番木瓜鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CpMGT1的克隆與功能分析

許迎港　鄒智　郭靜遠(yuǎn)　孔華　朱國鵬　郭安平

摘? 要：鎂是一種大量金屬營養(yǎng)元素，其在植物的生長、發(fā)育、光合、脅迫響應(yīng)等生物學(xué)過程中起重要作用。在高等植物中，Mg的吸收、運(yùn)輸、分布和再分配主要由鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MGT/MRS2）和Mg/H交換體（MHX）介導(dǎo)。其中，MGT/MRS2又名CorA，最先在鼠傷寒沙門氏菌中被發(fā)現(xiàn)，后在擬南芥、水稻等模式植物中進(jìn)行了較為深入的研究。番木瓜（ L.）是一種隸屬于十字花目番木瓜科的重要熱帶果樹，至今還未見有關(guān)基因的報(bào)道。本研究基于番木瓜的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用RT-PCR技術(shù)成功克隆到一個(gè)基因（），應(yīng)用生物信息學(xué)手段預(yù)測蛋白的理化特性和保守基序，運(yùn)用qRT-PCR分析基因的表達(dá)模式，利用缺失CorA、MgtA和MgtB的沙門氏菌突變株MM281進(jìn)行功能互補(bǔ)。結(jié)果表明：的編碼區(qū)為1332 bp，預(yù)測編碼443 aa，理論分子量為50.43 kDa、等電點(diǎn)為5.12;該蛋白含有2個(gè)疏水跨膜區(qū)（TM1和TM2），其中TM1包含高度保守的GMN基序;進(jìn)化及亞細(xì)胞定位分析表明CpMGT1與擬南芥中AtMGT1和AtMGT2的親緣關(guān)系較近，定位于細(xì)胞膜;定量分析顯示基因?yàn)榻M成型表達(dá)，其中在根、莖和果實(shí)中的表達(dá)量較高;在MM281中異源表達(dá)可顯著提高工程菌在低Mg濃度下的生長速率，表明CpMGT1具有高效的Mg轉(zhuǎn)運(yùn)活性。的克隆與鑒定為進(jìn)一步揭示番木瓜基因在不同組織特別是在果實(shí)中Mg的積累機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番木瓜;鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;表達(dá)分析;沙門氏菌;功能互補(bǔ)中圖分類號：S59;S813.3 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Cloning and Functional Analysis of ， a Magnesium Transporter Gene from

XU YinggangZOU ZhiGUO JingyuanKONG HuaZHU GuopengGUO Anping

1. College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Sanya Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Sanya， Hainan 572024， China; 3. Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions / Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Magnesium is a macronutrient that plays essential roles in plant growth， development， photosynthesis， stress response as well as other biological processes. In higher plants， it has been established that absorption， transport， distribution， and reallocation of Mg are mainly mediated by MGTs/MRS2s （magnesium transporters/mitochondrial RNA splicing2s） and MHXs （magnesium-proton exchangers）. Among them， the family MGT， also known as CorA （cobalt resistance A） that was originally identified in ， was most studied， especially in model plants such as arabidopsis （） and rice （）. By contrast， little information is available in papaya （L.）， an economically important tropical crop of the Caricaceae family within Brassicales. Based on mining accessible genome and transcriptome data of papaya， in this study， a magnesium transporter gene named ， which includes an open reading frame of 1332 bp， was successfully cloned using RT-PCR （reverse transcription polymerase chain reaction）. Furthermore， the protein physicochemical properties and conserved motifs were investigated using bioinformatics tools， the gene expression patterns were analyzed using qRT-PCR （quantitative real-time PCR）， and functional complementarity was performed through heterologous expression in mutant MM281 that lacks Mgtransporting systems （i.e. CorA， MgtA， and MgtB） and can’t grow on media containing low concentrations of Mg. Results showed that was predicted to encode 443 amino acids with a theoretical molecular weight of 50.43 kDa and an isoelectric point of 5.12; the protein was shown to contain two hydrophobic transmembrane regions （i.e. TM1 and TM2）， while TM1 harbored the highly conserved GMN motif; the subcellular localization prediction suggested that the CpMGT1 protein was located in the plasma membrane， whereas the evolutionary analysis revealed that it was closely related to AtMGT1 and AtMGT2， two high affinity Mg transporters in arabidopsis; the expression analysis showed that was constitutively expressed in tissues examined， with most abundance in roots， stems， and fruits; heterologous expression of in the MM281 mutant could significantly improve the growth of engineering strain at low Mg concentrations， implying its high Mgtransport activity. Taken together， this study presents the molecular cloning and characterization of the first gene in papaya， including sequence features， physicochemical properties， evolutionary relationships， gene expression patterns as well as Mgtransport activity. These results could not only lay a solid foundation for further uncovering the accumulation mechanism of Mg in different tissues especially in the fruit， but also provide a valuable resource for genetic improvement in papaya and other species.

; magnesium transporter; expression analysis; ; functional complementarity

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.003

Mg是生物體內(nèi)廣泛存在的二價(jià)金屬陽離子，其在植物的各種生理生化過程中起重要作用。Mg具有較大的水合半徑、小的離子半徑和高的電荷密度，這些物理結(jié)構(gòu)決定了其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特異性。在高等植物中，Mg的轉(zhuǎn)運(yùn)主要由鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（magnesium transporter/mit-o-c-hondrial RNA splicing 2， MGT/MRS2）和Mg/ H交換體（magnesium-proton exchanger， MHX）介導(dǎo)。其中，基因最早在鼠傷寒沙門氏菌（）中被發(fā)現(xiàn)，缺失Mg轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（即CorA、MgtA和MgtB）的突變株MM281無法在低于10 mmol/L Mg的N-Minimal培養(yǎng)基上生長。至今MGT家族成員已在擬南芥（）、水稻（）等植物中進(jìn)行了較為深入的研究。在擬南芥的10個(gè)中，有9個(gè)基因的編碼蛋白具有Mg轉(zhuǎn)運(yùn)活性，其中，AtMGT1、AtMGT2和AtMGT10為高親和型，AtMGT3、AtMGT6、AtMGT7和AtMGT9為低親和型，AtMGT5為雙親和型;對、、等突變體的研究表明，其胞質(zhì)中的Mg濃度明顯低于野生型。在水稻的9個(gè)家族成員中，的上調(diào)表達(dá)可明顯增加細(xì)胞中的Mg濃度，從而增強(qiáng)植株的耐鋁脅迫能力。結(jié)構(gòu)分析顯示，MGT蛋白序列的C-末端通常含有兩個(gè)保守的疏水跨膜結(jié)構(gòu)域（TM1和TM2）及位于TM1末端的三肽基序GMN（Gly-Met-Asn）。

番木瓜（ L.）是一種隸屬于十字花目番木瓜科的多年生常綠果樹，含多種維生素、氨基酸、鉀、鈣、鎂、鐵等，被譽(yù)為“水果之王”。本研究基于番木瓜的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對一個(gè)果實(shí)高豐度表達(dá)基因進(jìn)行克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)模式分析，并在此基礎(chǔ)上利用沙門氏菌突變株MM281進(jìn)行功能互補(bǔ)，以期為今后的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

? 材料與方法

?材料

1.1.1 ?植物材料? 供試番木瓜品系為中白，種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院文昌試驗(yàn)基地，樹齡為7個(gè)月。選取長勢基本一致的植株分成3組，每組3個(gè)單株，花授粉后即進(jìn)行標(biāo)記，最后于同一天早上8：00之前采集授粉后10、60、120?d的果實(shí)及根、莖、葉、花等其他組織，授粉后120?d的果實(shí)用報(bào)紙包裹后置于25℃培養(yǎng)室中，分別放置6?h、2?d和6?d，每樣品3次生物學(xué)重復(fù)，樣品采集后立即放入液氮中速凍，并置于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2? 菌株及載體 ?大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存;沙門氏菌突變株MM281和質(zhì)粒Trc99A由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所陽江華副研究員惠贈。

1.1.3? 主要試劑 ?反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit和高保真酶PrimerSTAR Max DNA Polymerase購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;膠回收試劑盒Gel Extraction Kit和質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid DNA Mini KitⅠ購自O(shè)mega Bio-Tek;各類限制性內(nèi)切酶均購自美國NEB;重組克隆試劑盒ClonExpress II One Step Cloning Kit購自諾唯贊;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

?方法

1.2.1 ?總RNA的提取及cDNA的合成? 總RNA的提取參照房平昌的方法，主要流程如下：取樣品2～3 g，在液氮下用研缽研磨成細(xì)粉末;加入10 mL 65℃預(yù)熱的CTAB提取液和200?mL β-巰基乙醇，渦旋劇烈混勻，65℃水浴5～20?min，中間振蕩數(shù)次;待冷卻到室溫后加入等體積的氯仿，振蕩混勻，4℃ 15?000′離心10?min;將上清液轉(zhuǎn)至另一新管中，并加入等體積的水飽和酚和氯仿，充分振蕩，4℃ 15?000′離心10?min（視情況重復(fù)上述步驟1～2次）;將上清吸出后，加入總體積1/3的8?mol/L LiCl，–20℃冰箱放置12?h，再次離心，取上清，75%乙醇洗滌沉淀2次，沉淀用50～100?mL DEPC水溶解。質(zhì)檢合格后參照TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，–20℃保存待用。

1.2.2? 基因克隆與載體構(gòu)建 ?通過搜索番木瓜的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/）獲得的全長轉(zhuǎn)錄本序列，并據(jù)此設(shè)計(jì)如表1所示的3對基因特異性引物。以不同組織混合來源的cDNA作為模板，采用巢式PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，首輪反應(yīng)體系為PrimeSTAR Max premix 2×12.5?μL、cDNA 1?μL、F/ R各1 μL、ddHO 10.5?μL;擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性1?min，98℃變性10?s、53℃退火25?s、72℃延伸1.5?min（35個(gè)循環(huán)），最后72℃延伸5?min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后切膠回收，稀釋50倍作為第二輪PCR擴(kuò)增的模板，反應(yīng)體系為PrimeSTAR Max premix 2×50?μL、第一輪PCR產(chǎn)物為cDNA 1?μL;-99F/- 99R各1?μL、ddHO 22?μL;擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性1?min，98℃變性11 s、54℃退火25 s、72℃延伸1.5?min（25個(gè)循環(huán)），最后72℃延伸5?min。表達(dá)載體Trc99A使用限制性核酸內(nèi)切酶RⅠ（10 U/mL）和Ⅰ（10 U/mL）進(jìn)行酶切，切膠回收后與第二輪PCR獲得的目的基因片段按1∶3比例混勻，并用同源重組酶Exnase II 37℃水浴連接2 h，然后采用凍融法轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR驗(yàn)證后選取陽性克隆進(jìn)行測序分析。

1.2.3? 生物信息學(xué)分析? 用在線軟件Expasy（https：//web.expasy.org）分析理論分子量和等電點(diǎn);用NCBI CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析保守結(jié)構(gòu)域;用在線軟件WoLF PSORT（https：//www.genscript. com/wolf-psort.html）分析亞細(xì)胞定位;用MEGA 6.0軟件中的MUSCLE進(jìn)行序列比對，并用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.4? 基因的表達(dá)分析? 參照鄒智等的方法進(jìn)行熒光定量分析，內(nèi)參基因?yàn)?，引物信息詳見?，使用2法計(jì)算基因的相對表達(dá)值，并用SPSS軟件進(jìn)行顯著性差異分析。

1.2.5? 沙門氏菌功能互補(bǔ)分析? 利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒Trc99A-轉(zhuǎn)入MM281感受態(tài)中，選取陽性單克隆搖菌，陽性對照為Trc99A- ，陰性對照為MM281突變株及轉(zhuǎn)Trc99A空載的MM281突變株。搖至0.6后，加入1/10 IPTG，將菌液繼續(xù)搖至1.0，并用N-Minimal培養(yǎng)基洗滌2～3次，分別稀釋到5個(gè)濃度梯度。準(zhǔn)備4個(gè)不同Mg濃度的N-Minimal固體培養(yǎng)皿，將處理好的菌液呈梯度式點(diǎn)至培養(yǎng)皿，倒置培養(yǎng)2～3?d后，觀察長勢并拍照。

?結(jié)果與分析

基因克隆

如圖1所示，PCR擴(kuò)增成功獲得1條約1300?bp的目的條帶，而Trc99A的雙酶切獲得1條約4100?bp的目的條帶，將其孵育后構(gòu)建原核表達(dá)載體Trc99A-。

2.2? 生物信息學(xué)分析

序列分析表明，的編碼區(qū)（CDS）為1332?bp（NCBI登錄號為XM_022050807），預(yù)測編碼443 aa，理論分子量（MW）為50.43 kDa，等電點(diǎn)（pI）為5.12。CDD分析和序列比對顯示，CpMGT1含有保守的Mrs2_Mfm1p-like（cd12823）結(jié)構(gòu)域;在C端含有2個(gè)疏水跨膜區(qū)（即TM1和TM2），且TM1包含高度保守的GMN基序（圖2）。WoLF PSORT分析顯示，CpMGT1定位在細(xì)胞膜。

2.3 ?進(jìn)化分析

為揭示CpMGT1的進(jìn)化特征，將其與已報(bào)道的擬南芥和水稻MGT蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果表明，這些MGT被聚為5支，其中，CpMGT1與擬南芥的AtMGT1（NP_001322724）、AtMGT2（NP_001077545）、AtMGT3（NP_001118259），水稻的OsMRS2-1（XP_015643498）、OsMRS2-9（XP_015633967）聚在一起。相比而言，CpMGT1與AtMGT1和AtMGT2的相似性更高，分別為83.33%和86.04%。

2.4? 基因表達(dá)分析

表達(dá)分析顯示，在所分析的不同組織中均有表達(dá)，其中在根、莖和果實(shí)中的表達(dá)量相對較高（圖4A）。在果實(shí)中，隨著果實(shí)的發(fā)育呈現(xiàn)先降后升的趨勢，即在授粉后120 d時(shí)相對表達(dá)量最高;采后呈現(xiàn)先升后降的趨勢，即采后2 d相對表達(dá)量最高，但低于授粉后120 d（圖4B）。

2.5 ?功能互補(bǔ)分析

為鑒定的Mg轉(zhuǎn)運(yùn)活性，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒Trc99A-轉(zhuǎn)入MM281突變株中。功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組和對照組在10?mmol/L Mg的平板上均可正常生長。然而，當(dāng)培養(yǎng)基中的Mg濃度降低到5?mmol/L時(shí)，陰性對照未見生長，而實(shí)驗(yàn)組與陽性對照長勢相當(dāng)。隨著Mg濃度的進(jìn)一步降低，實(shí)驗(yàn)組和陽性對照的生長雖然都呈現(xiàn)減弱趨勢，但是趨勢相當(dāng)，這表明CpMGT1是與AtMGT1活性相當(dāng)?shù)母哂H和型Mg轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（圖5）。

討論

植物的生長發(fā)育依賴于根系所吸收的礦質(zhì)營養(yǎng)元素，這些元素需通過質(zhì)外體和共質(zhì)體途徑轉(zhuǎn)移到地上部組織中，這一過程不僅需要蒸騰作用的驅(qū)動，還需要各種離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體的運(yùn)輸，其中包括Mg轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在植物中，Mg轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由多個(gè)成員構(gòu)成的基因家族編碼，如擬南芥中含有10個(gè)成員、水稻中有9個(gè)成員、玉米中有12個(gè)成員、甘蔗中有10個(gè)成員、香蕉中有10個(gè)成員、油菜中有36個(gè)成員。對擬南芥、水稻等模式植物的深入研究表明，MGT蛋白廣泛參與了Mg吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及分區(qū)儲藏。

本研究首次報(bào)道了一個(gè)隸屬于基因家族的番木瓜Mg轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，該基因編碼443?aa、分子量為50.43?kDa、等電點(diǎn)為5.12，細(xì)胞膜定位。更重要的是，蛋白含有該家族特有Mrs2_Mfm1p-like或CorA（PFAM登陸號PF01544）結(jié)構(gòu)域及位于C端疏水跨膜區(qū)TM1上的GMN基序。早前的研究表明，GMN基序?yàn)镸g轉(zhuǎn)運(yùn)所必需。根據(jù)基因表達(dá)分析結(jié)果，總體為一組成型表達(dá)基因，其中在根、莖和果實(shí)中的表達(dá)量較高，暗示該基因可能在多個(gè)部位發(fā)揮Mg轉(zhuǎn)運(yùn)功能。根據(jù)進(jìn)化分析結(jié)果，CpMGT1與擬南芥中AtMGT1和AtMGT2的親緣關(guān)系較近，相似性高達(dá)80%以上，這不僅暗示它們之間的直系同源關(guān)系及類似的生物學(xué)功能，同時(shí)，該結(jié)果跟番木瓜與擬南芥同屬十字花目的分類學(xué)關(guān)系是一致的。前人的研究結(jié)果表明，和均可互補(bǔ)沙門氏菌突變株MM281，且二者均編碼高親和型Mg轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。AtMGT1定位于細(xì)胞質(zhì)膜，具有較高的組織特異性，主要在根部和表皮中表達(dá);基因表達(dá)受Al

誘導(dǎo)，其過量表達(dá)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對鋁毒的抗性。AtMGT2定位于液泡膜，主要在幼嫩葉片中發(fā)揮Mg轉(zhuǎn)運(yùn)功能，并與AtMGT3共同維持葉肉細(xì)胞中液泡的Mg平衡。此外，有研究顯示，還能互補(bǔ)Mg轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷型酵母突變株CM66，并顯著提高酵母的生長效率。與進(jìn)化結(jié)果相應(yīng)的是，的異源過表達(dá)可互補(bǔ)MM281突變株，并顯著提高工程菌在低Mg濃度下的生長速率，這初步證實(shí)編碼一個(gè)高親和的Mg轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，且其活性與AtMGT1相當(dāng)。雖然如此，具體是如何調(diào)控Mg平衡的分子機(jī)制還有待深入研究。

綜上，本研究完成了番木瓜基因的克隆及序列特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)模式和Mg轉(zhuǎn)運(yùn)活性分析。這些結(jié)果不僅為進(jìn)一步揭示番木瓜基因在不同組織特別是在果實(shí)中Mg的積累機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為今后的品種改良提供了寶貴的資源。

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