不同溫度處理方式對(duì)芥菜型油菜種子萌發(fā)與活力的影響研究

魏 超，江嘉純，溫 馨，王美容

（肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061）

【研究意義】油菜是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，其中芥菜型油菜（Brassica junceaL.）具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，主要用于食用油的開發(fā)。自然界中存在多種芥菜類蔬菜變種，其風(fēng)味獨(dú)特，是各地的名特優(yōu)產(chǎn)品，既可以鮮食（如大葉芥菜、筍子芥、兒菜等），還可以用于加工（如榨菜、酸菜［1］、梅干菜、芥末油［2］等）。芥菜型油菜是遺傳學(xué)研究的材料，利用芥菜型油菜與甘藍(lán)型油菜等近緣物種之間的種間雜交來(lái)進(jìn)行遺傳物質(zhì)的交流和基因組進(jìn)化［3］的研究，以及在篩選優(yōu)良雜種后代方面［4-5］均具有一定意義。因此，研究芥菜型油菜種子的休眠和活力與種子保存年限的關(guān)系對(duì)芥菜型油菜種子的保存具有一定意義，而且研究低溫與其種子休眠和萌發(fā)的關(guān)系也有利于芥菜型種子的處理技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的推廣?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】種子壽命受到物種、基因和環(huán)境的綜合調(diào)控［6］，種子活力是衡量種子質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵因素，而種子老化是一個(gè)正常的生理變化［7］，有不少研究發(fā)現(xiàn)多種作物中存在種子抗老化的相關(guān)多基因位點(diǎn)［8］，在水稻中存在與種子活力和老化相關(guān)的代謝標(biāo)志物［9］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，種子的壽命受氧化脅迫和種皮發(fā)育相關(guān)基因［10］以及過氧化物酶及其調(diào)控基因COG1的調(diào)控［11］，同時(shí)還受保存年限和保存方法的影響［12-15］。不同保存年限和保存方法，尤其是不同含水量對(duì)小麥種子、灰芥種子的壽命變化［13-14］和毛地黃種子活力的維持［12］具有明顯影響，擬南芥種子長(zhǎng)時(shí)間保存后NADP-ME1 影響了種子的萌發(fā)［15］，而吸脹引發(fā)后的番茄種子在熱激處理后卻能延長(zhǎng)壽命［16］。種子的休眠與種子的壽命具有一定的關(guān)聯(lián)性［13,17］。種子的休眠是一個(gè)受多種因素調(diào)控的過程，受到外界不同環(huán)境、內(nèi)在激素及其代謝路徑以及特異休眠基因（染色質(zhì)因子）的協(xié)同調(diào)控［18-20］，種子的后熟作用受到多對(duì)基因的調(diào)控，而種皮限制和含水量也是影響休眠的因素之一［20］。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)很多激素與休眠的誘導(dǎo)和維持有關(guān)，如OsDOG1L-3［21］、FLOWERING LOCUS T［22］和AtPER1［23］等都通過與ABA 或GA 激素路徑相關(guān)來(lái)調(diào)控休眠。此外，活性氧ROS 也與休眠和老化相關(guān)［24］。在解除休眠的機(jī)制和方法方面也有一定研究，但分子機(jī)制仍不清楚，主要是利用層積（水分吸脹）、激素處理和一些化學(xué)物質(zhì)來(lái)發(fā)揮作用［18,20］。有研究通過比較芥菜型蔬菜在不同條件下萌發(fā)，發(fā)現(xiàn)一段時(shí)間的低溫和變溫處理有利于打破休眠［25］，而小白菜則需要通過GA 和1%硝酸鉀來(lái)打破休眠［26］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】種子在保存過程中會(huì)發(fā)生休眠，而且保存年限過長(zhǎng)會(huì)影響種子的活力，芥菜型油菜種子在收獲后會(huì)有一定程度的后熟休眠，而低溫處理往往是打破休眠的一種方法，本研究立足于種子活力，分析芥菜型油菜適宜的保存時(shí)間和打破休眠的較佳處理方式。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)利用2 個(gè)年份收獲的芥菜型油菜種子，采用3 個(gè)溫度3 個(gè)時(shí)長(zhǎng)的處理，研究不同溫度處理對(duì)芥菜型油菜種子活力和休眠的影響，以期獲得芥菜型種子適宜的保存時(shí)間以及打破休眠促進(jìn)發(fā)芽的適宜溫度處理，為芥菜型蔬菜種子的保存和發(fā)芽提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為2017 年和2020 年5 月份收獲的芥菜型油菜種子，材料來(lái)源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究室。所有種子收獲后經(jīng)過分選和曬種后保存于常溫陰涼干燥的條件下。本試驗(yàn)于2020 年9—12 月在肇慶學(xué)院生物園油菜試驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

兩個(gè)年份的芥菜型油菜種子分別進(jìn)行篩選和曬種后，挑選飽滿且生長(zhǎng)一致的種子，分別置于25℃、4℃和-10℃條件下進(jìn)行低溫預(yù)處理，每個(gè)溫度條件下均設(shè)置處理24、48、72 h，處理過程中種子處于密閉環(huán)境并保持干燥。每次預(yù)處理完成后進(jìn)行水培實(shí)驗(yàn)，在水培播種前，所有種子用75%酒精消毒1 min，用雙蒸水漂洗3 次約10 min。將不同時(shí)間處理的種子分別置于15 cm×15 cm 的發(fā)芽盒中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。發(fā)芽盒中放置2 層醫(yī)用紗布，加入水培營(yíng)養(yǎng)液，在播種后3 d內(nèi)，將發(fā)芽盒覆蓋防止盒子中水分蒸發(fā)過快，待種子長(zhǎng)出幼根后打開蓋子，整個(gè)過程紗布保持濕潤(rùn)。整個(gè)發(fā)芽和生長(zhǎng)過程置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，設(shè)置溫度為25℃、光照時(shí)間16 h、黑暗時(shí)間8 h。各處理供試種子均為100 粒，3 次重復(fù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

為測(cè)定芥菜型油菜種子的活力與休眠情況，分別記錄種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和每天出苗率，同時(shí)統(tǒng)計(jì)平均發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽指數(shù)和幼苗活力指數(shù)。發(fā)芽率的計(jì)算以芽長(zhǎng)大于2 mm 為標(biāo)準(zhǔn)，成苗數(shù)統(tǒng)計(jì)以幼莖直立、子葉平展、子葉由淡黃轉(zhuǎn)為綠色為標(biāo)準(zhǔn)（大于1 cm），發(fā)芽勢(shì)取播種后3 d 的數(shù)據(jù)。

式中，Gt 代表第t 天發(fā)芽種子數(shù)，Dt 代表播種后第t 天［27-28］；幼苗總長(zhǎng)＝苗高+根長(zhǎng)，一般以發(fā)芽終期（7～10 d）為調(diào)查時(shí)間。

利 用Excel 2010 和SPSS 軟件對(duì)數(shù) 據(jù)進(jìn)行整理、分析及作圖，同時(shí)利用Photoshop 和GraphPad Prism 5 進(jìn)行部分圖片制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度處理對(duì)芥菜型油菜種子萌發(fā)的影響

為研究種子萌發(fā)情況與溫度處理的關(guān)系，對(duì)2017、2020 年兩個(gè)年份收獲的芥菜型油菜種子分別進(jìn)行4℃和-10℃的低溫處理，以25℃為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同溫度處理同一年份收獲的種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有一定差異，但是同一溫度不同時(shí)間處理對(duì)種子的萌發(fā)影響較??；而兩個(gè)年份的種子萌發(fā)情況具有明顯差異。由圖1 可知，2017 年收獲種子的萌發(fā)情況較差，水培第10 天的幼苗整體較弱、發(fā)芽數(shù)量很少，低溫處理后種子萌發(fā)情況與25℃（CK）相比沒有明顯改變，不同處理時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)也沒有明顯影響，僅4℃低溫處理24 h 對(duì)幼苗子葉伸展有一定促進(jìn)作用，但萌發(fā)數(shù)量沒有明顯差異。

圖1 不同溫度處理對(duì)2017 年收獲芥菜型油菜種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of different temperature treatments on germination of Brassica juncea seeds harvested in 2017

相比之下，2020 年收獲種子的萌發(fā)情況比2017 年收獲種子明顯要好。由圖2 可知，2020 年收獲種子萌發(fā)幼苗的生長(zhǎng)情況良好，子葉伸展較好。值得注意的是，4℃處理72 h 的幼苗長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于24、48 h 處理幼苗，而-10℃處理幼苗長(zhǎng)勢(shì)更優(yōu)于25℃（CK）和4℃處理幼苗，尤其是幼苗根部更長(zhǎng)。

圖2 不同溫度處理對(duì)2020 年收獲芥菜型油菜種子萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of different temperature treatments on germination of Brassica juncea seeds harvested in 2020

2.2 不同溫度處理對(duì)芥菜型油菜種子發(fā)芽活力的影響

2.2.1 2017 年收獲種子發(fā)芽率與休眠分析 2017年收獲的芥菜型油菜種子由于存放時(shí)間較久，種子的發(fā)芽率整體水平較低、在20%以下（圖3A～圖3C），雖然同一溫度處理的不同時(shí)間下會(huì)有顯著差異，但是這種差異可能是隨機(jī)取樣誤差（圖3A）；4℃和-10℃低溫處理并不能顯著提高種子的發(fā)芽率，發(fā)芽勢(shì)也沒有明顯改變，我們推測(cè)在種子已經(jīng)失去活力的情況下，無(wú)法通過低溫處理改變其生理狀態(tài)，因此，本研究認(rèn)為芥菜型油菜種子經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間常溫保存后可能會(huì)失去活力，而并非進(jìn)入休眠狀態(tài)。

圖3 2017 年收獲芥菜型油菜種子的發(fā)芽率和成苗數(shù)Fig.3 Germination rate and seedling number of Brassica juncea seeds harvested in 2017

2.2.2 2020 年收獲種子發(fā)芽率與休眠分析 圖4顯示，2020 年收獲芥菜型油菜種子的發(fā)芽率大多高于50%、明顯高于2017 年收獲種子，且發(fā)芽勢(shì)也極顯著提高。2020 年收獲種子經(jīng)4℃低溫處理后，尤其是24 h 較短時(shí)間處理后，其發(fā)芽受到明顯抑制，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)芽率有所提高；圖4 還表明，2020 年收獲種子在-10℃低溫處理下，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)都極顯著高于25℃和4℃處理，處理后第2 天超過60%發(fā)芽。可見，2020 年收獲種子活力比較旺盛，但是也存在休眠現(xiàn)象，-10℃處理可以打破休眠。

圖4 2020 年收獲芥菜型油菜種子的發(fā)芽率和成苗數(shù)Fig.4 Germination rate and seedling number of Brassica juncea seeds harvested in 2020

2.2.3 不同收獲年份種子發(fā)芽指數(shù)與平均發(fā)芽時(shí)間比較 2017 年收獲芥菜型油菜種子與2020 年收獲種子的平均發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽指數(shù)均有顯著區(qū)別，就發(fā)芽指數(shù)而言，2020 年不同溫度處理種子之間也有顯著差異。表1 顯示，2017 年和2020年收獲種子的平均發(fā)芽時(shí)間有一定差異，前者需約8 d 發(fā)芽，而后者在處理后第6 天就開始發(fā)芽，低溫處理并不能顯著改變種子發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽時(shí)間。

由表1 還可知，2017 年和2020 年收獲芥菜型油菜種子的發(fā)芽指數(shù)差異極顯著，且受低溫處理影響較大。2017 年收獲種子的發(fā)芽指數(shù)整體上低于10，而2020 年收獲種子的發(fā)芽指數(shù)均在80以上。4℃處理?xiàng)l件下，2017 年和2020 年收獲種子的發(fā)芽指數(shù)均較低、明顯低于25℃（CK）和-10℃處理，而2020 年收獲種子-10℃處理的發(fā)芽指數(shù)明顯提高。可見，2020 年收獲種子的活力明顯高于2017 年種子，且-10℃低溫可以促進(jìn)發(fā)芽，4℃有一定抑制作用。

表1 2017 年和2020 年收獲芥菜型油菜種子的發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽天數(shù)比較Table 1 Comparison of Germination index and Mean germination time of Brassica juncea seeds harvested in 2017 and 2020

2.3 不同溫度處理對(duì)芥菜型油菜幼苗生長(zhǎng)和活力的影響

同一年份收獲的芥菜型油菜種子不同溫度處理下，幼苗生長(zhǎng)狀況有所不同。2017 年收獲種子的成苗數(shù)較少、在15 個(gè)以下，部分種子成苗數(shù)少于發(fā)芽數(shù)，是因?yàn)橛行┓N子發(fā)芽后沒有發(fā)育成壯苗。盡管25℃（CK）3 個(gè)時(shí)間處理之間存在隨機(jī)抽樣誤差，但是不同溫度處理方式幼苗數(shù)還是表現(xiàn)出一定差異，尤其是4℃24 h 處理成苗數(shù)極顯著減少；2020 年收獲種子4℃處理成苗數(shù)極顯著減少，-10℃處理成苗數(shù)卻顯著增加。

幼苗活力指數(shù)是反映幼苗長(zhǎng)度和發(fā)芽率的綜合指標(biāo)。從圖5 可以看出，2017 年和2020 年收獲芥菜型油菜種子萌發(fā)產(chǎn)生的幼苗長(zhǎng)度和活力指數(shù)具有較大差異，同一年份不同處理方式種子萌發(fā)產(chǎn)生的幼苗長(zhǎng)度和活力指數(shù)也存在較大差異。2020 年收獲種子萌發(fā)產(chǎn)生的幼苗長(zhǎng)度和活力指數(shù)極顯著高于2017 年收獲種子；-10℃較短時(shí)間（24 h）處理有利于促進(jìn)種子萌發(fā)產(chǎn)生的幼苗長(zhǎng)度和活力指數(shù)的提高；4℃處理降低了2020 年收獲種子的幼苗活力指數(shù)，4℃ 24 h 處理也降低了2017 年種子的幼苗活力指數(shù)?？梢姡酌玳L(zhǎng)度和活力指數(shù)受保存年限和低溫處理的影響較明顯。

圖5 2017 年和2020 年收獲芥菜型油菜種子萌發(fā)幼苗長(zhǎng)度和活力指數(shù)Fig.5 Seedling lengths and seedling vigor indexes of Brassica juncea seeds harvested in 2017 and 2020

3 討論

3.1 2017 年收獲芥菜型油菜種子活力降低明顯

本試驗(yàn)中，兩個(gè)收獲年份的芥菜型油菜種子的活力差異較大，保存年限越長(zhǎng)，種子活力越低。研究發(fā)現(xiàn)，不同年份收獲的小麥種子萌發(fā)率存在明顯差異［14］；毛地黃種子的發(fā)芽率不僅隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，還與種子含水量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［12］；灰芥種子在高溫高濕環(huán)境中貯藏30 d后活力基本喪失，在干燥環(huán)境中放置400 d 雖然活力下降但發(fā)芽率仍達(dá)50%［13］。本研究結(jié)果與前人研究基本吻合，2017 年收獲種子的發(fā)芽率和成苗率等活力相關(guān)指標(biāo)明顯低于2020 年收獲種子，表明常溫干燥保存的種子活力在3 年后基本喪失。

3.2 芥菜型油菜種子收獲后存在休眠現(xiàn)象

白菜［26］、甘藍(lán)［29］、油菜［30］和芥菜［31］種子均存在一定的休眠機(jī)制。研究認(rèn)為芥菜型油菜種子由于存在一定的生理后熟作用，因此存在一定的休眠，而這種休眠會(huì)隨著干種子貯藏的時(shí)間而逐漸消除［25,31］。本研究發(fā)現(xiàn)，芥菜型油菜種子在收獲后表現(xiàn)出一定的休眠現(xiàn)象。一方面，2020年收獲的種子發(fā)芽率-10℃處理顯著高于25℃對(duì)照，表明2020 年收獲的種子還未完全解除休眠，低溫可以適當(dāng)打破休眠；另一方面，2017 年收獲的種子不同溫度處理發(fā)芽率和成苗數(shù)并未提高，所以本研究認(rèn)為2017 年收獲種子沒有進(jìn)入休眠狀態(tài)且種子活力基本喪失。

3.3 4℃短時(shí)間處理不利于提高芥菜型油菜種子活力

本研究發(fā)現(xiàn)，芥菜型油菜種子在4℃低溫下的短時(shí)間處理不利于種子活力提高和幼苗生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，低溫層積（吸脹）作用可以在一定程度上打破休眠，主要是通過抑制轉(zhuǎn)錄因子SPT 來(lái)解除其對(duì)赤霉素路徑關(guān)鍵基因的抑制作用［20］，而較長(zhǎng)時(shí)間（4～7 d）的4℃低溫處理有利于打破芥菜種子的休眠和提高種子活力［25］。本試驗(yàn)中，24 h 短時(shí)間4℃低溫處理后，2017 年和2020 年收獲種子的發(fā)芽率均顯著降低，特別是2017 年種子的成苗數(shù)和活力指數(shù)顯著降低，2020 年種子萌發(fā)產(chǎn)生的幼苗長(zhǎng)度顯著減少；隨著4℃處理時(shí)間的適當(dāng)延長(zhǎng)，以上指標(biāo)又恢復(fù)或超過25℃（CK）水平。因此，本研究認(rèn)為在一定程度上（考慮到抽樣誤差的可能性），短時(shí)間4℃低溫處理不利于芥菜型油菜種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)時(shí)間可能會(huì)消除副作用，推測(cè)可能是種子適應(yīng)低溫冷害并產(chǎn)生生理抵抗。

3.4 -10℃冷凍處理有利于芥菜型油菜種子打破休眠

本研究中，-10℃冷凍處理可能有利于打破2020 年收獲種子的休眠作用。2020 年收獲種子-10℃處理發(fā)芽率、幼苗長(zhǎng)度和幼苗活力指數(shù)等均顯著提高，關(guān)于-10℃對(duì)芥菜種子活力和打破休眠的研究較少，本研究推測(cè)可能是由于冷凍處理激發(fā)了種子內(nèi)部某些代謝（激素）路徑或生理指標(biāo)的升高，或者抑制了休眠基因的表達(dá)等，產(chǎn)生的一些次級(jí)代謝產(chǎn)物或酶類有利于打破休眠和提高種子、幼苗的活力。2020 年收獲種子-10℃處理24、48、72 h 有利于發(fā)芽率、幼苗活力指數(shù)和幼苗長(zhǎng)度的增加，因此，本研究推測(cè)2020 年收獲種子存在休眠現(xiàn)象，且經(jīng)-10℃低溫處理可以有效打破種子休眠、提高種子活力。最終，本試驗(yàn)基本確定芥菜型油菜種子的休眠現(xiàn)象和保存年限，比較幾種處理方式間的差異，對(duì)芥菜型蔬菜的育苗和種子生產(chǎn)具有一定的實(shí)踐意義。

4 結(jié)論

芥菜型油菜種子收獲后存在一定的后熟休眠現(xiàn)象，經(jīng)過-10℃干燥條件下的冷凍處理后，發(fā)芽率從原來(lái)的65%提高至80%，幼苗長(zhǎng)度和幼苗活力指數(shù)相應(yīng)提高。但是在4℃短時(shí)間處理下，種子發(fā)芽率和幼苗活力受到一定程度的抑制，隨著處理時(shí)間的適當(dāng)延長(zhǎng)，抑制作用減弱。相對(duì)于2020 年收獲種子而言，2017 年收獲種子的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著下降。建議常溫干燥條件下的芥菜型油菜種子保存年限在1 年以內(nèi)。