(cè)儀器為全自動(dòng)生化分析儀）；糖化血紅 蛋 白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）采 用HbA1c 分析儀檢測(cè)；腎小球?yàn)V過(guò)率估算值（estimat?ed glomerular filtration rate，eGFR）=141×（血肌酐/0.9）?1.209×（0.993）年齡，檢測(cè)步驟均嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 血清lncRNA GAS5 表達(dá)水平測(cè)定

采集各患者入組時(shí)空腹靜脈血液樣本，3 000 r/min 離心15 min（離心半徑為10 cm）后收集上層血清，-80℃保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quanti?tative real?time PCR，qRT?PCR）法檢測(cè)血清ln?cRNA GAS5 表達(dá)水平。RNA 提取試劑盒提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，內(nèi)參為GAPDH，引物序列見(jiàn)表1，由大連寶生物工程有限公司合成。qRT?PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃30 s，72℃1 min，45 個(gè)循環(huán)。qRT?PCR 反應(yīng)體系：cDNA（50 mg/L）2 μL，qPCR SYBR?Green Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。

表1 qRT?PCR 引物序列Table 1 qRT?PCR primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以（）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示；采用卡方檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson 法及Spearman 法分析；血清lncRNA GAS5水平對(duì)2 型糖尿病患者CVD 的預(yù)測(cè)價(jià)值采用受試者工作特征曲線(xiàn)（ROC）分析；影響2 型糖尿病患者發(fā)生CVD 的因素采用單因素及多因素Logistic 回歸分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CVD組與非CVD組一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

兩組性別、年齡、糖尿病病程、吸煙、收縮壓、舒張壓、HDL?C、TG、TC、HbA1c、FPG、eGFR、心血管疾病家族史比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CVD 組BMI、LDL?C 高于非CVD 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 CVD 組與非CVD 組一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of general data and laboratory indicators between the CVD group and the non?CVD group［n（%），（±s）］

表2 CVD 組與非CVD 組一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of general data and laboratory indicators between the CVD group and the non?CVD group［n（%），（±s）］

項(xiàng)目男性年齡（歲）BMI（kg/m2）糖尿病病程（年）吸煙收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）LDL?C（mmol/L）HDL?C（mmol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）HbA1c（%）FPG（mmol/L）eGFR（mL/min/1.73 m2）心血管疾病家族史非CVD 組（n=142）60（42.25）65.42±10.07 23.88±2.67 7.39±0.62 42（29.58）140.25±20.66 79.46±12.51 3.67±0.82 1.09±0.48 2.78±0.62 5.79±1.36 8.23±1.64 8.94±2.36 110.24±22.56 40（28.17）CVD 組（n=106）42（39.62）65.65±9.48 25.72±3.46 7.51±0.67 36（33.96）143.92±21.17 82.37±10.95 4.39±0.46 1.06±0.45 2.80±0.41 5.88±1.45 8.30±1.72 9.02±2.43 114.38±23.81 29（27.36）t/χ2值0.173 0.182 4.727 1.457 0.541 1.369 1.910 8.133 0.500 0.288 0.501 0.326 0.261 1.396 0.020 P 值0.677 0.855 0.000 0.147 0.462 0.172 0.057 0.000 0.618 0.773 0.617 0.745 0.794 0.164 0.888

2.2 CVD組與非CVD組血清lncRNA GAS5水平比較

CVD 組（1.00±0.21）血清lncRNA GAS5 水平低于非CVD 組（0.68±0.19），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.360，P＜0.05）。

2.3 2 型糖尿病并發(fā)CVD 患者血清lncRNA GAS5與一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相關(guān)性

Pearson 法及Spearman 法分析結(jié)果顯示，2 型糖尿病并發(fā)CVD 患者血清lncRNA GAS5 與BMI、舒張壓、LDL?C、TG 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 2 型糖尿病并發(fā)CVD 患者血清lncRNA GAS5 與一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相關(guān)性Table 3 Correlation of serum lncRNA GAS5 with general data and laboratory indicators in patients with type 2 diabetes complicated with CVD

2.4 血清lncRNA GAS5 水平對(duì)2 型糖尿病患者CVD 的預(yù)測(cè)價(jià)值

以血清lncRNA GAS5 為檢驗(yàn)變量繪制ROC 曲線(xiàn)顯示，血清lncRNA GAS5 預(yù)測(cè)2 型糖尿病患者CVD 的AUC 為0.844（95%CI：0.795～0.892），截?cái)嘀禐?.801，特異性為0.82，敏感度為0.75。見(jiàn)圖1。

圖1 ROC 曲線(xiàn)Figure 1 ROC curve

2.5 影響2 型糖尿病患者發(fā)生CVD 的單因素及多因素Logistic 回歸分析

單因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，lncRNA GAS5、BMI、舒張壓、LDL?C、TG 與2 型糖尿病患者發(fā)生CVD 有關(guān)（P＜0.05）。以單因素Logistic 回歸分析結(jié)果中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的lncRNA GAS5、BMI、舒張壓、LDL?C、TG 為自變量進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，BMI 是2 型糖尿病患者發(fā)生CVD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），lncRNA GAS5 是2 型糖尿病患者發(fā)生CVD 的保護(hù)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 影響2 型糖尿病患者發(fā)生CVD 的因素Logistic 回歸分析Table 4 Logistic regression analysis of single factor affecting the occurrence of CVD in patients with type 2 diabetes

3 討論

隨著目前生活水平的提高以及生活方式的轉(zhuǎn)變，糖尿病發(fā)病率急劇升高［8］。CVD 主要包括心血管病變、腦血管病變以及周?chē)K器血管性病變，其不僅是糖尿病患者的重要大血管病變之一，同時(shí)也是引起糖尿病患者殘疾及死亡的重要因素［9?10］。探索預(yù)測(cè)CVD 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)對(duì)2 型糖尿病患者長(zhǎng)期預(yù)后有重要作用。

臨床顯示心肌纖維化是多種心臟疾病的病理生理基礎(chǔ)，也是心肌重構(gòu)的重要特征［11?12］。Zhu等［13］研究顯示，lncRNA GAS5 可通過(guò)靶向miR?26a/b?5p 調(diào)控糖尿病心肌病的心肌細(xì)胞凋亡及纖維化，提示lncRNA GAS5 與心肌纖維化有重要聯(lián)系。結(jié)合本研究中2 型糖尿病CVD 患者血清ln?cRNA GAS5 表達(dá)降低，推測(cè)lncRNA GAS5 影響CVD 發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制之一為：病理因素導(dǎo)致lncRNA GAS5 表達(dá)水平下降，lncRNA GAS5 抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖、分化能力降低，心肌組織損傷及心肌纖維化加重，從而導(dǎo)致或加速CVD 疾病進(jìn)展。此外，既往研究顯示，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成引起的冠狀動(dòng)脈管腔狹窄或閉塞是造成多種CVD 的重要因素，而內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化早期重要的病理特征之一［14?15］。Diao 等［16］研究中，誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，lncRNA GAS5 水平降低，氧化應(yīng)激損傷加重。由既往文獻(xiàn)及本研究相關(guān)性結(jié)果，進(jìn)一步推測(cè)lncRNA GAS5 不僅能影響心肌纖維化發(fā)展，還有可能通過(guò)介導(dǎo)膽固醇運(yùn)轉(zhuǎn)、脂質(zhì)聚集以及氧化應(yīng)激來(lái)減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷。而lncRNA GAS5 表達(dá)水平降低則能逆轉(zhuǎn)上述過(guò)程，刺激內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，加速動(dòng)脈粥樣硬化及CVD 的發(fā)生發(fā)展。本研究通過(guò)ROC 曲線(xiàn)分析，還發(fā)現(xiàn)了lncRNA GAS5 預(yù)測(cè)CVD 的最佳截?cái)嘀?，此截?cái)嘀迪碌奶禺愋詾?.82%，敏感度為0.75%，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較高，但此截?cái)嘀等孕璐髽颖狙芯窟M(jìn)一步優(yōu)化。此外，本研究結(jié)果顯示BMI 是2 型糖尿病患者發(fā)生CVD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，lncRNA GAS5 是2 型糖尿病患者發(fā)生CVD 的保護(hù)因素。提示臨床中需密切監(jiān)測(cè)2 型糖尿病患者BMI 及l(fā)ncRNA GAS5 水平的變化，以防心肌纖維化、肥胖等因素加速CVD 的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，2 型糖尿病患者血清lncRNA GAS5水平降低可能與CVD 風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，且對(duì)CVD 的發(fā)生有重要預(yù)測(cè)作用。鑒于lncRNA GAS5 是心肌細(xì)胞增殖、分化的重要調(diào)控因子，今后可能成為CVD 的重要治療靶點(diǎn)之一。然而本研究也有一定的局限性，本研究作為橫斷面研究，無(wú)法完全推斷l(xiāng)ncRNA GAS5 與2 型糖尿病患者發(fā)生CVD 間的因果關(guān)系，有待進(jìn)一步基礎(chǔ)研究驗(yàn)證；此外，本研究為單中心的小樣本實(shí)驗(yàn)，患者選取時(shí)難免存在偏倚，無(wú)法外推至其他種族人群，尚需多中心、大樣本的前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。