現(xiàn)代生物技術在植物源化妝品原料開發(fā)中的應用研究進展

趙平，王艷，趙力民

（廣東藥科大學醫(yī)藥化工學院，廣東 廣州 510006）

化妝品安全評估是化妝品消費安全的重要保障，化妝品功效評價是對化妝品功效宣稱進行科學支持的有效手段。其中，化妝品原料是化妝品整個生命周期的源頭，承載著化妝品的主體，其安全和功效情況直接影響化妝品成品的安全與有效性[1]。我國是世界上植物資源最豐富的地區(qū)之一，擁有數(shù)以萬計的藥用植物資源有待作為化妝品新原料開發(fā)。然而，“神農(nóng)嘗百草，一日而遇七十毒”，植物化學和毒理學研究表明，許多植物成分有明確的致癌性、致敏性、致畸性、光毒性以及由于外界環(huán)境污染等造成的外源性不安全因素等[2]。因此，中國特色植物化妝品原料的開發(fā)和應用，并非坦途。而傳統(tǒng)“十年磨一劍”的藥物研發(fā)模式，無法滿足快速發(fā)展的化妝品行業(yè)對原料開發(fā)的需求速度，因此引入化學、信息科學、生命科學等學科中成熟便捷、廣泛使用的技術手段來進行化妝品植物原料的開發(fā)具有重要意義。

目前，世界各國紛紛開展針對植物化妝品原料開發(fā)的技術手段研究，根據(jù)原料開發(fā)“自上而下”或“自下而上”地有序選擇化學/信息/生物等一系列現(xiàn)代化技術形成“組合策略”，以最終實現(xiàn)通過單一方法或幾種技術組合的策略來評價化妝品原料的安全和功效性。歐洲化妝品協(xié)會（Cosmetics Europe）發(fā)布化妝品功效評價指南等相關評價方法，歐洲化妝品及其他外用產(chǎn)品功效評價專家組（EEMCO）通過計算機模擬篩選優(yōu)化等技術對植物化妝品的毒理安全性、刺激性及彈性、抗氧化性等功效進行了研究。韓國食品醫(yī)藥品安全評價院發(fā)布了部分植物化妝品的功效證實試驗方法，細胞生物學和斑馬魚實驗等現(xiàn)代生物技術被采用。在日本化妝品工業(yè)聯(lián)合協(xié)會（JCIA）發(fā)布的化妝品抗老化、美白和防曬功效評價指南中，也將細胞生物學等現(xiàn)代生物技術方法應用其中。目前，這些方法在我國的應用尚未普及，我國植物源化妝品的開發(fā)技術革新還有很大的提升空間。

本文針對我國目前植物源化妝品原料開發(fā)方法現(xiàn)狀，介紹了計算機輔助藥物設計、細胞生物學和斑馬魚模型等現(xiàn)代生物技術在該領域的應用，期望對新原料的開發(fā)起到積極的參考作用。

1 植物源化妝品原料開發(fā)領域的現(xiàn)狀分析

1.1 我國植物源潛在化妝品原料資源豐富，安全與功效篩選評估壓力巨大

在我國新頒布的2021版《已使用化妝品原料目錄》中，有3 115種屬于植物源功效原料。然而，截至目前，我國境內(nèi)已知36 512種高等植物物種，其中11 118種有藥用記載。因此，化妝品植物原料目錄還有很大的擴充空間[3]。同時，龐大的潛在化妝品用植物原料的存在，對原料的篩選開發(fā)效率和安全功效評價技術提出了更高要求。植物原料的提取獲得方式多樣，成分錯綜復雜，天然提取物的固有味道、顏色、穩(wěn)定性、成本等諸多因素，限制了其開發(fā)速率[4]。然而，目前年輕的化妝品消費人群對化妝品的要求理性而全面，對安全和功效性都有著較高標準。植物源化妝品原料的開發(fā)人員需要小心把握安全和功效這柄雙刃劍，為消費者帶來可以被實際感受到的效果[5-6]。因此，植物源化妝品原料在化妝品行業(yè)的進入，需要大量的安全和功效評估數(shù)據(jù)的支撐，基于原料龐大的基數(shù)，進行這些測評工作的壓力巨大。

1.2 國家對化妝品安全和功效評價的管理法規(guī)頻出，日趨嚴格

化妝品是直接作用于人體皮膚，其安全性對消費人群的健康緊密相關。此外，化妝品作為高度依賴產(chǎn)品宣稱的行業(yè)，其功效宣稱與產(chǎn)品銷量密切相關，直接影響到消費者權益和企業(yè)效益[7]。原料的安全性是化妝品產(chǎn)品安全的前提條件，活性原料的功效性是產(chǎn)品功效性的根本來源[8]。為保障《化妝品監(jiān)督管理條例》的實施而制定的《化妝品安全評估技術導則》和《化妝品功效宣稱評價規(guī)范》均規(guī)定，在注冊備案化妝品新原料和成品前，必須開展安全評估；化妝品的功效宣稱應當有充分的科學依據(jù)，企業(yè)對功效宣稱負責，并應當將有關研究數(shù)據(jù)或功效驗證材料在指定網(wǎng)站公開，接受社會監(jiān)督[9]。頻繁出臺的法規(guī)和管理辦法，充分展示了政府對整頓化妝品功效宣稱混亂現(xiàn)象的決心，也對化妝品企業(yè)提出了嚴峻的考驗。

1.3 化妝品原料的篩選和評估周期漫長，成本高昂

化妝品原料的安全功效篩選評估當前大多沿用傳統(tǒng)的藥物研發(fā)模式，各大評測機構對化妝品原料及產(chǎn)品的安全和功效評估廣泛采用的是動物在體和志愿者主觀評價配合客觀儀器評估等方法，這些方法實施周期漫長，影響因素眾多，評價標準制定難度較大，測試費用較高，人力物力成本較大[10]。因此，企業(yè)缺乏新原料研發(fā)的主動參與積極性。我國現(xiàn)有175家化妝品注冊和備案檢驗檢測機構，其中廣東省僅有37家。由于缺乏高效的篩選和評估技術，未建立相應的化妝品功效評價方法和標準，上述機構所開展的基本是化妝品成品的安全與功效性方面的基本檢測，目前尚未進行化妝品新原料開發(fā)和評估方面的探索。暨南大學等科研院校開展了部分的化妝品原料安全功效評估工作，但也不夠高效和系統(tǒng)化。

2 現(xiàn)代生物技術在植物源化妝品原料開發(fā)與評價中的應用

目前，植物源化妝品原料的安全功效篩選評估大多沿用傳統(tǒng)的“十年磨一劍”的藥物研發(fā)模式，研發(fā)周期較長、投入成本較高，成功率低，耗時費力，不能滿足快速發(fā)展的市場經(jīng)濟需求[11]?；瘜W、藥學、中藥學、信息科學、生命科學等多學科手段靈活運用，協(xié)同助力，是未來化妝品新原料安全與功效評估的主要發(fā)展趨勢[12]。其中，計算機輔助藥物設計、細胞生物學體外替代實驗以及斑馬魚模型等手段的交叉應用，將成為化妝品開發(fā)與評價方法的主導，見圖1。

圖1 植物源化妝品原料開發(fā)與評價方法示意圖Figure 1 Schematic diagram of the development and evaluation method of plant-derived cosmetic raw materials

2.1 計算機輔助藥物設計高效篩選植物源化妝品原料

計算機輔助藥物設計思路可以實現(xiàn)對物質(zhì)性質(zhì)高效快捷的預測模擬篩選，目標靶點選用病理學、皮膚生理學相關蛋白，進行植物源化妝品潛在功效原料的開發(fā)工作。計算機輔助藥物設計用于篩選植物源化妝品原料的方法一般分如下幾步：（a)對《已使用化妝品原料名稱目錄》(2021版)中的植物源原料根據(jù)功效進行整理，構建植物源化妝品原料信息數(shù)據(jù)庫[12]；（b）廣泛參考國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫、文獻和網(wǎng)站，進一步對植物源化妝品原料中所含功效性化學成分結(jié)構建庫[13]；（c）分析生理學作用靶點蛋白[14]；（d）通過藥物與靶點作用模型，預測和篩選化合物的功效性成分，構建功效原料化合物庫[15]；（e）通過生物化學和細胞實驗對所預測的功效進行驗證，并進一步進行人體功效評價，證實所需植物源化合物的功效性成分[16]?？捎糜谟嬎銠C輔助篩選的軟件詳見表1。

表1 計算機輔助篩選軟件Table 1 Computer-aided screening software

2.2 細胞生物學層面快速評價化妝品安全與功效

自2010年歐洲議會通過了修訂關于動物替代實驗3R原則以來，以細胞生物學為主的體外替代動物實驗受到化妝品研發(fā)人員的廣泛青睞。研究人員從細胞水平出發(fā)，利用分子生物學、遺傳學、免疫學、生理學等方法深入地探究化妝品與細胞作用機理。相對動物活體實驗，細胞實驗的實驗條件和實驗對象可控性更強，成本更低，速度更快，也更易獲得微觀細胞生理指標數(shù)據(jù)，可以為體外實驗和在體實驗提供良好的補充和完善[17-18]。因此，通過對體外動物細胞進行培養(yǎng)來建立細胞模型，評價化妝品原料或成品的安全性和功效性，有望成為化妝品開發(fā)與研究領域的重要手段。

目前針對化妝品功效進行的細胞生物學評價方法主要有MTT，酶聯(lián)免疫等。例如，Xiong等[19]采用MTT法和酶聯(lián)免疫法聯(lián)合對人參提取物刺激成纖維細胞增殖、成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生的透明質(zhì)酸進行研究，判斷皮膚的老化情況從而對化妝品的抗衰功效進行研究。在化妝品的美白評價方面，Chen等[20]通過體外培養(yǎng)黑素細胞或者按人體皮膚中的比例混合來培養(yǎng)黑素細胞與角質(zhì)形成細胞以模擬人體皮膚結(jié)構和代謝過程，然后采用MTT比色法與細胞圖像分析技術檢測藥用植物中黃酮、皂苷等活性成分對黑素生成量或?qū)谒丶毎鲋骋种谱饔糜绊懙?，來進行美白祛斑評價；Fang等[21]通過測定黑色素形成過程中酪氨酸酶、氧化酶和多巴色素互變酶的mDNA和DNA的表達水平及酪氨酸酶的合成量來評價藥用植物的美白功效。此外，對化妝品的保濕性能則可以通過測試體外培養(yǎng)的皮膚角質(zhì)細胞中透明質(zhì)酸(HA)、緊密連接蛋白(Claudins)、天然保濕因子(NMF)、水通道蛋白(AQPs)等指標的使用前后變化來評價[22]。表2中給出了目前基于細胞生物學層面的化妝品常見評價方法。

表2 細胞生物學方法評價化妝品的安全與功效Table 2 Safety and efficacy evaluation of cosmetics using cell biological methods

2.3 斑馬魚模型成為動物實驗的主要替代

斑馬魚經(jīng)濟低廉，飼養(yǎng)空間小，單次產(chǎn)卵數(shù)量大，胚胎透明，不需要解剖即可在顯微鏡下進行觀察，是一種高通量的模式生物。更為重要的是，斑馬魚的皮膚也和人類皮膚一樣分為表皮、真皮、下表皮等幾個部分，皮膚發(fā)育也和人類皮膚發(fā)育有較大相似之處，因此，可以通過建立斑馬魚模型來替代動物實驗模型，作為細胞與人體評價之間的重要過渡，為化妝品的安全和功效評估提供重要的依據(jù)。目前，斑馬魚模型已經(jīng)開始用于動植物提取物、抗菌劑、防曬劑等化妝品成分安全性的評價中。

在化妝品的安全性評估方面，可以用斑馬魚的胚胎來驗證化妝品的急性胚胎毒性。將斑馬魚胚胎暴露化妝品中，觀察死亡率、畸形率、畸形形態(tài)以及胚胎的孵化率，通過計算半數(shù)致死濃度（LC50）、半數(shù)致畸濃度（EC50）、致畸指數(shù)（TI）等指標來探討其對斑馬魚胚胎和幼魚的急性毒性[23]。Liu等[24]利用斑馬魚體內(nèi)模型檢測球形紅細菌提取物（LycogenTM）的生物毒性，結(jié)果顯示濃度高達100 μmol/L的LycogenTM不會對斑馬魚產(chǎn)生毒性。也可以對斑馬魚整體觀察評價，觀察斑馬魚各器官如心臟、腦部、鰭、身體水腫、出血、著色等毒性反應情況（見圖2），統(tǒng)計毒性發(fā)生率，驗證供試品對斑馬魚的胚胎毒性情況[25]。

圖2 斑馬魚胚胎毒性表型圖Figure 2 Zebrafish embryotoxicity phenotype

斑馬魚模型也可以用在化妝品的功效評價方面。例如，斑馬魚皮膚中的黑色素調(diào)控機制與人類高度一致，且生成速度快，肉眼能在顯微鏡下清晰觀察，配合圖像處理技術即可對化妝品減少黑色素的程度和體內(nèi)酪氨酸酶活性進行定量分析，實現(xiàn)對美白功效的評價[26]。Cha等[27]通過斑馬魚模型研究發(fā)現(xiàn)兩種海藻植物腔昆布（EC）和裂葉馬尾藻（SS）的提取物有抑制酪氨酸酶活性的作用，有望作為化妝品的美白劑。Lin等[28]選用斑馬魚體系評價紅車軸草中提取出的鷹嘴豆素A的體內(nèi)安全性和黑色素抑制效應，證實88 mol/L鷹嘴豆素A不具有毒性，且其黑素抑制和酪氨酸酶抑制效應較為明顯。在化妝品修復功效評價方面，斑馬魚成體組織、器官和魚鰭均有可再生性，切斷熒光標記斑馬魚的尾鰭后，斑馬魚炎癥模型在幾個小時內(nèi)即可建立，且尾鰭面積大易操作與觀測，因此斑馬魚成體尾鰭組織被廣泛運用檢測護膚品的修復功效[29]。Cheng等[30]等利用斑馬魚模型評估了紫草樹葉提取物對UV引起皮膚損傷的化學防護能力，證實紫草提取物具有降低吸收紫外線和降低ROS濃度的能力，從而減少UV介導的細胞凋亡，并據(jù)此認為紫草樹葉提取物有開發(fā)作為UV保護劑的潛力。斑馬魚模型在補水保濕功效評價方面也有重要的用途。一般傳統(tǒng)保濕功效評價方法為用皮膚角質(zhì)儀測量面部不同部位皮膚含水率、用水分儀測量經(jīng)皮失水率及用皮脂儀測量評估皮脂分泌量。儀器依賴性強，對志愿者要求高。在這方面，斑馬魚表皮就表現(xiàn)出優(yōu)良的性能，超出魚皮的滲透壓耐受范圍將會使斑馬魚產(chǎn)生脫水現(xiàn)象，尾部面積也會變小，因此通過高滲透溶液建立斑馬魚補水保濕誘導模型后，可以用來評估化妝品的保濕功效。用熒光PCR手段檢測相關基因如AQP3等的表達量可以評估化妝品的補水保濕功效[31]。表3中給出了目前基于斑馬魚模型的化妝品常見評價方法[32-34]。

表3 利用斑馬魚模型建立的化妝品常見評價方法Table 3 Common evaluation methods for cosmetics established using zebrafish model

目前，斑馬魚模型除了在美白功效評價中形成了團體標準外,在其他功效性評價和安全性評價中均未有固定的評價標準，這成為未來化妝品行業(yè)功效評價和安全性評價的新目標。

3 結(jié)語

作為世界上植物資源最豐富的地區(qū)之一，我國擁有數(shù)以萬計的化妝品可用植物資源有待開發(fā)[35]。以現(xiàn)代新技術，高效進行化妝品新原料開發(fā)，是化妝品企業(yè)在新形勢下?lián)屨际袌鲋聘唿c的重要戰(zhàn)略手段。計算機輔助藥物設計、細胞生物學及斑馬魚模型等在藥物研發(fā)領域已經(jīng)被證實是強有力的工具手段，將其導入化妝品功效原料的開發(fā)過程已經(jīng)引起了充分重視。隨著這些生物技術手段在開發(fā)化妝品功效原料中的應用越來越廣泛，傳統(tǒng)化妝品行業(yè)內(nèi)研發(fā)周期冗長、目標原料不明確、產(chǎn)品功效難以理解等問題有望得到解決，我國植物源化妝品的安全和功效評價體系將進一步完善。利用現(xiàn)代生物技術方法，建立統(tǒng)一的化妝品功效評價系統(tǒng)，建立完善的植物源化妝品安全與功效評價體系，這對凈化國內(nèi)化妝品市場、維護我國化妝品行業(yè)的健康發(fā)展，具有極為重要的意義。