一步法RT-LAMP-HNB 檢測蘭花建蘭花葉病毒和齒舌蘭環(huán)斑病毒方法的建立

徐 匆，黃 皓，羅華建，杜見南，黃曉彥，陳 彥，梁衛(wèi)驅(qū)，胡 珊

（東莞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心，廣東 東莞 523086）

【研究意義】蘭科（Orchidaceae）植物是開花植物中最大的家族之一，擁有800 多個(gè)屬28 000 余種，廣泛分布于各種生態(tài)環(huán)境，并表現(xiàn)有高度特異的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理特點(diǎn)［1-3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界蘭花病毒有50 余種，建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）是從蘭花上分離到的分布最廣、危害最嚴(yán)重的病毒之一，能引起蘭科植物植株花葉畸形、壞死，花瓣變色，生長受抑等癥狀，傳播途徑主要有汁液、桃蚜和接觸等［4-7］。CymMV 為馬鈴薯X 病毒屬（Potexvirus），單鏈RAN 病毒，基因組序列約6 200 nt，含5 個(gè)開放閱讀框［8］。齒舌蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）同樣為蘭花中最為普遍的病毒之一［4-5］，屬于煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），單鏈RNA 病毒，基因組全序列約5 800 nt［9］。該病毒會導(dǎo)致蘭花葉片產(chǎn)生環(huán)斑、花朵色素不均、局部壞死、大大降低植物活力等［10］。通過組織培養(yǎng)繁殖進(jìn)行大規(guī)模栽培早已成為蘭花產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)趨勢，而通過組織培養(yǎng)感染病毒的傳播方式成為了蘭花產(chǎn)業(yè)的主要威脅［11-12］。然而，目前沒有有效的措施能夠控制病毒病，因此，建立針對病毒的高效監(jiān)測、檢測方法，盡早檢出染病植株并實(shí)施銷毀，對控制蘭花病毒感染具有至關(guān)重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前已有的研究中，針對蘭花病毒檢測方法包括生物學(xué)檢測［13］、電鏡觀察法［14-15］、血清學(xué)檢測［16-17］和分子生物學(xué)檢測［8,18-21］4 類。生物學(xué)檢測法雖然操作簡單，但病毒病癥狀多樣，操作環(huán)境嚴(yán)格，固有周期長，目前大多作為輔助手段；電鏡檢測取樣簡單，所需時(shí)間短，但對操作人員要求高，所用儀器昂貴；血清學(xué)檢測法特異性強(qiáng)、需時(shí)短，但易出現(xiàn)假陽性、靈敏度不高等缺點(diǎn)；分子生物學(xué)檢測法檢測病毒核酸驗(yàn)證病毒是否存在。Raymond 等［22］用多重RT-PCR 對CymMV、ORSV、Orchid fleck virus（OFV）進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示其靈敏度高于電鏡檢測；樊榮輝等［23］則利用SYBR Green I 作為指示劑，建立RT-LAMP 方法來進(jìn)行CymMV 的檢測，其靈敏度為RT-PCR的10 倍。【本研究切入點(diǎn)】分子生物學(xué)方法的靈敏度和特異性比其他方法更高,操作簡便,適應(yīng)性強(qiáng)，有可能成為新的常規(guī)檢測手段。分子生物學(xué)檢測最常見的是RT-PCR 以及在此基礎(chǔ)上發(fā)展出的一些技術(shù)如IC-RT-PCR、多重RT-PCR、熒光定量RT-PCR 等等，雖然PCR 具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但需要特定儀器，不利于在基層或不便利地區(qū)推廣使用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬采取可視化反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）結(jié)合羥基萘酚藍(lán)（HNB）建立CymMV 和ORSV 的一步法RT-LAMP-HNB 檢測方法。該方法中涉及的核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種僅用水浴鍋就能夠完成的檢測技術(shù)，在LAMP 反應(yīng)體系中加入HNB 作為產(chǎn)物指示劑，既能夠滿足肉眼判讀結(jié)果的要求，又能夠避免開蓋檢測引起氣溶膠污染出現(xiàn)的假陽性，更適合在實(shí)際檢測中應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病毒為蘭花建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）、齒舌蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）來源于東莞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心蘭花大棚及美國Agdia 公司。

RNA 提取試劑 盒（SteadyPure Virus DNA/RNA Extraction Kit）、一步法RT-PCR 試劑盒、核酸染料GoldView 購自艾科瑞生物工程有限公司，WarmStart ?LAMP 試劑盒（DNA＆RNA）購自基因工程有限公司。

核酸蛋白分析儀DU800 購自美國貝克曼公司，凝膠成像系統(tǒng)Biospectrum AC 410 購自美國UVP 公司，電泳儀DYY-12 購自北京六一生物有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

從NCBI下載CymMV、ORSVcp基因序列，利用ClustalX 比對后，選取保守序列使用PrimerExplorer V5設(shè)計(jì)LAMP 簡并引物，通 過Primer Primer5.0 設(shè)計(jì)RT-PCR 簡并引物，引物序列如表1 所示。

表1 RT-LAMP-HNB 及RT-PCR 引物序列Table 1 RT-LAMP and RT-PCR primer sequences

RT-LAMP-HNB 反應(yīng)體系：反應(yīng)混合物（Warmstart Lamp Kit，NEB，USA）12.5 μL，外引物（F3/B3）2.5 μL（終濃度 0.2 μmol/L），內(nèi)引物（FIP/BIP）2.5 μL（終濃度1.6 μmol/L），HNB（FLUKA，終濃度 200 μmol/L）［24］0.25 μL，模板1 μL，補(bǔ)充 H2O 至終體積 25 μL?；靹蚝蠹尤?0 μL 石蠟油，60 ℃ 反應(yīng)1 h，85 ℃ 5 min 終止反應(yīng)。

以表1 所列CymMV F1/B1、ORSV F3/B3 為RTPCR 引物，使用一步法RT-PCR 試劑盒（艾瑞科生物有限公司），擴(kuò)增目的片段，CymMV 目的片段大小為575 bp，ORSV 目的片段大小為190 bp。

RT-PCR 體系：酶2 μL，緩沖液 12.5 μL，引物 5 μL（終濃度 0.4 μmol/L），1 μL 模板 DNA/RNA，補(bǔ)充 H2O 至終體積 25 μL。擴(kuò)增條件為94 ℃ 30 sec，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。

1.3 檢測項(xiàng)目及方法

1.3.1 RT-LAMP-HNB 特異性及靈敏性檢測 用CymMV、ORSV RT-LAMP 引物分別擴(kuò)增CymMV 和ORSV，驗(yàn)證RT-LAMP-HNB 檢測方法的特異性。

將提取的CymMV RNA、ORSV RNA進(jìn)行100、101、102、103、104、105、106、107梯度稀釋，以此為模板進(jìn)行RT-LAMP-HNB 反應(yīng)，然后根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果去判斷該反應(yīng)的靈敏性。

1.3.2 田間樣品檢測 針對市場購買的20 株蝴蝶蘭進(jìn)行CymMV、ORSV 的RT-LAMP-HNB 及RT-PCR 檢測，檢測方法見1.2。

1.3.3 產(chǎn)物檢測 RT-LAMP、RT-PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，以GoldView（艾瑞科生物有限公司）為核酸染料。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-LAMP-HNB 檢測方法的建立

抽提已知感染了CymMV、ORSV 的蘭花樣品 RNA，并以此RNA 為樣品模板，純水為陰性對照，使用表1 所列RT-LAMP 引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，結(jié)果見圖1，產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳（圖1 上部分）后出現(xiàn)明顯梯形條帶；圖1 下部分顯示，RT-LAMP-HNB 擴(kuò)增體系呈藍(lán)色，陰性對照呈紫紅色，說明RT-LAMP-HNB 檢測方法建立成功。

圖1 RT-LAMP-HNB 法檢測結(jié)果Fig.1 Results of RT-LAMP-HNB detection

2.2 RT-LAMP-HNB 特異性檢測

使用CymMV、ORSV LAMP 引物對已知分別含 有CymMV、ORSV 及CMV 的RNA進(jìn)行RTLAMP 擴(kuò)增，以檢測該方法的特異性，結(jié)果見圖2，凝膠電泳結(jié)果顯示CymMV 引物僅能夠擴(kuò)增出CymMV 的RNA片段，而ORSV、CMV都未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶；RT-LAMP-HNB 結(jié)果也顯示針對ORSV、CMV 的擴(kuò)增體系顏色為紫紅色，CymMV擴(kuò)增體系為藍(lán)色。ORSV cp 引物僅能夠擴(kuò)增出ORSV 的RNA 片段，CymMV、CMV 未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，RT-LAMP-HNB 結(jié)果也顯示僅ORSV RNA樣品的檢測結(jié)果為陽性。上述結(jié)果說明CymMV、ORSV 的RT-LAMP-HNB 檢測方法均具特異性。

圖2 RT-LAMP-HNB 特異性檢測結(jié)果Fig.2 Results of RT-LAMP-HNB specificity assays

2.3 RT-LAMP-HNB 靈敏性檢測

對CymMV、ORSV 的RT-LAMP-HNB進(jìn)行靈敏性檢測，并與RT-PCR 進(jìn)行比較。提取已知感染CymMV、ORSV 的蘭花樣品RNA，將RNA按 照100、101、102、103、104、105、106、107梯度稀釋，以稀釋后的RNA 為擴(kuò)增模板，RT-PCR擴(kuò)增片段預(yù)計(jì)分別為575、190 bp，結(jié)果見圖3。兩種病毒的RT-PCR 擴(kuò)增條帶在RNA 模板稀釋103倍時(shí)可見，至104倍不可見；RT-LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示在RNA 模板稀釋104倍時(shí)仍有明顯擴(kuò)增條帶；RT-LAMP-HNB 體系在100～104倍稀釋時(shí)都呈藍(lán)色，表示有擴(kuò)增產(chǎn)物，與RT-LAMP 凝膠電泳結(jié)果保持一致，靈敏性同樣比RT-PCR 高10 倍。

圖3 RT-LAMP-HNB 及RT-PCR 靈敏性檢測結(jié)果Fig.3 Results of RT-LAMP-HNB and RT-PCR sensitivity assays

2.4 RT-LAMP-HNB 田間檢測

為了檢測本研究中建立的RT-LAMP-HNB 在實(shí)際生產(chǎn)中的使用效果，對市場購買的20 份蝴蝶蘭樣品進(jìn)行CymMV、ORSV 檢測，同時(shí)以RTPCR 作為對照檢測方法，結(jié)果見圖4。RT-PCR凝膠電泳顯示,在對CymMV 病毒的檢測中1、2、3、4、6、10、13、14、15、16、7、18、19、20號樣品有明顯擴(kuò)增條帶，大小與目的片段一致；5、7、8、9、11、12 號樣品未擴(kuò)增出目的片段。RT-LAMP-HNB 體系擴(kuò)增后顯色結(jié)果與RT-PCR凝膠電泳結(jié)果保持一致，20 份蝴蝶蘭中有14 個(gè)樣品檢測出CymMV 陽性，占比70%（圖4A）。ORSV 病毒檢測結(jié)果（圖4B）顯示，RT-LAMPHNB 體系擴(kuò)增后顯色結(jié)果同樣與RT-PCR 結(jié)果保持一致，5、6、7、11、14、15、16、17、18、19、20 號樣品檢出ORSV 陽性，1、2、3、4、8、9、10、12、13 號樣品未檢出ORSV，20 份蝴蝶蘭中11 個(gè)樣品檢出ORSV 陽性，占比55%。

圖4 RT-LAMP-HNB 及RT-PCR 田間檢測結(jié)果Fig.4 Field detection results of RT-LAMP-HNB and RT-PCR

根據(jù)上述結(jié)果，本研究建立的CymMV 和ORSV RT-LAMP-HNB 檢測方法對田間樣品的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測方法RT-PCR 結(jié)果保持一致，顯示該法能夠適用于針對蘭花兩種病毒的田間病毒檢測。

3 討論

本研究以CymMV、ORSV 的cp基因?yàn)槟康幕蚪⒘薈ymMV 和ORSV 的RT-LAMP-HNB檢測方法。該法具有常規(guī)LAMP 方法靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，在與RT-PCR 及RT-LAMP 進(jìn)行靈敏度比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，RT-LAMP-HNB 的靈敏度較RT-PCR 高10 倍，與凝膠電泳檢測的RTLAMP 結(jié)果保持一致。此外，常規(guī)LAMP 檢測需要通過凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，開蓋后產(chǎn)物極易形成氣溶膠污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境從而造成假陽性，RTLAMP-HNB 則能夠通過肉眼直接觀測體系顏色變化，判斷是否有擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生，避免了常規(guī)LAMP 氣溶膠污染的發(fā)生。

目前對于CymMV、ORSV 分子檢測技術(shù)的研究主要集中在以RT-PCR 和RT-LAMP 為基礎(chǔ)的方法上，如梁芳［20］等根據(jù)cp基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了CymMV SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的檢測方法，結(jié)果顯示靈敏度較RT-PCR 高100 倍。但該法需要使用熒光定量PCR 儀，不適用于基層使用；譚建錫等［25］對蘭花的5 種病毒CMV、ORSV、CymMV、辣椒褪綠病毒（CaCV）以及落葵皺紋花葉病毒（BaRMV）建立了可視化基因芯片檢測方法，該研究設(shè)計(jì)了多重RT-PCR引物及特異性探針，利用RT-PCR 方法進(jìn)行核酸擴(kuò)增后與特異性探針雜交顯色后分析結(jié)果，結(jié)果顯示可檢出的病毒陽性質(zhì)粒不低于103拷貝/μL。該法可一次性檢測5 種病毒核酸，但文中未對田間樣品進(jìn)行檢測，在實(shí)際生產(chǎn)中的可應(yīng)用性未知；樊榮輝［23］等利用SYBR Green Ⅰ與雙鏈DNA 結(jié)合的特性，在RT-LAMP 體系中加入SYBR Green Ⅰ來判讀結(jié)果，其研究顯示該法能夠特異性的擴(kuò)增CymMV，靈敏度為RT-PCR 的10倍，與本研究結(jié)果一致，利用RT-LAMP 和RTPCR 對田間樣品進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，兩種方法的檢測結(jié)果保持一致，檢出率為60%；Tsa 等［26］根據(jù)RNA-dependent RNA polymerase（RdRp）基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，利用RT-LAMP 對ORSV 進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示RT-LAMP 較RT-PCR 靈敏度高100 倍，但該法仍需要進(jìn)行凝膠電泳，極易造成后續(xù)檢測的假陽性。

由 于CymMV 和ORSV均為RNA病毒，而RNA 易降解，在抽提過中極易產(chǎn)生損失，且RNA抽提過程也較為繁瑣，后期研究過程中可設(shè)法提高檢測方法的靈敏度，回避RNA 抽提，進(jìn)一步提升該檢測方法的靈敏度；此外本文采用的田間樣品為蝴蝶蘭，后期可將田間樣品擴(kuò)大到卡特蘭、石斛蘭、國蘭等其他品種的蘭花，擴(kuò)大RTLAMP-HNB 在蘭花生產(chǎn)中病毒檢測監(jiān)控上的應(yīng)用性。

4 結(jié)論

LAMP 技術(shù)自2000 年被發(fā)明以來，因其恒溫?cái)U(kuò)增核酸的特點(diǎn)，在植物病原檢測領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用［27-28］。但是由于LAMP 產(chǎn)物極易形成氣溶膠從而造成結(jié)果假陽性，諸多學(xué)者將研究焦點(diǎn)集中在不開蓋檢測LAMP 產(chǎn)物的方法上［29］，以提高LAMP 在實(shí)際應(yīng)用上的價(jià)值。本研究針對CymMV和ORSV 各自的cp基因序列設(shè)計(jì)LAMP 引物，在反應(yīng)體系中加入HNB，如發(fā)生環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，體系顏色由紫紅色變?yōu)樗{(lán)色，從而能夠判讀結(jié)果的陰性或陽性。為了證實(shí)本研究建立的RTLAMP-HNB 在實(shí)際生產(chǎn)中的可應(yīng)用性，對田間20 份蝴蝶蘭樣品進(jìn)行RT-LAMP-HNB 及RT-PCR檢測，結(jié)果CymMV 和ORSV 的RT-LAMP-HNB檢出率分別為70%、55%，與RT-PCR 檢測結(jié)果保持一致，能夠準(zhǔn)確的進(jìn)行田間樣品檢測，后期可用于蝴蝶蘭樣品中CymMV、ORSV 病毒感染的檢測監(jiān)控。