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    芽孢桿菌蛋白酶基因的比較基因組學(xué)分析

    2022-07-21 06:51:30賈仲昕趙佳男王承民秦建華
    廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年5期

    賈仲昕,趙佳男,季 芳,王 雪,李 剛,王承民,秦建華

    (1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000;2.廣東省科學(xué)院動物研究所/廣東省動物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省野生動物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510260)

    【研究意義】2020 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部全面禁止除中藥外一切促生長類藥物飼料添加劑的使用,標(biāo)志著我國畜牧生產(chǎn)和養(yǎng)殖業(yè)“無抗時代”的到來。而蛋白酶一方面可以提高動物對蛋白質(zhì)的消化并促進(jìn)對養(yǎng)分的吸收,另一方面還可以有效減少進(jìn)入后腸中的未消化蛋白數(shù)量,減少腸道菌群失衡的可能,從而保障動物腸道健康,因此蛋白酶成為抗生素促生長劑替代品的選擇之一[1-2]。目前市場上的飼用蛋白酶主要由芽孢桿菌產(chǎn)生,因此探究影響芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因顯得尤為重要。【前人研究進(jìn)展】芽孢桿菌產(chǎn)生的細(xì)胞外蛋白酶被認(rèn)為參與細(xì)菌對營養(yǎng)物質(zhì)的獲取過程。研究發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)可以產(chǎn)生至少8 種獨(dú)特的胞外或細(xì)胞壁相關(guān)蛋白酶[3],包括枯草桿菌蛋白酶AprE、中性金屬蛋白酶NprE、絲氨酸蛋白酶Epr 和Vpr、桿狀肽酶F(Bpr)、中性蛋白酶B(NprB)、細(xì)胞壁相關(guān)蛋白酶WprA 和金屬蛋白酶Mpr。Yang 等[4]研究表明,蛋白酶基因缺失的唯一表型效應(yīng)是蛋白酶活性的喪失。目前,芽孢桿菌蛋白酶基因的相關(guān)報(bào)道多集中于研究蛋白酶基因的調(diào)控機(jī)制以及高產(chǎn)蛋白酶突變株的誘導(dǎo)。Liu 等[5]發(fā)現(xiàn)degU和spo0A以及kinA的上調(diào)部分導(dǎo)致B.pumilus突變株SCU11 堿性蛋白酶的高產(chǎn)量。Zhou 等[6]研究發(fā)現(xiàn),在地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)中反應(yīng)調(diào)節(jié)因子Spo0A 可能直接參與aprE的轉(zhuǎn)錄與激活。Zolfaghari 等[7]通過點(diǎn)突變等系統(tǒng)生物學(xué)方法,使aprE基因的表達(dá)水平和枯草桿菌蛋白酶E(Subtilisin E)的穩(wěn)定性得到提高?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著測序技術(shù)的發(fā)展,細(xì)菌全基因組信息可以更加容易獲得。通過比較不同菌種的基因組信息并結(jié)合細(xì)菌的相關(guān)表型,可以深入分析造成細(xì)菌表型差異的重要基因[8]。此外,芽孢桿菌全基因組注釋信息的完善也為利用比較基因組學(xué)分析影響芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因提供了研究基礎(chǔ)。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究對15 株芽孢桿菌進(jìn)行全基因組測序,通過檢測15株芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶能力,利用比較基因組學(xué),挖掘影響芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因,分析芽孢桿菌基因組中胞外蛋白酶基因與產(chǎn)蛋白酶能力的關(guān)聯(lián)性,為產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的開發(fā)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    供試15 株菌株來源于廣東省科學(xué)院動物研究所,具體如下:

    枯草芽孢桿菌(B.subtiliis)N1282-4at、N1108-5at、N1303-2Ay,貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)C1,蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)N435-1,高地芽孢桿菌(B.altitudinis)N435-3,巨大芽孢桿菌(B.megaterium)N447-3、B1,假真菌樣芽孢桿菌(B.pseudomycoides)N451-2,海洋芽孢桿菌(B.oceanisediminis)N497-ZHONG,阿耶波多氏芽孢桿菌(B.aryabhattai)B2,副短短芽孢桿菌(Brevibacillus parabrevis)B3,芽孢桿菌(Bacillussp.)N470-1、N447-1、A1。

    培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[9-10]并稍作優(yōu)化。蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):酪蛋白10.00、KH2PO40.360、NaH2PO4·2H2O 0.360、MgSO4·7H2O 0.500、FeSO4·7H2O 0.002、CaCl2·2H2O 0.480、NaCl 5.00。篩選培養(yǎng)基配方(g/L):酪蛋白10.0、牛肉膏粉3.0、Na2HPO42.0、NaCl 5.0、瓊脂15.0、溴麝香草酚藍(lán)0.05。MHB培養(yǎng)基配方(g/L):酪蛋白水解物17.5、牛肉浸粉5.0、淀粉1.5。NA 培養(yǎng)基配方(g/L):蛋白胨10、牛肉膏粉3.0、NaCl 5.0、瓊脂17.0。

    1.2 芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力檢測

    1.2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩 取出保藏的細(xì)菌凍存液接種于NA 培養(yǎng)基上,35 ℃培養(yǎng)24 h,挑取單菌落接種至MHB 培養(yǎng)基中,32 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。將菌液梯度稀釋,吸取100 μL 涂布于酪蛋白瓊脂上,35 ℃培養(yǎng)48 h。用游標(biāo)卡尺測量水解圈直徑(H)和菌落直徑(C)并計(jì)算H與C 的比值H/C。

    1.2.2 蛋白酶活性測定 挑取初篩時酪蛋白瓊脂上的單菌落,接種至MHB 培養(yǎng)基中,32 ℃、160 r/ min 振蕩培養(yǎng)24 h 后,將菌液按2%(V/V)接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中,32 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h,調(diào)整菌液濃度OD600為0.500,9 000 r/min離心15 min,上清液即為粗酶液。蛋白酶活性測定參考GB/T 23527-2009福林酚法并做適當(dāng)修改。測定前先將粗酶液與酪蛋白溶液于40 ℃水浴預(yù)熱5 min。

    (1)試驗(yàn)組:取1 mL 粗酶液加 入1 mL 10 g/L 酪蛋白溶液,40 ℃水浴10 min。之后立即加入3 mL 0.4 mol/L 三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。靜置10 min 后12 000 r/min 離心10 min。吸取上清液1 mL,加入5.0 mL 0.4 mol/L 碳酸鈉溶液和1 mL福林試劑使用溶液,40 ℃水浴顯色20 min,用紫外分光光度計(jì)在680 nm 處測定樣品的OD680。

    (2)對照組:先加三氯乙酸使蛋白酶失活再加酪蛋白,其他操作同上。

    計(jì)算酶活性(X):

    式中,X 為樣品酶活性(U/mL),A 為由樣品測得的凈OD 值,查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得相對應(yīng)的酪氨酸含量,n 為酶液的稀釋倍數(shù),10 代表反應(yīng)10 min,5 代表5 mL 反應(yīng)液。

    酶活性定義:在40 ℃下,每分鐘內(nèi)酪蛋白被水解產(chǎn)生1 μg 酪氨酸為1 個蛋白酶活性單位(U/mL)。

    1.3 芽孢桿菌全基因組測序

    將15 株菌株送至北京百邁客生物科技有限公司,基于Nanopore 測序技術(shù)平臺進(jìn)行全基因組測序。試驗(yàn)流程[11-12]按照ONT 公司提供的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行,包括樣品質(zhì)量檢測、文庫構(gòu)建、文庫質(zhì)量檢測和文庫測序等流程。利用預(yù)測得到的基因序列與COG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr 等功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對,得到基因功能注釋結(jié)果。

    1.4 芽孢桿菌蛋白酶基因分析

    查找芽孢桿菌中主要報(bào)道的8 種特征化細(xì)胞外或細(xì)胞壁相關(guān)蛋白酶[13](AprE、NprE、Bpr、Epr、Vp、NprB、WprA、Mpr),以及從細(xì)菌全基因組數(shù)據(jù)注釋結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的絲氨酸蛋白酶(Serine protease,AprX[14-15])的相關(guān)基因數(shù)據(jù),包括菌株基本信息,蛋白酶基因的種類、數(shù)量和轉(zhuǎn)錄方向,蛋白酶基因間的相對距離等。利用IBS 線上作圖工具(http://ibs.biocuckoo.org)進(jìn)行 繪圖。從全基因組數(shù)據(jù)結(jié)果中獲取菌株的16S rDNA 序列,結(jié)合NCBI 數(shù)據(jù)庫中已有的數(shù)據(jù),利用MEGA X 軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.5 菌株蛋白酶基因的 mRNA 水平檢測

    按照菌株產(chǎn)蛋白酶的相關(guān)表型,選取菌株B.altitudinisN435-3、B.oceanisediminisN497-ZHONG、B.velezensisC1、B.subtiliisN1282-4at進(jìn)行蛋白酶基因的mRNA 水平檢測。根據(jù)細(xì)菌相應(yīng)蛋白酶基因序列,由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)與合成菌株引物(表1)。提取上述菌株在不同培養(yǎng)基(NB 培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基)條件下的總RNA,以總RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA 為模板進(jìn)行qPCR,16S rDNA為內(nèi)參基因。

    表1 菌株引物Table 1 Sequences of primers for strains

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Bacillus sp.A1 和B.velezensis C1 產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)

    在選取的15 株菌株中,有6 株菌株(Bacillussp.A1、B.velezensisC1、B.altitudinisN435-3、B.subtiliisN1282-4at、B.subtiliisN1108-5at、B.subtiliisN1303-2Ay)在接種培養(yǎng) 48 h,菌株透明圈直徑與菌落直徑的比值(H/C)顯著高于其他9 株菌株。Bacillussp.A1 和B.velezensisC1的H/C 值最高,其次為B.subtiliisN1282-4at、B.subtiliisN1108-5at、B.subtiliisN1303-2Ay 和B.altitudinisN435-3(圖1)。由于H/C 值在一定程度上反映了細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶能力[16],因此上述6株菌株的產(chǎn)蛋白酶能力相對較強(qiáng)。

    圖1 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩的H/C 值Fig.1 H/C value of primary screening of protease production strains

    由圖2 可知,15 株菌株中蛋白酶活性最高的2株菌株分別為Bacillussp.A1(31.40±0.40 U/mL)和B.velezensisC1(29.75±0.43 U/mL ),蛋白酶活性均達(dá)到 30 U/mL,顯著高于其他13 株菌株;其次為B.subtiliisN1282-4at、B.subtiliisN1108-5at、B.subtiliisN1303-2Ay 等3 株菌株,蛋白酶活性在7.40~8.57 U/mL 之間,三者差異不顯著;B.megateriumN447-3 和B.megateriumB1,蛋白酶活性僅為5 U/mL 左右 ;其他8 株菌株的蛋白酶活性均小于2 U/mL。菌株在不同培養(yǎng)基條件下酶活性不同,使用發(fā)酵培養(yǎng)基(底物酪蛋白為唯一氮源)后,15 株菌株的中性蛋白酶活性普遍有所提升,但菌株間蛋白酶活性的相對大小并未發(fā)生改變。

    圖2 菌株在不同培養(yǎng)基條件下的蛋白酶活性檢測結(jié)果Fig.2 Detection results of protease activity of strains under different medium conditions

    2.2 不同菌種攜帶不同的胞外蛋白酶相關(guān)基因組合

    通過對菌株全基因組上蛋白酶相關(guān)基因的篩查與統(tǒng)計(jì),芽孢桿菌屬細(xì)菌攜帶有8 種胞外蛋白酶相關(guān)基因,包括aprE、aprX、nprE、epr、vpr、nprB、wprA和mpr。對上述基因的種類、轉(zhuǎn)錄方向、序列長度和染色體組中相對位置進(jìn)行分析,可將其分為7 種基因型(G1~G7,圖3)。3 株B.subtiliis菌株N1282-4at、N1108-5at、N1303-2Ay 屬于G1 型,特點(diǎn)是染色體組上攜帶有上述8 種胞外蛋白酶基因。Bacillussp.A1、B.velezensisC1 屬于G2 型,染色體組上攜帶aprX、vpr、epr、mpr。B.altitudinisN435-3 屬于G3 型,相比G1 型缺少mpr、nprB和nprE。B.oceanisediminisN497-ZHONG 屬于G4 型,染色體組上攜帶aprX、vpr、nprB。B.megateriumN447-3、B.megateriumB1、B.aryabhattaiB2 屬于G5 型,染色體組上僅攜帶wprA、vpr,但同時存在2 個vpr。G6 型可分為3 個亞型G6.1、G6.2 和G6.3,其中B.cereusN435-1 屬于G6.1 型,菌株染色體組上攜帶vpr、nprB和mpr;BacillusN447-1屬于G6.2型,相比G6.1型缺少mpr;而BacillusN470-1 則屬于G6.3 型,染色體組上僅攜帶vpr。B.pseudomycoidesN451-2 屬于G7 型,染色體組上僅攜帶nprB。菌株Brevibacillus parabrevisB3 的染色體上則沒有攜帶上述8 種基因。

    圖3 芽孢桿菌屬菌株蛋白酶的基因型分類結(jié)果F ig.3 Genotype classification results of Protease in Bacillus strains

    通過與NCBI 數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有芽孢桿菌屬細(xì)菌的全基因組數(shù)據(jù)(截至2021 年11 月21 日)進(jìn)行比對,結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn),在NCBI 數(shù)據(jù)庫有173 株B.subtiliis具有全基因數(shù)據(jù),其中159 株符合G1型基因分布(91.9%,159/173);B.velezensis有97.6%(168/172)符合G2 型;B.altitudinis100%(22/22)符 合G3 型;沒 有B.oceanisediminis符合G4 型,考慮到NCBI 數(shù)據(jù)庫中僅有2 株B.oceanisediminis的全基因組數(shù)據(jù),因此存在較大偶然性;B.megaterium有87.5%(21/24)、B.aryabhattai有100%(2/2)符 合G5 型;而B.cereus中僅有10.1%(8/79)符合G6.1 型,更多的是88.9%(70/79)符合G6.2 型,B.toyonensis100%(7/7)符 合G6.3 型;B.pseudomycoides100%(2/2)符合G7 型。

    2.3 細(xì)菌蛋白酶基因分型與其進(jìn)化關(guān)系存在關(guān)聯(lián)

    繪制基于細(xì)菌16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4),15 株菌株(紅色)可分為Bacillus和Brevibacillus兩個屬,其中14 株屬于Bacillus,1 株屬于Brevibacillus。Bacillus屬可分為3 個分支,其中G1、G2、G3 型所屬菌株的親緣關(guān)系接近為一個分支(綠色),G4、G5 型所屬菌株的親緣關(guān)系接近為一個分支(黃色),G6、G7 型所屬菌株的親緣關(guān)系接近為一個分支(藍(lán)色)。B revibacillus parabreviB3 作為一個單獨(dú)的分支出現(xiàn),表明其與其他細(xì)菌物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過與細(xì)菌的蛋白酶基因分型(圖3)進(jìn)行比對可發(fā)現(xiàn),菌株與枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系越近,其染色體上攜帶的胞外蛋白酶基因種類越齊全。

    圖4 基于細(xì)菌16S rDNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strains

    2.4 芽孢桿菌蛋白酶基因分析

    結(jié)合菌株的基因型分型結(jié)果(圖3)與產(chǎn)蛋白酶能力檢測結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn),mpr、epr、vpr、nprB和wprA等5 個蛋白酶基因在產(chǎn)蛋白酶能力高和產(chǎn)酶能力低的菌株中均有攜帶情況。nprE基因僅有G1 型菌株攜帶,但其產(chǎn)酶能力低于不攜帶nprE的G2型。存在aprX和aprE的G1 型和G2 型菌株,其H/C 值和蛋白酶活性也均高于其他菌株,而也攜帶aprX和aprE的G3 型和攜帶aprX的G4 型菌株雖然其蛋白酶活性較低,但在酪蛋白瓊脂上的H/C 也是高于除G1 型和G2型菌株外的其他菌株。G1~G4 型菌株的共同特征是攜帶aprX或aprE基因,因此本研究將影響菌株產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因初步確定為aprE和aprX。

    2.5 不同菌種間蛋白酶基因aprX 表達(dá)差異顯著

    為了探究影響菌株產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因是否為aprX和aprE,本研 究檢測了B.velezensisC1、B.subtiliisN1282-4at、B.altitudinisN435-3、B.oceanisediminisN497-ZHONG在不同培養(yǎng)基(NB 培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基)條件下aprX、aprE的mRNA 水平。在N B 培養(yǎng)基(圖5A,以B.subtiliisN1282-4at 作為對照),B.velezensisC1 的aprXm RNA 相對水平顯著高于其他3 株菌株,為B.subtiliisN1282-4at 的2.7倍左右;B.altitudinisN435-3 則僅為N1282-4at 的60%;而B.oceanisediminisN497-ZHONG 則無表達(dá)或相比B.subtiliisN1282-4at 表達(dá)量過小。在發(fā) 酵培養(yǎng)基(圖5C),相比NB 培養(yǎng)基,B.velezensisC1 的aprXmRNA相對水平上升為B.subtiliisN1282-4at的3.6倍左右;B.altitudinisN435-3 也有所升高,為B.subtiliisN1282-4at 的80%;而B.oceanisediminisN497-ZHONG 仍無表達(dá)或相比B.subtiliisN1282-4at 表達(dá)量過小。由圖 5B、圖5D 可見,發(fā)酵 培養(yǎng)基中B.altitudinisN435-3 的aprE相對表達(dá)水平為B.subtiliisN1282-4at 的約1.2 倍,差異顯著,其余差異均不顯著。根據(jù) 結(jié)果推測,aprX是影響芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因。

    圖5 不同培養(yǎng)基菌株aprX 和aprE 的相對表達(dá)水平Fig.5 Relative expression levels of aprX and aprE under different medium conditions

    3 討論

    本研究通過對15 株菌株進(jìn)行全基因組測序,獲得了菌株的全基因組信息,并根據(jù)菌株染色體上攜帶的蛋白酶基因數(shù)量、種類、轉(zhuǎn)錄方向?qū)⑵浞譃? 種基因型,并進(jìn)行比較基因組學(xué)分析。在15 株菌株中僅有G1 型的B.subtiliis擁有最全的8種蛋白酶基因,其他菌株都缺乏多種蛋白酶基因。通過對NCBI 數(shù)據(jù)庫中已有菌株全基因組信息的比對,發(fā)現(xiàn)不同來源的相同菌種絕大多數(shù)歸為同一基因型,可以認(rèn)為在芽孢桿菌屬不同來源的相同菌種間,蛋白酶基因攜帶情況保守。

    有研究指出,枯草芽孢桿菌的主要胞外蛋白酶分別是aprE編碼的枯草桿菌蛋白酶和nprE編碼的中性金屬蛋白酶[17-18]。但本研究結(jié)果顯示,僅G3 型菌株B.altitudinisN435-3 的aprEmRNA水平在發(fā)酵培養(yǎng)基條件下是G1 型菌株B.subtiliisN1282-4at 的約1.2 倍,其他情況差異不顯著。而nprE僅G1 型菌株攜帶,但缺乏nprE的G2 型菌株的產(chǎn)蛋白酶能力高于G1 型菌株??赡苁且?yàn)镚1 型菌株的nprE表達(dá)水平過低使NprE 的活性沒有表現(xiàn)出來,同時aprE表達(dá)水平與G2 和G3 型細(xì)菌處于同一水平,而G2 型的aprX表達(dá)水平卻顯著高于G1 型菌株所致。

    芽孢桿菌屬菌株通常在指數(shù)生長期后期開始大量產(chǎn)生胞外蛋白酶,這使得細(xì)菌可以高效利用外界的營養(yǎng)物質(zhì),從而確保其正常的生長發(fā)育[19]??刂蒲挎邨U菌胞外蛋白酶表達(dá)的調(diào)節(jié)途徑非常復(fù)雜,如AbrB、SinR 和ScoC 等調(diào)節(jié)因子可以抑制芽孢桿菌蛋白酶基因的表達(dá),但Spo0A 可以抑制AbrB 和SinR 的活性從而促進(jìn)蛋白酶的產(chǎn)生[19]。此外,aprE和nprE還受到全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CodY 的強(qiáng)大且直接的負(fù)反饋調(diào)節(jié),但由于CodY同時也抑制ScoC[20],因此CodY 除了是aprE和nprE的直接負(fù)調(diào)節(jié)因子外,還通過抑制scoC的高水平表達(dá)充當(dāng)相同基因的間接正調(diào)節(jié)因子。由于CodY 和ScoC 都是aprE和nprE的強(qiáng)阻遏物,并且CodY 會在含有過量氨基酸的培養(yǎng)基中具有活性,但隨著氨基酸耗盡會失去活性[21]。考慮到G1 型和G2 型菌株的進(jìn)化關(guān)系接近,這或許可以解釋為何G1 型細(xì)菌的產(chǎn)蛋白酶能力低于G2型細(xì)菌。本研究在細(xì)菌生長的后期階段檢測了細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶的能力和基因的表達(dá),而此時營養(yǎng)物質(zhì)的消耗導(dǎo)致CodY 的部分失活,從而減輕了對ScoC 的抑制,使ScoC 水平升高,持續(xù)抑制aprE和nprE的表達(dá)。因此結(jié)合熒光定量PCR 結(jié)果,aprE和nprE由于CodY 的失活導(dǎo)致對ScoC 抑制的減弱,從而受到ScoC 的強(qiáng)抑制,使細(xì)菌aprE和nprE的mRNA 水平降低。因此除aprE和nprE外,aprX是影響芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)胞外蛋白酶能力的又一重要基因。

    蛋白酶是一種誘導(dǎo)酶,其在細(xì)菌內(nèi)部的生物合成受到多種因素誘導(dǎo)(如蛋白酶底物和底物類似物),同時也會受到細(xì)菌生存環(huán)境中易利用氮源(如氨基酸和銨鹽等)的阻遏[22-23]。因此,當(dāng)外界環(huán)境中存在大量營養(yǎng)物質(zhì)時,細(xì)菌只會產(chǎn)生少量蛋白酶來維持必要的生理活動,只有在外界環(huán)境缺乏易利用氮源時,細(xì)菌才會大量產(chǎn)生蛋白酶,去獲取環(huán)境中其他難利用的大分子蛋白質(zhì)。這也解釋了為何細(xì)菌在發(fā)酵培養(yǎng)基(唯一氮源為酪蛋白)條件下aprX和aprE的表達(dá)水平比在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基條件下高。

    4 結(jié)論

    本研究對15 株芽孢桿菌進(jìn)行全基因組測序獲得了菌株的全基因組信息,并根據(jù)菌株攜帶的蛋白酶基因情況進(jìn)行了基因分型,通過對NCBI數(shù)據(jù)庫中已有菌株全基因組信息的比對,發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌不同來源的相同菌種間蛋白酶基因攜帶情況保守。通過構(gòu)建進(jìn)化樹并與基因分型結(jié)果進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬菌株與枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系越近,攜帶的胞外蛋白酶基因種類越齊全。通過對15 株芽孢桿菌進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶能力檢測,并進(jìn)行比較基因組學(xué)分析和qRT-PCR 驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)aprX是影響芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因。

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