microRNA-214靶向調(diào)控HOXB7基因抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制與意義

劉 英 何鳳屏▲ 劉玉蘭 李定云

1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院體檢中心，廣東韶關(guān) 512026；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東韶關(guān) 512026；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院胃腸外科，廣東韶關(guān) 512026

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）為全球常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一，其死亡率排第三位。隨著我國(guó)人民的生活節(jié)奏加快以及飲食結(jié)構(gòu)改變，其發(fā)病率與病死率均持續(xù)升高，而且有年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類的健康。CRC 的病因尚未明確，其發(fā)病機(jī)理極其復(fù)雜、涉及到多階段、多步驟、多基因改變的過(guò)程。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)CRC 的早期診斷仍處于較低水平，約半數(shù)的患者在明確診斷時(shí)已進(jìn)入中期和晚期。因此，對(duì)CRC 發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行深入研究，尋找預(yù)防和治療的有效途徑，是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，也是亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。本研究認(rèn)為，microRNA-214（miRNA-214）上調(diào)導(dǎo)致HOXB7 基因下調(diào)，可能就是抑制CRC 細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵所在點(diǎn)，為此進(jìn)一步把Wnt/β-catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路納入研究范疇，分析其作用機(jī)制，旨在為CRC 轉(zhuǎn)移的早期診斷和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年12月汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院收治的200 例CRC 住院患者為研究對(duì)象，按照是否發(fā)生轉(zhuǎn)移分為無(wú)轉(zhuǎn)移組（100 例）和轉(zhuǎn)移組（100 例），另選取同期健康體檢者200 例為對(duì)照組。無(wú)轉(zhuǎn)移組中，男68 例，女32 例；年齡23～65歲，平均（57.91±5.36）歲。轉(zhuǎn)移組中，男71 例，女29 例；年齡23～66 歲，平均（58.01±5.40）歲；肝轉(zhuǎn)移47 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53 例。對(duì)照組中，男115 例，女85 例；年齡21～64 歲，平均（56.39±5.24）歲。三組的性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已得到醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)文號(hào)：YBAF-2018-012），所有受試者均已簽署知情同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①入選患者均為初次診治，首次接受抗腫瘤治療（包括放療、化療、免疫治療等）；②臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有急性感染性疾??；②合并嚴(yán)重的心肝腎肺等器官功能不全；③患者拒絕接受檢查；④經(jīng)研究者判斷患者不適合參加本研究；⑤標(biāo)本不合格，不能進(jìn)行檢測(cè)的樣本；⑥臨床數(shù)據(jù)缺失或記錄不規(guī)范樣本。

1.2 方法

①收集血漿標(biāo)本，所有研究對(duì)象均在清晨7:30 am，空腹抽取靜脈血檢測(cè)常規(guī)腫瘤標(biāo)志物，同時(shí)抽取5 ml 靜脈血置于EDTA 試管中，立即送到實(shí)驗(yàn)室提取DNA 或RNA，并放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)錂z。②利用人CRC 細(xì)胞SW480、SW1116（上海慧穎生物科技有限公司）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；③采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)miRNA-214、HOXB7、Wnt/β-catenin 的mRNA 的表達(dá)，并作相關(guān)性分析。檢測(cè)miRNA-214、HOXB7、Wnt/β-catenin 的引物和探針由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供，在BIO-RAD CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行熒光擴(kuò)增和檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)量。④采用miRanda、PicTar 和Tar-getScan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miRNA-214 的靶基因。⑤利用基因敲除和轉(zhuǎn)染技術(shù)驗(yàn)證miRNA-214 通過(guò)靶向HOXB7 基因調(diào)控Wnt/β-catenin 的表達(dá)的作用機(jī)制。⑥將miRNA-214 模擬物和重組有HOXB7 基因3' UTR 區(qū)miRNA-214 潛在結(jié)合位點(diǎn)的野生型和突變型的熒光素酶報(bào)告基因分別轉(zhuǎn)染到CRC 細(xì)胞系SW1116 和SW480 細(xì)胞，并檢測(cè)HOXB7 mRNA 和蛋白水平，為了進(jìn)一步研究miRNA-214 和HOXB7 之間的直接結(jié)合和抑制作用，24 h 后檢測(cè)熒光素酶活性，對(duì)HOXB7-wt-3' UTR 及其突變體型（FGFR1-mt-3' UTR）進(jìn)行擴(kuò)增和克隆pGL3 中熒光素酶報(bào)告基因，進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-214對(duì)HOXB7 基因的直接靶向調(diào)控促進(jìn)CRC 細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。

觀察三組中miRNA-214、HOXB7、Wnt/β-catenin的表達(dá)，分析三者的聯(lián)系，并且分析對(duì)CRC 細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三組miRNA-214 表達(dá)情況的比較

轉(zhuǎn)移組和無(wú)轉(zhuǎn)移組的miRNA-214 表達(dá)量分別為（1.23±0.34）和（2.05±1.19），均低于對(duì)照組的（5.94±1.84）（t值=27.69，P值＜0.05；t值=21.51，P值＜0.05），且轉(zhuǎn)移組低于無(wú)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=21.51，P＜0.05）（圖1）。

圖1 三組miRNA-214 表達(dá)情況的比較

2.2 miRNA-214 在CRC SW1116、SW480 細(xì)胞株中的表達(dá)情況

miRNA-214 在CRC SW1116 細(xì)胞株中的表達(dá)量為（3.57±1.89），低于對(duì)照組的（6.13±2.17），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.31，P＜0.05）；miRNA-214 在SW480 細(xì)胞株中的表達(dá)量為（2.86±1.74），低于對(duì)照組的（5.58±2.03）（t=23.78，P＜0.05）（圖2～3）。

圖2 miRNA-214 在CRC SW1116 細(xì)胞株中的表達(dá)量

圖3 miRNA-214 在CRC SW480 細(xì)胞株中的表達(dá)量

2.3 miRNA-214 對(duì)HOXB7 基因、CRC 細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的影響

首先評(píng)估FGFR1 敲除是否可以模擬miRNA-214過(guò)度表達(dá)的效果，用si RNA 轉(zhuǎn)染SW1116 細(xì)胞獲得HOXB7；Western 印跡分析證實(shí)HOXB7 表達(dá)減少（圖4A）。用miRNA-214 模擬物轉(zhuǎn)染SW1116 和SW480細(xì)胞，并且檢測(cè)HOXB7 mRNA 和蛋白水平，研究結(jié)果表明，在SW1116 和SW480 細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，miRNA-214 呈高表達(dá)，HOXB7 呈低表達(dá)。與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染si-HOXB7 的SW1116 和SW480 細(xì)胞顯示減少細(xì)胞集落形成 （P＜0.05）（圖4B），其效應(yīng)與miRNA-214 過(guò)表達(dá)相似。

圖4 Western blot 檢測(cè)miRNA-214、HOXB7、si-HOXB7 的表達(dá)

2.4 HOXB7 在CRC 組織和細(xì)胞株中的表達(dá)

與對(duì)照組比較，HOXB7 在SW1116 和SW480 細(xì)胞株中呈高表達(dá)水平（圖5A），HOXB7 在CRC 無(wú)轉(zhuǎn)移組和CRC 轉(zhuǎn)移組呈現(xiàn)高表達(dá)水平（圖5B）。

圖5 HOXB7 在CRC 組織和細(xì)胞株中的表達(dá)

2.5 miRNA-214 與HOXB7 表達(dá)的相關(guān)性分析

數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HOXB7 具有良好的生物活性，miRNA-214 潛在的結(jié)合位點(diǎn)在3' UTR 區(qū)域中（圖6A）。miRNA-214 模擬物轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，HOXB7表達(dá)受miRNA-214 負(fù)調(diào)控（圖6B、C）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，在CRC 患者組織和CRC SW1116 細(xì)胞中，miRNA-214 與TOXB7的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.394，P＜0.01）（圖6D）。

圖6 HOXB7 表達(dá)及其與miRNA-214 的相關(guān)性分析

2.6 miRNA-214 與HOXB7 熒光酶活性的相關(guān)性分析

在共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，與陰性對(duì)照細(xì)胞和空白細(xì)胞相 比，pcDNAmiRNA-214 在SW1116 和SW480 細(xì) 胞中的HOXB7-wt-3' UTR 熒光素酶活性降低（P＜0.05）（圖7A），且在HOXB7-mt-3' UTR 和pcDNAmiRNA-214 之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)熒光素酶活性的差異（圖7B）。

圖7 分析miRNA-214 與HOXB7 熒光酶活性的表達(dá)

2.7 miRNA-214 模擬物對(duì)HOXB7 表達(dá)的影響

miRNA-214 模擬物降低了SW1116、SW480 細(xì)胞中HOXB7 的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 miRNA-214 模擬物對(duì)HOXB7 表達(dá)的影響

2.8 HOXB7 表達(dá)對(duì)Wnt/β-catenin 表達(dá)的影響

采用免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)CRC SW1116 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HOXB7 過(guò)表達(dá)后，Wnt/β-catenin 表達(dá)也增高；而在加入miRNA-214 干擾HOXB7 后，Wnt/βcatenin 表達(dá)明顯下降（圖8）。

圖8 HOXB7 表達(dá)對(duì)Wnt/β-catenin 表達(dá)的影響

3 討論

CRC 為最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，早期無(wú)明顯癥狀，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，大部分患者在明確診斷時(shí)就發(fā)生轉(zhuǎn)移了。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，50%的原發(fā)性CRC 患者同時(shí)伴有肝轉(zhuǎn)移，而且部分病人在接受原發(fā)腫瘤手術(shù)切除和輔助化療后仍出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。其預(yù)后與診斷時(shí)機(jī)密切相關(guān)，這導(dǎo)致預(yù)后差和病死率高的重要因素，可見(jiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移是造成CRC 患者死亡的首要原因。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生-發(fā)展-侵襲-轉(zhuǎn)移的過(guò)程是腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞之間相互作用的連續(xù)動(dòng)態(tài)過(guò)程，這個(gè)過(guò)程是復(fù)雜的、多步驟的，多種細(xì)胞組分、相關(guān)基因以及標(biāo)志性分子參與，并形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。miRNA 是一種具備調(diào)控功能的小分子RNA，miRNA-214 在多種惡性腫瘤中低表達(dá)，而在癌旁正常組織中高表達(dá)，提示其可能具有抑制基因的特性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-214 與多種惡性腫瘤相關(guān)，可通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮抑癌和促癌作用。miRNA-214 在CRC 中表達(dá)下調(diào)，參與了CRC 的發(fā)生和發(fā)展，在癌細(xì)胞增殖過(guò)程中miRNA-214 可能直接或間接調(diào)控某些蛋白mRNA 3'UTR 區(qū)，使蛋白合成抑制減少，使細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖活性失調(diào)而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。HOXB7 基因?qū)偻串愋秃谢騂oxB 家族，是一種很重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在正常組織中幾乎不表達(dá)。HOXB7 基因的異常表達(dá)被國(guó)外學(xué)者證實(shí)與腫瘤的臨床惡性程度和不良預(yù)后有密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究的核心指標(biāo)HOXB7 基因最初是在研究腫瘤新生血管生成過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)的，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，推測(cè)其與腫瘤的血管生成有關(guān)。Wnt 為一種分泌型糖蛋白，導(dǎo)致β-catenin 積累。β-catenin 即β-連環(huán)蛋白，游離的β-catenin 進(jìn)入細(xì)胞核，可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，其異常表達(dá)或激活能引起腫瘤。Wnt 信號(hào)通路為一種復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，最常見(jiàn)于胚胎發(fā)育及惡性腫瘤，而即Wnt/β-catenin 是經(jīng)典的Wnt 信號(hào)通路，可激活核內(nèi)靶基因的表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，miRNA-214 在CRC 轉(zhuǎn)移和CRC 無(wú)轉(zhuǎn)移患者組織中的表達(dá)量分別為（1.23±0.34）和（2.05±1.19），低于在結(jié)直腸切緣無(wú)瘤黏膜組織中的表達(dá)量；miRNA-214 在CRC SW1116 和SW480 細(xì)胞株中的表達(dá)量均低于在正常細(xì)胞株中的表達(dá)量（P ＜0.05）。用miRNA-214模擬物轉(zhuǎn)染SW1116 和SW480 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，在SW1116 和SW480細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，miRNA-214 高表達(dá)抑制了HOXB7 的表達(dá)，降低了HOXB7 mRNA 和蛋白水平。研究結(jié)果提示，在大腸癌細(xì)胞系中，HOXB7 是miRNA-214 的靶基因，兩者之間的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.394，P＜0.01），miRNA-214 低水平表達(dá)激活HOXB7 基因，并促進(jìn)CRC 細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，而miRNA-214 高表達(dá)會(huì)抑制HOXB7 基因，進(jìn)而抑制CRC 細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。HOXB7敲除可以達(dá)到模擬miRNA-214 高表達(dá)的效果，沉默HOXB7 顯示，miRNA-214 高表達(dá)會(huì)抑制CRC 細(xì)胞侵襲和遷移。而且HOXB7 在CRC 無(wú)轉(zhuǎn)移和CRC 轉(zhuǎn)移患者呈現(xiàn)高表達(dá)水平，在SW1116 和SW480 細(xì)胞株中也呈高表達(dá)水平，CRC 發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者血清中HOXB7 的濃度高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，表明HOXB7基因與CRC 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。HOXB7 基因表達(dá)上調(diào)，既提高了CRC 細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，又激活免疫系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，提示HOXB7 基因可能是腫瘤細(xì)胞激活和利用自身免疫系統(tǒng)的重要樞紐。實(shí)驗(yàn)研究采用免疫熒光染色技術(shù)，檢測(cè)CRC SW1116 細(xì)胞中HOXB7 過(guò)表達(dá)后的Wnt/β-catenin 表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HOXB7 過(guò)表達(dá)后，Wnt/β-catenin 表達(dá)也增高；當(dāng)加入miRNA-214 干 擾HOXB7 后，Wnt/β-catenin表達(dá)明顯下降，提示HOXB7 通過(guò)Wnt/β-catenin 通路發(fā)生作用。

因此，本研究認(rèn)為miRNA-214 就是一個(gè)新的抑癌因子，miRNA-214 上調(diào)導(dǎo)致HOXB7 基因下調(diào)可能就是抑制CRC 細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵所在點(diǎn)，這提示miRNA-214—HOXB7—Wnt/β—catenin 通路可能作為未來(lái)潛在的CRC 抗癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移療法的新靶點(diǎn)。本項(xiàng)目從多個(gè)方面和多個(gè)層次研究miRNA-214 靶向HOXB7 基因調(diào)控Wnt/β-catenin 通路，闡明該通路參與抑制CRC 侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，這為早期輔助診斷CRC 提供了新的檢測(cè)手段。總結(jié)來(lái)看，本項(xiàng)目的創(chuàng)新點(diǎn)在于，首次提出miRNA-214靶向HOXB7 基因調(diào)控抑制CRC 細(xì)胞生長(zhǎng)、 侵襲、遷移的分子機(jī)制，首次提出miRNA-214 的表達(dá)調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路發(fā)揮抑制CRC 細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。本項(xiàng)目的研究一方面提示了miRNA-214—HOXB7—Wnt/β—catenin 通路可能作為未來(lái)潛在的CRC 抗癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移療法的新靶點(diǎn)，另一方面也可以作為臨床診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的新分子標(biāo)志物，這為CRC 診斷和治療提供了新的靶點(diǎn)。因此，本項(xiàng)目的研究具有較大的臨床價(jià)值和科學(xué)意義。