橡膠樹白粉病PMA-qPCR 檢測體系及應(yīng)用

官 鑫，涂 敏，蔡海濱，王云月，曾 霞，胡彥師

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，海南 海口 571101；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

【研究意義】白粉病是橡膠樹生產(chǎn)上最重要的葉部病害，其病原菌鑒定為Erysiphe quercicola［1-2］，為專性寄生菌。該病自1918 年在印尼瓜哇被發(fā)現(xiàn)，目前已遍及亞非各國植膠園，主要為害橡膠樹嫩葉（古銅期及變色期葉片）、嫩芽、嫩梢和花序，條件適合時(shí)其分生孢子可全年重復(fù)侵染，降低橡膠樹光合作用，導(dǎo)致橡膠樹生長遲緩、膠乳產(chǎn)量降低，最高可造成橡膠樹減產(chǎn)45%［3-4］。因此，通過對(duì)橡膠樹葉片上白粉病菌活菌量的快速檢測，能及時(shí)開展橡膠樹白粉病預(yù)測預(yù)報(bào)及防控，將其對(duì)生產(chǎn)的損失降至最低?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】qPCR 是利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR 進(jìn)程中每個(gè)反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法［5］。qPCR 技術(shù)能夠定量檢測病菌［6-7］，但不能區(qū)分病菌的死活，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。研究表明，細(xì)胞死亡后DNA 仍然能夠保留數(shù)天時(shí)間。PMA 是一種光敏感、與DNA 高親和力結(jié)合的染料，其光解后能穿過死菌的細(xì)胞膜與死菌DNA結(jié)合形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，從而抑制死菌DNA 擴(kuò)增?；罹蚱渚哂型暾募?xì)胞膜，可將PMA 排除在細(xì)胞膜外［8］。因此，利用PMA 對(duì)死活細(xì)胞的選擇性，結(jié)合qPCR 技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量檢測活菌的目的。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌［9-10］、醫(yī)學(xué)病原微生物［11］、水環(huán)境病原微生物［12］等，對(duì)植物病原菌檢測也有越來越多的報(bào)道，已在玉米細(xì)菌性枯萎病菌（Pantoea stewartiisubsp.stewartii）［13］、西瓜細(xì)菌性果斑病菌（Acidovorax citruui）［14］、青枯菌（Ralstonia solanacearum）［15-17］、獼猴桃潰瘍病菌（Pseudomonas syringaepv.actinidiae）［18］、黃瓜白粉病菌（Podosphaera xanthii）［19］、梨火疫病菌（Erwinia amylovora）［20］、十字花科黑斑病菌（Pseudomonas syringaepv.maculicola）［21］等建立了活菌PMA-qPCR 定量的檢測方法?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鑒于目前PMA-qPCR 技術(shù)在橡膠樹白粉病活菌檢測方面尚無研究報(bào)道，根據(jù)橡膠樹白粉菌的ITS 保守區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物，構(gòu)建PMA-qPCR 分子檢測體系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬建立PMA-qPCR 對(duì)橡膠樹白粉病活菌的快速檢測體系，為該病害預(yù)測預(yù)報(bào)及防控提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

橡膠白粉菌（Erysiphe quercicola）、橡膠靈芝菌（Ganoderma pseudoferreum）和禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）已純化3 代以上，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所種質(zhì)資源課題組分離保存；大腸桿菌（Escherichia coli）菌株由該所陽江華老師贈(zèng)予。白粉菌接種材料為橡膠樹無性系熱研73397 古銅期組培苗。試驗(yàn)于2021 年6 月至2022 年2 月在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所進(jìn)行。

1.2 活/死分生孢子懸浮液制備

從接種顯癥的熱研73397 橡膠樹白粉病病葉上刮取約1 g 白色粉狀物，置于裝有30 mL ddH2O的50 mL 離心管中，渦旋振蕩，搖勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制備濃度為1×105個(gè)/mL 的新鮮活孢子懸浮液。取15 mL 孢子懸浮液于新的離心管，100 ℃水浴30 min，獲得滅活孢子懸浮液。

1.3 引物設(shè)計(jì)及特異性檢測

用Primer Premier 5.0 軟件根據(jù)本課題組鑒定的橡膠白粉菌的rDNA-ITS 保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，其序列為Eq-F：5’ TGCCTGTTCGAGCGTCAT 3’；Eq-R：5’ GCAAGTGGGTTGTTCTGG 3’，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為177 bp。引物由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。以橡膠白粉菌、橡膠靈芝菌和禾谷鐮刀菌及大腸桿菌所提取的總DNA 作為模板，以雙蒸水作為空白對(duì)照，驗(yàn)證引物對(duì)Eq-F/Eq-R對(duì)橡膠白粉菌qPCR 擴(kuò)增的特異性。qPCR 反應(yīng)體系與程序參考謝學(xué)文等［22］的方法。

1.4 重組質(zhì)粒制備

以提取的橡膠白粉病菌DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參考謝學(xué)文等［22］的方法，其中反應(yīng)程序中退火溫度為60 ℃。對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后與pMD19-T 于16 ℃連接，轉(zhuǎn)至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取白色單克隆，轉(zhuǎn)于含有Amp 的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃下200 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。通過PCR驗(yàn)證和測序〔鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司〕檢測插入目的片段的正確性。將測序正確的菌液提取重組質(zhì)粒，超微量分光光度計(jì)測定質(zhì)粒DNA濃度和純度，根據(jù)摩爾定律，計(jì)算單位體積質(zhì)粒所含的DNA 拷貝數(shù)濃度，質(zhì)?？截悢?shù)=〔質(zhì)粒濃度（ng/μL）×6.02×1023］/〔（載體長度bp+片段長度bp）×660 g/mol〕。

1.5 qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及重復(fù)性檢驗(yàn)

將定量后的高拷貝數(shù)重組質(zhì)粒按10 倍梯度稀釋為3.0×109、3.0×108、3.0×107、3.0×106、3.0×105、3.0×104、3.0×103、3.0×102、3.0×101copies/μL，在實(shí)時(shí)熒 光定量儀上進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系參照1.3，重復(fù)3 次。反應(yīng)結(jié)束后獲得線性和可靠的標(biāo)準(zhǔn)曲線（相關(guān)系 數(shù)R2＞0.99）。選 擇3.0×102、3.0×104、3.0×106copies/μL 的質(zhì)粒進(jìn)行組間和組內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)5 次，以確定qPCR 過程中標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。

1.6 PMA-qPCR 對(duì)活/死分生孢子懸浮液檢測

將1.2 中的活/死分生孢子懸浮液按表1 的成分加入1.5 mL 滅菌的離心管中混合，用鋁箔紙將各樣品離心管管蓋以下部分包起來以避光，分別加入20 μL PMA 工作液，使其終濃度為20 μg/mL，置于避光搖床中振蕩孵育5 min（150 r/min）。之后置于冰上，在距離樣品15 cm 處利用100 W藍(lán)光燈照射15 min，期間不斷轉(zhuǎn)動(dòng)離心管使其均勻照射。光照結(jié)束后于離心機(jī)10 000 r/min 離心10 min，棄上清液，采用真菌DNA 提取試劑盒提取DNA。以未加PMA 處理的樣品為對(duì)照，參照1.3反應(yīng)體系對(duì)樣品進(jìn)行檢測 。

表1 活/死分生孢子懸浮液配 比Table 1 Compounding ratio of live and dead conidia suspensions

1.7 PMA-qPCR 靈敏度檢測

將1.2 定量后的活孢子懸浮液按10 倍梯度稀釋為1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100個(gè)/mL，按1.6 中PMA 處理后，提取DNA。使用特異引物Eq-F/Eq-R 進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系參照1.3，獲取檢測樣品Ct值，對(duì)PMA-qPCR 靈敏度進(jìn)行分析。

1.8 PMA-qPCR 檢測丙環(huán)唑處理后活菌變化

選取10 株古銅期橡膠樹熱研73397 芽接苗接種白粉病菌，待植株發(fā)病后，使用40 mg/L丙環(huán)唑噴施病葉，采集噴施后0、15、30、60、90、120 min 6 個(gè)時(shí)期的葉片，每個(gè)時(shí)期3 次重復(fù)。隨后將樣品用液氮研磨成粉末，分別迅速稱取2 管100 mg 粉末于1.5 mL 滅菌離心管中，一管直接提取基因組DNA，另一管內(nèi)加入1 mL 滅菌的PBS，振蕩15 s。用鋁箔紙將各樣品離心管管蓋以下部分包裹避光，按1.6 中PMA 處理后提取DNA。以未加PMA 處理的樣品為對(duì)照，參照1.3反應(yīng)體系對(duì)樣品進(jìn)行檢測。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010 記錄，利用IBM SPSS Statistics 進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)分析差異顯著性，采用OriginPro 2021 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性驗(yàn)證

利用設(shè)計(jì)的引物Eq-F/Eq-R 對(duì)橡膠白粉菌、橡膠靈芝菌、禾谷鐮刀菌及大腸桿菌的DNA 進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，結(jié)果表明橡膠白粉菌擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)（Ct值）為20.57，而其他菌株及空白對(duì)照均無擴(kuò)增曲線（圖1A）；反應(yīng)產(chǎn)物熔解曲線顯示，當(dāng)Tm值在87.50 ℃時(shí)呈單一熔解峰，無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增（圖1B），表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物能區(qū)分橡膠白粉菌和其他病原菌，特異性良好，能夠用于后續(xù)PMA-qPCR 方法的建立。

圖1 引物Eq-F/Eq-R 對(duì)橡膠白粉菌的qPCR 特異性擴(kuò)增曲線（A）和熔解曲線（B）Fig.1 qPCR specific amplification curve (A) and melting curve (B) of primer Eq-F/Eq-R against powdery mildew of rubber tree

2.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

從白粉病菌基因組DNA 擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物片段大小為177 bp（圖2）。測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pMD-19T-Eq 構(gòu)建成功。提取的重組質(zhì)粒濃度為94.6 ng/μL，根據(jù)1.4 中公式計(jì)算的拷貝數(shù)約為3.0×1010copies/μL。通過梯度PCR 確定最佳退火溫度為60 ℃。以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10 倍梯度稀釋拷貝濃度 為3.0×101～3.0×108copies/μL，根 據(jù)qPCR 檢測擴(kuò)增結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)數(shù)Ct值與質(zhì)粒DNA 拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值之間有良好的線性關(guān)系：Y=-3.1415×logX+35.398，相關(guān)系數(shù)R2=0.9981，擴(kuò)增效率Eff=107.97%。式中，Y為Ct值，X為基因拷貝濃度。

圖2 橡膠白粉菌ITS 保守區(qū)PCR 擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of ITS conserved region of Erysiphe quercicola

圖3 橡膠白粉菌標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of Erysiphe quercicola

2.3 qPCR 重復(fù)性檢測

選 擇3×102、3×104、3×106copies/μL 3 個(gè)梯度的質(zhì)粒進(jìn)行組間和組內(nèi)的重復(fù)試驗(yàn)，以確定qPCR 過程中標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。結(jié)果（表2）顯示，組內(nèi)變異系數(shù)為0.35%～0.58%，組間變異系數(shù)為0.97%～1.45%，表明qPCR 的重復(fù)性良好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

表2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的組間和組內(nèi)變異Table 2 Variations between and within groups of standard plasmids

2.4 PMA-qPCR 對(duì)活/死分生孢子懸浮液的檢測

以qPCR 為對(duì)照，對(duì)不同比例的活/死分生孢子懸浮液進(jìn)行PMA-qPCR 檢測，驗(yàn)證該體系對(duì)混合樣品擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。結(jié)果（圖4）顯示，當(dāng)懸浮液全部為死孢子時(shí)，qPCR 的Ct值為24.50，而PMA-qPCR 的Ct值為31.91，差異顯著。當(dāng)懸浮液活孢子比例為25%、50%、75%時(shí)，隨著活孢子懸浮液比例的增加，PMA-qPCR 的Ct值逐漸減小，分別為29.00、26.92 和26.00；而qPCR的Ct值無明顯變化，分別為24.65、24.16 和23.36，且qPCR 樣品檢測的Ct值均小于PMAqPCR。當(dāng)樣品懸浮液中活孢子比例達(dá)到100%時(shí)，PMA-qPCR 的Ct值與qPCR 的Ct值無顯著差異，說明加入PMA 對(duì)活孢子的擴(kuò)增幾乎無影響。同時(shí)，懸浮液中隨著活孢子比例的增大，PMAqPCR 的Ct值相應(yīng)減少，說明死孢子DNA 被PMA 抑制不能擴(kuò)增，從而降低了qPCR 檢測中由于懸浮液死孢子擴(kuò)增造成的假陽性。

圖4 不同比例活/死孢子懸浮液qPCR 與PMA-qPCR 結(jié)果F ig.4 PMA-qPCR results of different proportions of live/dead spore suspensions

2.5 PMA-qPCR 靈敏度檢測

將 活孢子懸浮液1×105個(gè)/mL 按10 倍濃度梯度進(jìn)行稀釋，經(jīng)PMA 處理后提取DNA 進(jìn)行PMA-qPCR 反應(yīng)。隨著稀釋倍數(shù)增加，反應(yīng)體系中活孢子數(shù)量減少，Ct值上升。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到定量結(jié)果見表3，PMA-qPCR 最低可檢測拷貝數(shù)為4.77×102copies/μL。

表3 不同稀釋梯度活孢子懸浮液的PMA-qPCR 結(jié)果T able 3 PMA-qPCR results of live spore suspensions with different dilution gradients

2.6 PMA-qPCR 檢測丙環(huán)唑處理后活菌比例

橡膠葉片噴施丙環(huán)唑后，白粉菌活菌比例隨著處理時(shí)間的延長整體呈減少趨勢（圖5）。其中，處理后15 min，活菌比例從66.13%下降至23.18%（P＜0.05）；處理后90 min，活菌比例下降至17.43%（P＜0.05）；處理后105 min 活菌比例為13.97%（P＜0.05）。表明PMA-qPCR 能準(zhǔn)確定量檢測出經(jīng)丙環(huán)唑處理后橡膠樹白粉病病葉中的活菌數(shù)。

圖5 丙環(huán)唑處理后橡膠樹白粉病病葉活菌比例F ig.5 Proportion of live bacteria in powdery mildew of rubber tree leaves treated with propiconazole

3 討論

自Nogva 等［23］發(fā)現(xiàn)疊氮溴化乙錠（Ethidium monoazide，EMA）能與PCR 技術(shù)結(jié)合區(qū)分活細(xì)菌與死細(xì)菌以來，該方法已在細(xì)菌［24］、病毒［25］等病原微生物中得到應(yīng)用。但EMA 會(huì)部分滲透入活細(xì)胞中，造成活菌中基因組DNA 的損失［26-27］。研究發(fā)現(xiàn)PMA 能彌補(bǔ)EMA 的這一不足，提高檢測的準(zhǔn)確性。目前PMA-qPCR 技術(shù)在定量檢測植物病原細(xì)菌中應(yīng)用較為廣泛［28-29］，而在植物病原真菌中的應(yīng)用較少［30］。本研究首次報(bào)道了橡膠樹白粉病PMA-qPCR 檢測體系的建立及其應(yīng)用。

本研究利用PMA-qPCR 方法對(duì)不同活/死孢子懸浮液比例的檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品全部為死孢子懸浮液時(shí)，也會(huì)有少量擴(kuò)增，Tian 等［31］、Elizaquível 等［32］在對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌和食源性細(xì)菌檢測中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。研究認(rèn)為，若樣品中活菌和死菌比例過低時(shí)，PMA-qPCR 檢測會(huì)比實(shí)際樣品中的活菌數(shù)高。前人研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段長度越大，對(duì)死菌DNA 擴(kuò)增的抑制效果越好［33］，但靶基因片段過長會(huì)減弱擴(kuò)增的熒光信號(hào)，通常qPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的大小在50～200 bp 時(shí)有較高的擴(kuò)增效率［34］。本研究設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增長度為177 bp，對(duì)目標(biāo)菌特異性檢測良好，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的線性關(guān)系，但當(dāng)樣品均為死孢子懸浮液時(shí)仍有一定擴(kuò)增量，可能與本試驗(yàn)中死孢子懸浮液是通過加熱致死獲得、導(dǎo)致其細(xì)胞膜未能完全損傷有關(guān)，造成了PMA 與死孢子懸浮液DNA 沒有充分結(jié)合，從而影響最終的擴(kuò)增效果，該推測還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

橡 膠樹白粉病分子檢測方法較少，目前主要有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［35］和巢式PCR 技術(shù)［36］兩種。本研究建立的PMA-qPCR 體系對(duì)活孢子懸浮液檢測靈敏度為4.77×102copies/μL，對(duì)橡膠樹白粉病早期診斷具有重要作用。目前研究橡膠樹白粉病的生物和化學(xué)防治效果主要采用孢子萌發(fā)試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)。如黃有航等［37］采用上述兩種方法得出枯草芽胞桿菌S43 對(duì)橡膠樹白粉病的防效為86.12%；羅嬋娟等［38］利用盆栽實(shí)驗(yàn)測定苯并噻二唑（BTH）對(duì)橡膠樹白粉病的防效為57.8%。但上述兩種方法均無法檢測處理后橡膠樹白粉病活菌數(shù)。而本研究建立的PMA-qPCR 體系能快速定量檢測出橡膠樹白粉病活菌數(shù)。在丙環(huán)唑處理15 min 后活菌比例由66.13%下降至23.18%，較處理前有顯著下降，表明本體系可以應(yīng)用到橡膠樹白粉病防治效果檢測中。

4 結(jié)論

本研究建立的橡膠樹白粉病PMA-qPCR 體系，具有重復(fù)性好和靈敏度高的特點(diǎn)，能快速、準(zhǔn)確地檢測樣品中分生孢子懸浮液活菌量，彌補(bǔ)了常規(guī)分子檢測方法不能區(qū)分病原菌死活狀態(tài)的不足。該體系還能在丙環(huán)唑處理橡膠樹白粉病病葉15 min 后，快速定量檢測到橡膠樹白粉病病葉中的活菌比例較未處理前顯著下降，可及時(shí)有效地檢測藥劑對(duì)橡膠樹白粉病的防效。該P(yáng)MAqPCR 體系的建立為橡膠樹白粉病的早期預(yù)測預(yù)報(bào)和防效檢測提供了精確的技術(shù)手段。