新時代視域下循環(huán)游離DNA在肺癌ATM基因多態(tài)性位點中的應(yīng)用

●彭 華 張式一 何 莉

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤，發(fā)病機制尚未十分明確，肺癌的發(fā)生發(fā)展對人們的健康造成嚴(yán)重的威脅。大多數(shù)腫瘤因缺乏有效的早期診斷手段，當(dāng)被查出時大多發(fā)生了轉(zhuǎn)移并發(fā)展到中晚期，錯過了最佳的治療時機，導(dǎo)致病人的存活率下降。那么早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療顯得非常重要[1]。循環(huán)游離DNA是一種靈敏度高、特異性強的分子標(biāo)志物用于腫瘤的檢測和預(yù)后檢測，因此需要靈敏度高和特異性好易操作的方法來提高檢出率。應(yīng)用外周血游離DNA樣本的檢測是近年來新興的腫瘤診斷技術(shù)，其呈現(xiàn)出取材方便、容易檢測及非侵入性等諸多優(yōu)勢[2]，有利于臨床指導(dǎo)早期診斷，本研究擬采用SNP敏感性分子開關(guān)[3]技術(shù)對肺癌ATM基因rs175048、rs227060兩位點多態(tài)性進行檢測，為進一步提高肺癌早期診斷效果，為肺癌早期預(yù)警和發(fā)病風(fēng)險評估提供理論基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1.材料。本研究納入2021年10月到2022年3月收集衡陽地區(qū)某醫(yī)院樣本，在患者知情同意下，采集肺癌患者血液120例，男76例，女44例，正常對照組為健康人群120例，男60例，女60例。非小細(xì)胞肺癌98例，小細(xì)胞肺癌22例，所有患者均為原發(fā)性肺癌，患者年齡均在45～79歲之間。

2.實驗方法。采集外周靜脈血2ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，使用上海天根生物工程有限公司提供的試劑盒，提取外周血游離DNA，-20°保存。采用SNP敏感性分子開關(guān)（on-off switch）技術(shù)對兩位點進行基因分型檢測，引物設(shè)計：rs175048A/T 正向引物 1(F1)5’-TGCCTAGAAAATAAGCTA-3’，正向引物 2(F2)5’TGCCTAGAAAATAAGCAA-3’,反向引物(R)5’-TCAACACTGCATTACCTC-3’；rs227060C/T 正向引物 1(F1)5’-AATACTCAAAAGCTTCTC-3’，正向引物 2（F2）5’-AATACT CAAAAGCTTCTT-3’，反向引物（R）5’-TACTTCCATTATTTCTT G-3’。所有引物均由上海生物工程公司合成。聚合酶鏈反應(yīng)體系（PCR）：采用25ul反應(yīng)體系，包括模板外周血游離DNA 1.5ul、正反向引物各1ul、公共引物1ul、去離子水9ul、2*Pfu Mix 12.5ul。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min,94℃變性30s,55℃退火30s，72℃延伸30s,共35個循環(huán),最后 72℃延伸 5min，取PCR產(chǎn)物5ul用2.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳。

二、結(jié)果

1.提取外周血游離DNA。將收集的肘正中靜脈血采用外周血游離DNA試劑盒提取游離DNA，用紫外分光光度計測量其濃度，濃度均在1.7～2.0之間，然后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測游離DNA的質(zhì)量，條帶清晰，無雜帶。檢測完剩余的DNA保存于-20°備用。見圖1。

圖1 外周血游離DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.SNP敏感性分子開關(guān)技術(shù)對ATM基因rs175048、rs227060兩位點檢測。采用SNP分子開關(guān)技術(shù)對ATM基因rs175048、rs227060兩位點進行檢測分型，根據(jù)PCR產(chǎn)物有和無的現(xiàn)象，進行特異性擴增，擴增得到目的片段，PCR產(chǎn)物長度分別為167bp和331bp。rs175048位點F1為野生模板檢測引物，F(xiàn)2為突變模板檢測引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA純合子電泳后只出現(xiàn)與F1配對的1個目的片段，TT純合子只出現(xiàn)與F2配對的1個目的片段，然而AT雜合子則出現(xiàn)與F1、F2配對的2個目的片段。純合子AA（25例）、TT（38例）、雜合子AT（57例）；rs227060位點F1為野生模板檢測引物，F(xiàn)2為突變模板檢測引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CC純合子電泳后只出現(xiàn)與F1配對的1個目的片段，TT純合子只出現(xiàn)與F2配對的1個目的片段，而CT雜合子則出現(xiàn)與F1、F2配對的2個目的片段。純合子CC（44例）、TT（14例）、雜合子 CT（62例）；在肺癌樣本檢測中發(fā)現(xiàn)雜合子檢出率明顯高于純合子。

三、討論

血液中游離DNA是一種游離于細(xì)胞外的DNA，多種病理狀態(tài)下血中游離DNA的水平和組成會發(fā)生改變。目前多數(shù)研究表明腫瘤患者外周血液DNA水平不僅明顯高于正常人[4-5]，且血液游離DNA具有與腫瘤組織DNA一致的基因改變類型[6-7]。血液游離DNA產(chǎn)生的生物學(xué)機制較為復(fù)雜，除正常細(xì)胞的衰老死亡之外，主要來源于腫瘤細(xì)胞壞死凋亡后擴散以及增生活躍腫瘤細(xì)胞的釋放。隨著腫瘤分子生物學(xué)的深入研究，血液游離DNA結(jié)合各類分子生物學(xué)檢測技術(shù)被認(rèn)為是腫瘤早期診斷和預(yù)后判斷的有力手段。

目前世界范圍內(nèi)檢測基因位點突變的方法多種多樣，主要有DNA序列分析、PCR擴增線粒體DNA片段、限制性內(nèi)切酶分析、變性高壓液相色譜分析，SNP突變敏感性分子開關(guān)技術(shù)是一種快速、靈敏、經(jīng)濟、高效、可靠的突變檢測方法，具有典型特點：（1）耗時費力少，整個DNA提??；（2）檢測成本低，經(jīng)濟實用；（3）檢測程序簡單，不需要專門專業(yè)人員操作；（4）該技術(shù)表現(xiàn)配對引物被延伸，不配對引物不延伸的有或無的二元化效果。

本研究擬采用SNP敏感性分子開關(guān)技術(shù)對120例肺癌患者ATM基因rs175048、rs227060多態(tài)性位點檢測，結(jié)果顯示rs175048位點共檢測出AA、AT、TT三種基因型，其中AT基因型檢出率57例；rs227060位點共檢測出CC、CT、TT三種基因型，其中CT基因型檢出率62例，發(fā)現(xiàn)雜合子檢出率明顯高于純合子。然而有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[8]，雜合子是腫瘤患者基因型中常見的現(xiàn)象，與本研究結(jié)果相符，針對肺癌ATM抑癌基因rs175048、rs227060兩位點雜合子檢測發(fā)現(xiàn)，在循環(huán)游離DNA中檢測雜合子可作為肺癌患者的預(yù)后判定指標(biāo)，為肺癌早期預(yù)警和發(fā)病風(fēng)險評估提供理論基礎(chǔ)，可作為判斷肺癌患者的病情變化和診斷的良好輔助指標(biāo)，此方法可廣泛應(yīng)用于臨床。