化肥配施有機(jī)肥對(duì)花生根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及共存網(wǎng)絡(luò)的影響①

李桂龍，李朋發(fā)，吳 萌，李忠佩*

化肥配施有機(jī)肥對(duì)花生根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及共存網(wǎng)絡(luò)的影響①

李桂龍1,2，李朋發(fā)1,2，吳 萌1,2，李忠佩1,2*

(1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

為評(píng)估化肥配施有機(jī)肥對(duì)花生根際細(xì)菌群落的影響，田間試驗(yàn)條件下研究了不施肥(CK)、施化學(xué)氮磷鉀肥(NPK) 和化學(xué)氮磷鉀肥+有機(jī)肥配施(NPKM) 對(duì)花生根際細(xì)菌群落多樣性、結(jié)構(gòu)和共存網(wǎng)絡(luò)的影響。結(jié)果表明：NPKM處理下花生根際土養(yǎng)分狀況明顯改善，特別是有效磷的含量，較CK和NPK處理分別提高了5.31倍 ～ 12.16倍和3.24倍 ～ 6.50倍；而NPK處理下花生根際土養(yǎng)分狀況并沒(méi)有明顯提升；SourceTracker 分析顯示，NPKM處理下根際細(xì)菌群落中只有2.1% ～ 5.5% 的物種來(lái)源于有機(jī)肥自身，但其花生根際細(xì)菌群落多樣性在生育期前期要明顯高于CK和NPK處理，而CK和NPK處理下根際細(xì)菌群落多樣性差異不大；限制性主成分分析(CAP) 顯示，施肥措施和生育期均對(duì)根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著影響，NPKM處理下花生根際土中富集了屬于根瘤菌目(Rhizobiales)、梭菌目(Clostridiales)和芽孢桿菌目(Bacillales)這一類根際促生菌，根際細(xì)菌共存網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，且網(wǎng)絡(luò)中重要連接點(diǎn)的比例要也明顯高于CK和NPK處理網(wǎng)絡(luò)?？梢?jiàn)，化肥配施有機(jī)肥有助于構(gòu)建一個(gè)健康穩(wěn)定的根際細(xì)菌群落。

化肥配施有機(jī)肥；根際微生物；細(xì)菌共存網(wǎng)絡(luò)

為了滿足不斷增長(zhǎng)的人口對(duì)糧食的需求，在過(guò)去的50年里，全世界的化肥使用量增加了700%[1]。然而，過(guò)量施用化肥會(huì)產(chǎn)生一系列環(huán)境問(wèn)題，包括土壤質(zhì)量退化、地下水污染及溫室氣體排放增加等[2]。因此，其他替代性農(nóng)藝措施如化肥配施有機(jī)肥已被廣泛采用，以緩解上述因過(guò)量使用化肥所導(dǎo)致的環(huán)境問(wèn)題[3-4]?；逝涫┯袡C(jī)肥的目標(biāo)是在維持環(huán)境可持續(xù)的同時(shí)，保證農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的服務(wù)能力，而土壤微生物對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的服務(wù)能力至關(guān)重要[5]。

根際微生物群落被稱為植物的“擴(kuò)展基因組”或“第二基因組”，在決定植物生長(zhǎng)發(fā)育方面起著重要作用[6]。以往的研究表明，施肥措施會(huì)影響土壤和植物相關(guān)微生物群落，進(jìn)而影響農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)能力[7]。因此，在越來(lái)越多地采用化肥配施有機(jī)肥的情況下也需要評(píng)估其對(duì)微生物群落的影響。以往比較常規(guī)施肥和化肥配施有機(jī)肥措施對(duì)土壤微生物的影響的研究大多集中在土壤微生物群落上。例如，劉佳等[8]發(fā)現(xiàn)有機(jī)無(wú)機(jī)配施后顯著增加了旱地紅壤細(xì)菌群落的多樣性；Bi等[9]發(fā)現(xiàn)化肥配施有機(jī)肥通過(guò)調(diào)控土壤解磷菌群落提升了稻田土壤磷的可利用性。盡管有關(guān)化肥配施有機(jī)肥對(duì)根際微生物群落的影響已有相關(guān)報(bào)道[10-11]，但這些研究多集中于某一生育期下施肥措施對(duì)根際微生物群落的影響。由于多種因素的影響，根際微生物群落在不同的生育期具有明顯的差異性。因此，有必要了解化肥配施有機(jī)肥措施下根際微生物群落隨生育期的動(dòng)態(tài)變化，這對(duì)于評(píng)估化肥配施有機(jī)肥對(duì)根際微生物的影響具有重要意義。

微生物群落的結(jié)構(gòu)對(duì)其功能有重要影響。然而，由于微生物群落眾多成員之間的相互關(guān)系十分復(fù)雜，這使得研究微生物群落的結(jié)構(gòu)成為一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。微生物共存網(wǎng)絡(luò)分析可以揭示這種復(fù)雜的相互關(guān)系，能夠?yàn)槿郝浣Y(jié)構(gòu)的研究提供新的見(jiàn)解[12-13]。目前，網(wǎng)絡(luò)分析已被用于探索不同環(huán)境中不同微生物類群之間的相互作用[14-15]。網(wǎng)絡(luò)分析還可以識(shí)別對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和潛在功能影響最大的關(guān)鍵物種或其他重要微生物[13]，而這些往往很難用微生物生態(tài)學(xué)中廣泛使用的標(biāo)準(zhǔn)α或β多樣性指標(biāo)來(lái)揭示。Fan等[10-11]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，化肥配施有機(jī)肥能夠提升根際生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵模塊的微生物群落穩(wěn)定性及關(guān)鍵微生物菌群的多樣性，進(jìn)而提高小麥產(chǎn)量?？梢?jiàn)，利用網(wǎng)絡(luò)分析探究施肥措施對(duì)根際微生物群落相互作用的影響，可能會(huì)幫助人們向預(yù)期方向調(diào)節(jié)植物微生物群，提高農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的資源利用效率。

花生是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，然而由于不合理的農(nóng)業(yè)管理措施，造成了花生產(chǎn)量和品質(zhì)的持續(xù)下降[16]。提高花生產(chǎn)量和品質(zhì)的一個(gè)潛在方法是通過(guò)合理的農(nóng)藝措施來(lái)調(diào)控支持植物健康的微生物群落以發(fā)揮其促生功能，特別是那些在根際的微生物群落。為此，本研究通過(guò)田間試驗(yàn)，以花生這一典型作物為研究對(duì)象，研究化肥配施有機(jī)肥對(duì)花生根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和共存網(wǎng)絡(luò)的影響，以期為管理豐富的植物微生物組提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

田間試驗(yàn)設(shè)置于江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院贛東北紅壤綜合試驗(yàn)區(qū)，該試驗(yàn)區(qū)位于江西省撫州市東鄉(xiāng)縣境內(nèi)(116°35′11″E、28°10′59″N)，屬亞熱帶濕潤(rùn)氣候區(qū)，過(guò)去50年平均年降水量為1 750 mm，降水主要集中在4—6月。試驗(yàn)地土壤類型為第四紀(jì)紅黏土母質(zhì)發(fā)育而來(lái)的紅壤，表層土壤(0 ～ 20 cm)的基礎(chǔ)養(yǎng)分特性為：pH 4.49，有機(jī)質(zhì)13.82 g/kg，全氮1.11 g/kg，全磷0.46 g/kg，全鉀11.75 g/kg，堿解氮90.0 mg/kg，有效磷18.8 mg/kg，速效鉀130.4 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

田間試驗(yàn)始于2014年，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理：①不施肥(CK)，②施化學(xué)氮磷鉀肥(NPK)，③化學(xué)氮磷鉀肥配施有機(jī)肥(NPKM)。肥料年施用量為：N 135 kg/hm2、P2O581 kg/hm2和K2O 135 kg/hm2。在NPKM處理中，50% 的 N 來(lái)源于化肥，50% 的 N 來(lái)源于有機(jī)肥，即保證總施氮量不變。氮肥使用尿素(N，460 g/kg)，磷肥使用過(guò)磷酸鈣(P2O5，120 g/kg)，鉀肥使用氯化鉀(K2O，600 g/kg)，有機(jī)肥使用豬糞(每年施用前測(cè)定其N(xiāo)含量)。所有肥料在作物種植前一次性基施，肥料基施方式為株間穴施。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積為27 m2(6 m × 4.5 m)。供試花生品種為粵油256，于4月中旬條播，行距40 cm，穴距20 cm，每穴播種2粒，種植密度約為12.5 萬(wàn)穴/hm2。

于2020年在花生苗期(5月18日，T1)、花針期(6月17日，T2)、結(jié)莢期(7月16日，T3)各取樣1次。采樣時(shí)每小區(qū)分作2個(gè)半?yún)^(qū)進(jìn)行，每個(gè)半?yún)^(qū)取長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致具有代表性的花生樣品5株，將花生完全取出后，輕輕抖動(dòng)附著在根上的土壤，然后用無(wú)菌毛刷輕輕刷下緊密結(jié)合在根表的那部分土壤，即為根際土，徹底混勻后作為1個(gè)樣品，即每處理獲得6個(gè)重復(fù)樣品。土樣采集后盡快帶回室內(nèi)，揀除雜質(zhì)后過(guò)2 mm篩，而后將每個(gè)樣品分為兩份：一份風(fēng)干用于測(cè)定土壤化學(xué)性質(zhì)，一份保存在–80℃的冰箱中用于提取土壤DNA。另外，在花生成熟期時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理小區(qū)內(nèi)所有花生產(chǎn)量。

1.3 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定

土壤化學(xué)性質(zhì)的測(cè)定依照魯如坤[17]的方法進(jìn)行：采用電位法測(cè)定土壤pH(水︰土=2.5︰1，/)，采用重鉻酸鉀氧化–容量法測(cè)定土壤有機(jī)碳(SOC)，采用凱氏定氮法測(cè)土壤全氮(TN)，采用碳酸鈉熔融法測(cè)定土壤全磷(TP)，采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定土壤堿解氮(AN)，采用碳酸氫鈉浸提–鉬銻抗比色法測(cè)定土壤有效磷(AP)。

1.4 土壤DNA提取和16S rRNA基因高通量測(cè)序

稱取500 mg土壤樣品用FastDNA ? SPIN Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals，美國(guó))提取DNA，具體方法和步驟依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。有機(jī)糞肥的DNA提取也采用上述方法進(jìn)行。采用通用引物515F/907R 擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因片段[18]。將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化后建庫(kù)，采用Illumina MiSeq系統(tǒng)進(jìn)行雙向高通量測(cè)序(上海美吉)。

1.5 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

基于QIIME1分析平臺(tái)進(jìn)行高通量數(shù)據(jù)分析。序列經(jīng)質(zhì)控、拼接、比對(duì)后在97% 相似性水平劃分操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，通過(guò)與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rdp.cme.msu.edu/classifier/ classifier.jsp)比較確定細(xì)菌序列的系統(tǒng)學(xué)分類。

1.6 數(shù)據(jù)處理

花生產(chǎn)量、土壤化學(xué)性質(zhì)、細(xì)菌多樣性指標(biāo)采用Duncan多重比較來(lái)判斷差異顯著性(<0.05)。以NPKM處理的樣品為對(duì)照，以有機(jī)糞肥樣品為來(lái)源，采用SourceTracker2[19]來(lái)預(yù)測(cè)NPKM處理下樣品中細(xì)菌物種來(lái)源于有機(jī)糞肥中細(xì)菌物種的比例。采用R軟件vegan包的capscale()函數(shù)進(jìn)行限制性主成分分析(partial canonical analysis of principal coordinates，CAP)，以探究施肥及生育期對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。Mantel分析利用R軟件vegan包中的mantel()函數(shù)執(zhí)行。采用R軟件edgeR包的decideTestsDGE()函數(shù)分析不同施肥處理之間的差異物種?；赑earson相關(guān)性矩陣的共存網(wǎng)絡(luò)分析利用R軟件WGCNA包中的corAndPvalue()函數(shù)計(jì)算相關(guān)性系數(shù)。首先，剔除出現(xiàn)頻次少的OTU(保留在1/3及以上的樣品中出現(xiàn)的OTU)。值經(jīng)過(guò)BH矯正，之后刪除值小于0.85且值大于0.0001的值。網(wǎng)絡(luò)參數(shù)平均度、連通性、平均路徑長(zhǎng)度分別利用R軟igraph包中的degree()、edge_connectivity()、average.path.length()函數(shù)進(jìn)行計(jì)算。通過(guò)計(jì)算節(jié)點(diǎn)的值(within-module connectivity，模塊內(nèi)連通性)和值(among-module connectivity，模塊間連通性)來(lái)對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分類[20]。將≤2.5且≤0.62的節(jié)點(diǎn)定義為邊緣節(jié)點(diǎn)(peripherals)，這類節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中與其他節(jié)點(diǎn)聯(lián)系較少；將>2.5且≤0.62的節(jié)點(diǎn)定義為模塊中心節(jié)點(diǎn)(module hubs)，這類節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)模塊內(nèi)部連接性較高；將≤2.5且>0.62的節(jié)點(diǎn)定義為重要連接點(diǎn)(connectors)，這類節(jié)點(diǎn)為聯(lián)系模塊之間的樞紐；將>2.5且>0.62的節(jié)點(diǎn)定義為網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)(network hubs)，這類節(jié)點(diǎn)為在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)和模塊中連接性都較高的節(jié)點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)圖在Gephi(https://gephi.org/)軟件中繪制；和弦圖用R軟件circlize包繪制；其他圖均用R軟件ggplot2包繪制完成。

2 結(jié)果

2.1 不同施肥措施下花生產(chǎn)量

花生的產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表1)顯示，NPKM處理可以顯著提高花生產(chǎn)量，較CK處理提升了0.8倍；而NPK處理下花生產(chǎn)量與CK相比并沒(méi)有明顯提升。

表1 不同施肥措施下花生產(chǎn)量

注：表中同列不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(<0.05)。

2.2 不同施肥措施下土壤化學(xué)性質(zhì)

不同施肥處理下，花生根際土的化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生了明顯的變化(表2)。CK和NPK處理下根際土的化學(xué)性質(zhì)差異不顯著(>0.05)，僅在T2時(shí)期觀察到NPK處理下根際土的TP含量顯著高于CK處理(<0.05)。與CK和NPK處理相比，NPKM處理下根際土的pH較高，在T2時(shí)期顯著高于其他兩個(gè)處理(<0.05)；其余指標(biāo)，NPKM處理下均顯著提高(<0.05)，特別是AP含量，較CK和NPK處理分別提高了5.31倍 ～ 12.16倍和3.24倍 ～ 6.50倍。

2.3 有機(jī)肥細(xì)菌群落的分類組成及其向土壤的潛在傳遞

有機(jī)肥中細(xì)菌的群落與NPKM處理下花生根際細(xì)菌群落組成有很大不同(圖1A)。有機(jī)肥中細(xì)菌群落中擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、γ-變形桿菌(Gammaproteobacteria)、α-桿菌（Alphaproteobacteria）和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)細(xì)菌門(mén)類占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)；而NPKM處理下花生根際細(xì)菌群落以α-桿菌、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、β-變形桿菌(Betaproteobacteria)和綠彎菌(Chloroflexi)為主。此外，有機(jī)肥中細(xì)菌群落的多樣性明顯小于NPKM處理下花生根際細(xì)菌群落多樣性(圖1B)。SourceTracker的結(jié)果顯示，NPKM處理下根際細(xì)菌群落中只有2.1% ～ 5.5%(T1時(shí)期：5.5%；T2時(shí)期：3.7%；T3時(shí)期：2.1%)的物種可能來(lái)自于有機(jī)肥自身所攜帶的細(xì)菌物種(圖1C)。以上結(jié)果說(shuō)明，有機(jī)肥中的細(xì)菌組成對(duì)花生根際細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響甚小。

表2 不同施肥措施對(duì)根際土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

注：同列不同小寫(xiě)字母表示同一時(shí)期不同處理間差異顯著(<0.05)。

(M代表有機(jī)糞肥；NPKM_T1、NPKM_T2、NPKM_T3代表T1 ～ T3時(shí)期下NPKM處理下花生根際土樣品；圖B中不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05))

2.4 不同施肥措施下花生根際微生物群落特征

與CK和NPK處理相比，NPKM處理在生育期前期顯著提高了花生根際細(xì)菌多樣性；而在T3時(shí)期各處理間細(xì)菌多樣性沒(méi)有明顯差異。CK和NPK處理下根際細(xì)菌多樣性差異不大，僅在T2時(shí)期NPK處理下細(xì)菌多樣性相對(duì)于CK顯著增加，但增加的幅度要明顯小于NPKM處理(圖2)。

CAP分析表明，施肥和生育期均對(duì)根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著影響，分別解釋了整個(gè)群落變異的13.1%(施肥：=0.001)和16.7%(生育期：=0.001)(圖3)。CK和NPK處理沿著第二軸分開(kāi)，而NPKM處理與CK和NPK處理沿著第一軸分開(kāi)，說(shuō)明NPKM處理與CK(NPK)處理細(xì)菌群落的差異要大于CK與NPK處理細(xì)菌群落的差異(圖2A)。T2和T3時(shí)期細(xì)菌群落沿著第二軸分開(kāi)，而T1時(shí)期細(xì)菌群落與T2和T3時(shí)期細(xì)菌群落沿著第一軸分開(kāi)，說(shuō)明T1與T2(T3)時(shí)期細(xì)菌群落的差異要大于T2與T3時(shí)期細(xì)菌群落的差異(圖2B)。Mantel檢驗(yàn)表明，各土壤化學(xué)指標(biāo)均顯著影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；其中AP對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大(表3)。

(圖中*表示在P<0.05 水平上差異顯著，**表示在P<0.01水平上差異顯著)

(不同變量(施肥措施和生育期)對(duì)整個(gè)根際細(xì)菌群落變異的解釋率標(biāo)注于圖的上方)

2.5 不同施肥措施下土壤細(xì)菌差異OTU

在T1時(shí)期，CK處理富集了9個(gè)OTU，主要?dú)w屬于根瘤菌目(Rhizobiales)和厭氧繩菌目(Anaerolineales)；NPK處理富集了20個(gè)OTU，主要?dú)w屬于纖線桿菌目(Ktedonobacterales)和變形桿菌(Proteobacteria)下一個(gè)未鑒別的目；NPKM處理富集了53個(gè)OUT，大部分歸屬于根瘤菌目(Rhizobiales)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、芽孢桿菌目(Bacillales)和梭菌目(Clostridiales)(圖4A，4D)。在T2時(shí)期，有8個(gè)OTU在CK處理中富集，主要隸屬于鞘氨醇桿菌目( Chitinophagales)；只有4個(gè)OTU在NPK處理下富集；而NPKM處理下富集了70個(gè)OTU，主要隸屬于根瘤菌目、梭菌目、紅螺菌目(Rhodospirillales)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、芽孢桿菌目和弗蘭克氏目(Frankiales)(圖4B，4E)。同樣，在T3時(shí)期NPKM處理下富集了最多數(shù)目的OTU，主要?dú)w屬于根瘤菌目、梭菌目、酸桿菌暫定目(Candidatus Solibacter)、紅螺菌目和鞘脂單胞菌目(圖4C，4F)。總體上看，與CK和NPK處理相比，NPKM處理下花生根際屬于根瘤菌目、梭菌目和芽孢桿菌目的物種豐度顯著增加。

表3 根際細(xì)菌群落組成與土壤化學(xué)性質(zhì)的Mantel分析

(圖A中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)OTU，點(diǎn)的大小代表每個(gè)OTU在所有樣品中的平均相對(duì)豐度，點(diǎn)的位置代表該OTU的相對(duì)豐度在所有處理中的相對(duì)比例，彩色的點(diǎn)表示與其他兩組處理比較，只在該組中顯著富集的OTU(橙色代表只在CK處理中顯著富集，藍(lán)色代表只在NPK處理中顯著富集，紫色代表只在NPKM處理中顯著富集)，灰色的點(diǎn)代表3組間兩兩比較無(wú)顯著差異的OTU，括號(hào)中的數(shù)字代表每個(gè)處理下富集的OTU數(shù)目；圖B中每條柱子左邊彩色的點(diǎn)代表該分類單元所屬的門(mén))

2.6 不同施肥措施下花生根際細(xì)菌群落的共存網(wǎng)絡(luò)特征

對(duì)不同施肥處理下的花生根際細(xì)菌群落進(jìn)行共存網(wǎng)絡(luò)分析，以探索根際細(xì)菌之間的相互作用(圖5A)。CK處理下的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)包含144個(gè)節(jié)點(diǎn)，159條邊；NPK處理下的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)包含237個(gè)節(jié)點(diǎn)，323條邊；NPKM處理下細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)包含288個(gè)節(jié)點(diǎn)，620條邊。NPKM處理下根際細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)與其他處理下的根際細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)相比具有更高的連通性(connectivity)和平均度(average degree)，表明NPKM處理下花生根際細(xì)菌之間的相互作用要比其他處理下復(fù)雜。而NPKM處理下細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中平均路徑長(zhǎng)度(average path length)卻低于其他處理，表明NPKM處理下細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中物種間的信息傳遞效率更高。

(A圖中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)OTU，點(diǎn)的大小代表節(jié)點(diǎn)的度，邊的顏色代表正負(fù)相關(guān)性(紅色正相關(guān)，綠色負(fù)相關(guān))，根據(jù)節(jié)點(diǎn)所屬的門(mén)對(duì)其著色；B圖中兩個(gè)扇形之間的條帶代表兩個(gè)門(mén)之間的連接數(shù)，每個(gè)條帶的寬度代表其對(duì)應(yīng)的連接數(shù)占整個(gè)網(wǎng)絡(luò)連接數(shù)的比例，扇形依據(jù)其所屬的門(mén)進(jìn)行著色)

各施肥處理下網(wǎng)絡(luò)中細(xì)菌間的相互作用(邊)在門(mén)水平上的分布模式明顯不同(圖5B)。在NPK和NPKM處理網(wǎng)絡(luò)中，對(duì)細(xì)菌相互作用貢獻(xiàn)最大的是變形桿菌門(mén)(Proteobacteria)；而在CK處理網(wǎng)絡(luò)中，貢獻(xiàn)最大的是酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)。擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)在NPK處理網(wǎng)絡(luò)中占有的連接數(shù)的比例(9.29%)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其在CK和NPKM處理網(wǎng)絡(luò)中(CK：18.24%；NPKM：21.77%)；而放線菌門(mén)(Actinobacteria)在NPK處理網(wǎng)絡(luò)中所占有的邊的比例(27.24%)要遠(yuǎn)高于其在CK和NPKM處理網(wǎng)絡(luò)中(CK：11.94%；NPKM：14.35%)。此外，綠灣菌門(mén)(Chloroflexi)在CK和NPK處理網(wǎng)絡(luò)中對(duì)細(xì)菌相互作用的貢獻(xiàn)(CK：25.79%；NPK：26%)要大于其在NPKM處理網(wǎng)絡(luò)中(14.19%)；而芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)在NPKM處理網(wǎng)絡(luò)中所占有的邊的比例(21.94%)要遠(yuǎn)高于其在CK和NPK處理網(wǎng)絡(luò)中(CK：9.43%；NPK：13.93%)。

各處理下的網(wǎng)絡(luò)中均沒(méi)有觀察到網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)；CK和NPK處理網(wǎng)絡(luò)中各檢測(cè)到一個(gè)模塊中心節(jié)點(diǎn)，而NPKM處理網(wǎng)絡(luò)中沒(méi)有檢測(cè)到此類節(jié)點(diǎn)(圖6)。值得注意的是，NPKM處理網(wǎng)絡(luò)中重要連接點(diǎn)的比例要明顯高于CK和NPK處理網(wǎng)絡(luò)，表明NPKM處理下花生根際細(xì)菌群落之間的相互作用更加密切。

3 討論

化肥配施有機(jī)肥料能夠有效提升土壤肥力、改善土壤生態(tài)環(huán)境[21]。本研究中，NPKM處理下花生根際土的AP含量顯著提高，這與Chen等[22]的田間試驗(yàn)結(jié)果相似。一方面，有機(jī)肥自身所含有的大量有機(jī)磷通過(guò)礦化轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)磷，提高了根際土壤的AP含量。另一方面，有機(jī)碳的添加提升了土壤微生物利用難溶性磷的能力，從而活化出更多的可利用性磷[23]。其他土壤養(yǎng)分指標(biāo)，如SOC、TN、TP和AN在NPKM處理下含量也明顯升高。同時(shí)，與CK相比，NPK處理下花生根際的養(yǎng)分狀況并沒(méi)有得到明顯改善。劉佳等[8]的研究也表明，旱地紅壤經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期施肥，NPK處理對(duì)土壤肥力的提升效果遠(yuǎn)不如NPKM處理。本研究田間產(chǎn)量數(shù)據(jù)也表明，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)7年的連續(xù)施用化學(xué)氮磷鉀肥 (NPK處理)，相對(duì)于CK，花生的產(chǎn)量并沒(méi)有明顯提升，而化肥配施有機(jī)肥措施下(NPKM處理)花生產(chǎn)量較CK提高了0.8倍。這說(shuō)明在紅壤旱地花生生產(chǎn)中，化肥有機(jī)肥配施要優(yōu)于單施化學(xué)氮磷鉀肥。

(圖中百分?jǐn)?shù)代表各類節(jié)點(diǎn)占整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)總數(shù)的比例，圖中垂直虛線代表橫坐標(biāo)值為0.62，水平虛線代表縱坐標(biāo)值為2.5)

土壤微生物多樣性在支持多種生態(tài)系統(tǒng)功能中起著至關(guān)重要的作用[24]。本研究中，盡管在最后一個(gè)時(shí)期各處理間根際細(xì)菌群落多樣性差異不大，但在前期NPKM處理下花生根際細(xì)菌群落多樣性明顯提高。有研究表明，有機(jī)肥的添加為土壤微生物提供了充足的底物，有利于微生物在根際定殖，導(dǎo)致根際微生物多樣性增加[25]。此外，外源添加的有機(jī)糞肥自身攜帶的大量微生物也是造成NPKM處理下根際細(xì)菌群落多樣性提高的一個(gè)重要原因[26]。本研究通過(guò)比較有機(jī)糞肥與NPKM處理樣品中細(xì)菌群落組成與多樣性的差異，發(fā)現(xiàn)有機(jī)糞肥自身攜帶的細(xì)菌物種與NPKM處理樣品中細(xì)菌群落組成明顯不同，其群落多樣性遠(yuǎn)小于NPKM處理；Source Tracker分析也表明，NPKM處理樣品中細(xì)菌物種只有很少的比例來(lái)自于有機(jī)糞肥自身攜帶的細(xì)菌物種。說(shuō)明NPKM處理下花生根際細(xì)菌群落多樣性提高主要是由有機(jī)糞肥中充足的養(yǎng)分造成的。根際微生物在植物生產(chǎn)力、養(yǎng)分吸收和抗病能力方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6]。本研究表明，NPKM處理下花生根際屬于根瘤菌目(Rhizobiales)、梭菌目(Clostridiales)和芽孢桿菌目(Bacillales)的物種的相對(duì)豐度明顯增加。以往的研究表明，屬于梭菌目和芽孢桿菌目的菌屬具有促生作用，對(duì)植物的健康生長(zhǎng)至關(guān)重要[27-28]；屬于根瘤菌目(Rhizobiales)的根瘤菌能夠與豆科植物互作，行使共生固氮作用，對(duì)陸地氮循環(huán)具有重要意義[29]；且豆科植物根際屬于根瘤菌目的根瘤菌的豐度和多樣性對(duì)于根瘤的形成起著至關(guān)重要的作用[30]。這在一定程度上也表明，配施有機(jī)肥能夠通過(guò)調(diào)控根際有益菌屬進(jìn)而促進(jìn)花生結(jié)瘤固氮及生長(zhǎng)，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

共存網(wǎng)絡(luò)分析為認(rèn)識(shí)土壤微生物群落之間復(fù)雜的相互關(guān)系提供了新的途徑[13]。越來(lái)越多的研究表明，共存網(wǎng)絡(luò)的特性可能代表微生物之間的相互作用，可以影響微生物群落對(duì)外界擾動(dòng)的響應(yīng)[31-32]。本研究中，共存網(wǎng)絡(luò)分析表明，NPKM處理下根際細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)特性如節(jié)點(diǎn)數(shù)、連接數(shù)、平均度以及連通性明顯提高，表明NPKM處理下花生根際細(xì)菌群落形成了一個(gè)更為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。前人的研究表明，土壤養(yǎng)分在調(diào)節(jié)微生物群落之間相互作用的強(qiáng)度方面起著關(guān)鍵作用[33]。NPKM處理下根際土壤養(yǎng)分狀況明顯改善，而土壤養(yǎng)分的提升能夠?yàn)槲⑸锾峁└嗟馁Y源生態(tài)位，因此能夠塑造更加復(fù)雜的群落結(jié)構(gòu)和互作關(guān)系，形成更復(fù)雜的共存網(wǎng)絡(luò)。Santolini和Barabási[34]認(rèn)為，具有較高連通性的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)比具有較低連通性的簡(jiǎn)單網(wǎng)絡(luò)對(duì)環(huán)境擾動(dòng)的抵抗性更強(qiáng)。從這一點(diǎn)來(lái)說(shuō)，NPKM處理網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性可能表明，在化肥配施有機(jī)肥管理措施下，花生根際微生物對(duì)環(huán)境脅迫具有更強(qiáng)的彈性。重要連接點(diǎn)對(duì)于整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性和連接性至關(guān)重要[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，NPKM處理網(wǎng)絡(luò)中未觀測(cè)到模塊中心節(jié)點(diǎn)，但重要連接點(diǎn)的比例明顯增加。這意味著與其他處理相比，NPKM處理下花生根際細(xì)菌群落能夠維持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，進(jìn)一步表明化肥配施有機(jī)肥有助于花生根際細(xì)菌群落形成更穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以增強(qiáng)根際微生物對(duì)外界干擾的抵抗力。

4 結(jié)論

化肥配施有機(jī)肥能夠有效提升花生根際的養(yǎng)分水平并提高根際細(xì)菌群落的多樣性?；逝涫┯袡C(jī)肥改善了花生根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，富集了有益于花生結(jié)瘤固氮和生長(zhǎng)的物種?；逝涫┯袡C(jī)肥有助于根際細(xì)菌群落形成復(fù)雜的共生網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)增加了網(wǎng)絡(luò)中重要節(jié)點(diǎn)的比例，有利于根際細(xì)菌群落應(yīng)對(duì)復(fù)雜多變的根際環(huán)境。

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Effects of Chemical Fertilizer Combined with Organic Manure on Peanut Rhizosphere Bacterial Community Structure and Co-occurrence Network

LI Guilong1, 2, LI Pengfa1, 2, WU Meng1, 2, LI Zhongpei1, 2*

(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

To evaluate the effects of different fertilization on peanut rhizosphere bacterial community, three fertilization treatments were conducted in the field plot experiments. The treatments include no fertilizer (CK), nitrogen, phosphorus and potassium fertilizer (NPK), and application of NPK plus manure (NPKM). The diversity, community composition, and co-occurrence network of the rhizospheric bacteria were studied. The results showed that NPKM significantly improved the nutrient status in peanut rhizosphere soil, especially for the content of available phosphorus, which was 5.31–12.16 and 3.24–6.50 times higher than those of CK and NPK, respectively. However, NPK did not significantly improve the nutrient status of peanut rhizosphere soil. The results of SourceTracker showed that only 2.1%–5.5% of the bacteria community in NPKM potentially originated from organic manure. In the early growth stage, NPKM had a significantly higher bacterial community diversity as compared with CK or NPK. However, no significant differences of bacterial community diversity were detected between the CK and NPK. Partial canonical analysis of principal coordinates (CAP) corroborated that both growth stages and fertilization regimes had significant effects on the assembly of rhizosphere bacterial communities. A number of beneficial bacterial OTUs classified to Rhizobiales, Clostridiales, and Bacillales, were significantly enriched under NPKM. Rhizosphere bacterial co-occurrence network was most complex under NPKM, and the proportion of connectors was also highest under NPKM. The results indicate that chemical fertilizer combined with organic manure could help to build a healthy and stable rhizosphere bacterial community.

Chemical fertilizer combined with organic manure; Rhizosphere bacteria; Bacteria co-occurrence network

S154.3

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.03.009

李桂龍, 李朋發(fā), 吳萌, 等. 化肥配施有機(jī)肥對(duì)花生根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及共存網(wǎng)絡(luò)的影響. 土壤, 2022, 54(3): 498–507.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41771298)和江西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃一般項(xiàng)目(20203BBF63039)資助。

(zhpli@issas.ac.cn)

李桂龍(1988—)，男，山西大同人，博士研究生，主要從事花生根際微生物與其結(jié)瘤固氮效率關(guān)系的研究。E-mail：glli@issas.ac.cn