lncRNA NR2F2在胰腺癌組織中的表達及其與患者預(yù)后的關(guān)系

陳小芳 韓曉銳

胰腺癌是破壞性和致死性較高的惡性腫瘤之一。胰腺癌患者5年生存率極低（＜9.0%）[1]，有約一半患者會發(fā)展為轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤，5年相對生存率僅為2.9%[2]。早期診斷和治療有助于提高生存率，但往往患者一旦出現(xiàn)癥狀已經(jīng)處于晚期。因此，篩選合適的胰腺癌生物標志物，有助于提高風(fēng)險人群篩查有效性。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一類高豐度但蛋白質(zhì)編碼能力有限或無編碼能力的RNA轉(zhuǎn)錄本[3]，參與包括免疫反應(yīng)、炎癥和癌癥進展在內(nèi)的多種生物學(xué)過程[4]。在胰腺癌進展中，lncRNA在癌細胞增殖、細胞凋亡、遷移和侵襲等方面具有關(guān)鍵調(diào)控作用[5]。已有研究表明：lncRNA核受體亞家族2組F成員2（nuclear receptor subfamily 2 group F member 2,NR2F2）是致癌基因[6]。下調(diào)癌組織中l(wèi)ncRNA NR2F2的表達，可通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）6活性，將大腸癌細胞周期阻滯于G1期。lncRNA NR2F2在前列腺癌組織中表達上調(diào)，抑制癌細胞死亡，導(dǎo)致細胞周期停滯，這一機制可能與CDK4表達水平相關(guān)[7]；而在胰腺癌進程中，則是CDK4、CDK6起關(guān)鍵作用[8]。這些研究提示lncRNA NR2F2可能通過調(diào)控胰腺細胞周期參與胰腺癌進展。本研究探討了胰腺癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA NR2F2表達水平及預(yù)后意義，旨在為臨床胰腺癌診治提供潛在生物標志物。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2015年9月—2018年7月在西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院接受手術(shù)治療的125例胰腺癌患者的臨床資料，切取患者癌組織及癌旁組織標本。納入標準：患者未接受過放化療或中醫(yī)抗腫瘤治療；經(jīng)病理檢查確診為胰腺癌；手術(shù)為根治性切除術(shù)。排除標準：合并其他腫瘤；其他重要器官功能嚴重異常；與患者及家屬無法正常溝通?；颊叱鲈汉筮M行定期電話和門診復(fù)診隨訪。隨訪時間自腫瘤組織活檢或手術(shù)日期起，至2021年6月30日結(jié)束。隨訪時間最短6個月，最長36個月。失訪15例（12.0%）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有患者及其家屬了解本研究相關(guān)內(nèi)容同時簽署知情同意書。

1.2 lncRNA NR2F2表達水平的檢測 采用RT-PCR法。取新鮮組織樣本，利用RNA提取試劑盒（Invitrogen，美國）提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，美國）操作說明制備cDNA。以U6為內(nèi)參，引物序列：F-5′TCAGCCGGAAAACTACAAGCTC 3′，R-5′TCTTCGTGTAGCTGTTCCACC3′；U6：F-5′TCCGATCGTGAAGCGTTC 3′，R-5′GTGCAGGGTCCGAGGT 3′。引物均由上海生工公司合成。反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄3 min，95℃孵育15 s變性；60℃退火60 s，72℃延伸15 s，共45個循環(huán)，繪制熔解曲線，用2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.3 分組及觀察指標 根據(jù)lncRNA NR2F2相對表達量中位數(shù)對患者進行分組，高于中位數(shù)者為lncRNA NR2F2高表達組，低于中位數(shù)者為lncRNA NR2F2低表達組。對兩組患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤分化程度、腫瘤病理（tumor-node-metastasis,TNM）分期、神經(jīng)轉(zhuǎn)移情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、糖類抗原（CA19-9）、癌胚抗原（CEA）等臨床資料進行比較，并分析lncRNA NR2F2表達水平對這些因素的影響。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier繪制生存率曲線，組間比較采用log-rank檢驗。采用Cox單因素和多因素回歸分析胰腺癌患者預(yù)后的危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同分期胰腺癌組織及癌旁組織lncRNA NR2F2表達水平的比較 RT-PCR檢測可見：Ⅰ/Ⅱ期胰腺癌組織中l(wèi)ncRNA NR2F2相對表達量為1.56±0.28，Ⅲ/Ⅳ期相對表達量為1.59±0.25，癌旁組織為1.02±0.16。與癌旁組織相比，胰腺癌組織中l(wèi)ncRNA NR2F2相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但Ⅲ/Ⅳ期與Ⅰ/Ⅱ期癌組織中l(wèi)ncRNA NR2F2相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 lncRNA NR2F2高表達組與低表達組患者臨床資料比較 lncRNA NR2F2相對表達量中位數(shù)為（1.27±0.24），lncRNA NR2F2高表達組 67例，lncRNA NR2F2低表達組58例。性別、TNM分期、神經(jīng)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CA19-9水平在兩組患者間均存在統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。見表1。

表1 lncRNA NR2F2高表達組與低表達組患者臨床資料比較[例（%）]

2.3 lncRNA NR2F2表達與預(yù)后關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線分析表明：lncRNA NR2F2高表達組術(shù)后3年生存率低于低表達組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 lncRNA NR2F2高表達組與低表達組患者術(shù)后3年生存率的比較

2.3 胰腺癌患者預(yù)后的影響因素分析 單因素分析顯示：TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CA19-9水平、lncRNA NR2F2表達水平與患者預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。多因素Cox回歸分析顯示：TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA NR2F2表達水平是胰腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素（均P＜0.05）。見表2。

表2 胰腺癌患者預(yù)后的影響因素分析

3 討論

胰腺癌患者往往生存率低，轉(zhuǎn)移率高，確診即為晚期，是人類癌癥死亡的主要原因之一[9]。胰腺癌患者預(yù)后極差，常規(guī)放療和化療在胰腺癌治療中存在一定局限性[10]。因此，尋找胰腺癌早期診斷治療的生物靶標，可提高早期診斷效率，改善患者生存率。

本研究表明：lncRNA NR2F2表達與患者性別、TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)轉(zhuǎn)移以及CA19-9水平有關(guān)，提示lncRNA NR2F2可能參與胰腺癌進展。lncRNANR2F2在胰腺癌組織和癌旁組織的相對表達量比較有統(tǒng)計學(xué)意義，但Ⅲ/Ⅳ期癌組織與Ⅰ/Ⅱ期比較無統(tǒng)計學(xué)意義，可見lncRNA NR2F2可能發(fā)揮了促癌作用，但其相對表達量并不隨腫瘤進展程度加重而上調(diào)。張大鵬等[11]研究發(fā)現(xiàn)：lncRNA NR2F2靶向抑制miR-129-5p，促進膠質(zhì)瘤細胞增殖和抑制癌細胞凋亡，說明lncRNA NR2F2可能是治療膠質(zhì)瘤的分子靶點。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)：lncRNA NR2F2可能通過調(diào)節(jié)miR-320b促進非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡。上述研究提示：lncRNA NR2F2可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生物靶標，參與不同腫瘤發(fā)展。分析胰腺癌組織lncRNA NR2F2相對表達量的變化，在評估胰腺癌進展中具有可行性。

分析lncRNA NR2F2相對表達量與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：lncRNA NR2F2高表達組3年生存率低于低表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和lncRNA NR2F2表達水平是胰腺癌預(yù)后的獨立危險因素。既往研究提出：多種類型惡性腫瘤具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物特性，這是影響腫瘤患者預(yù)后的重要因素[13]。通過腫瘤分期判斷患者預(yù)后，根據(jù)腫瘤分期提前制定治療策略，是胰腺癌治療重要的評價指標[14]。蔣維香等[15]報道：胰腺癌患者癌組織中CD163+、CD204+表達水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，對腫瘤進展和預(yù)后有一定參考價值。Liang等[16]通過lncRNA微陣列鑒定了胰腺癌組織中存在表達異常的1 138個lncRNA，這些基因可能成為胰腺癌診斷和預(yù)后生物標志物。上述研究表明：lncRNA NR2F2可能通過調(diào)控癌細胞周期參與胰腺癌進展。因此，胰腺癌患者早期檢測lncRNA NR2F2表達水平，對胰腺癌預(yù)后有一定參考價值。本研究樣本量較小，且未對lncRNA NR2F2影響胰腺癌預(yù)后的分子機制進行探討，后期可結(jié)合基礎(chǔ)研究作進一步分析。

綜上所述，LncRNA NR2F2在胰腺癌腫瘤組織中高表達，是胰腺癌預(yù)后獨立危險因素，癌組織中的lncRNA NR2F2表達水平可能是胰腺癌患者預(yù)后標志物。