鑒別小反芻獸疫病毒野毒和疫苗毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法的建立

楊夷平，馬春江，楊 康，楊 帆，方先珍

（新疆哈密市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 新疆 哈密 839000）

小反芻獸疫（Peste des petits ruminants，PPR）是綿羊和山羊等小反芻動(dòng)物感染小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引發(fā)的一種急性、接觸性傳染病，死亡率可達(dá)90%以上，2007年P(guān)PRV傳入我國，對(duì)我國養(yǎng)羊業(yè)影響巨大，我國將其劃定為一類動(dòng)物疫病[1，2]。近年來，隨著新疆畜牧業(yè)的不斷發(fā)展和牛羊市場需求量不斷擴(kuò)大，本地牲畜量供不應(yīng)求，外省牛羊的調(diào)入也越來越頻繁，導(dǎo)致輸入性動(dòng)物疫情風(fēng)險(xiǎn)也不斷升高。目前PPR主要通過疫苗免疫進(jìn)行預(yù)防，單一的通用型病原學(xué)檢測(cè)方法不足以應(yīng)對(duì)臨床疫病診斷，本研究建立了可鑒別檢測(cè)PPR野毒株和疫苗毒株雙重?zé)晒釸T-PCR方法。

1 材料與方法

1.1 病毒與質(zhì)粒

PPRV疫苗株購自市售天康生物弱毒疫苗。PPRV野毒株為煙墩檢查站調(diào)運(yùn)陽性眼鼻拭子。FMDV病毒O型、A型質(zhì)粒由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.2 臨床樣品

羊眼鼻拭子樣品20份，均來自煙墩檢查站陽性樣本。

1.3 主要儀器及試劑

實(shí)時(shí)熒光PCR儀購自ABI公司；核酸提取儀和核酸提取試劑盒(磁珠法)購自西安天隆科技公司；一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量探針試劑盒購自生工生物公司；比較用商品試劑盒來自青島立見生物科技有限公司的小反芻獸疫病毒野毒株與疫苗毒株雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：040682101)。

1.4 病毒RNA提取

樣品核酸的提取參照磁珠法核酸提取試劑盒說明書，以確診PPRV陽性眼鼻拭子和PPRV疫苗為陽性對(duì)照，DEPC水為陰性對(duì)照，用全自動(dòng)核酸提取儀提取樣本總RNA，分別設(shè)計(jì)6個(gè)相同稀釋梯度，用DEPC水進(jìn)行10倍稀釋，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物和探針

經(jīng)過查閱GenBank中已報(bào)道的PPRV疫苗毒株Nigeria75／1和中國野毒株的基因序列，見表1。選取PRRV N基因高度保守區(qū)且具有特異性的基因序列為模板，運(yùn)用BLAST大量比對(duì)分析，設(shè)計(jì)PPRV中國野毒株、PPRV疫苗毒株的特異性引物和熒光探針各一對(duì)，由上海生工生物工程有限公司合成引物并標(biāo)記，具體序列及擴(kuò)增長度見表2。

表1 本研究查閱的PPRV基因序列

表2 熒光定量RT-PCR引物序列和探針標(biāo)記

1.6 二重RT-PCR方法的建立

分別以PPRV野毒株和疫苗毒株為檢測(cè)模板，以一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量探針試劑盒說明書優(yōu)化反應(yīng)體系，篩選PPRV二重RT-PCR最佳引物濃度、探針濃度和最佳反應(yīng)條件，最終確定體系為25μL，其中one step RT-qPCR Probe Mix（2×）12.5μL、RT-enzyme MIX 1μL、F1（10μmol／L）0.5μL、R1（10μmol／L）0.5μL、P1（10μmol／L）0.2μL、F2（10μmol／L）0.4μL、R2（10μmol／L）0.4μL、P2（10μmol／L）0.2μL，RNA模板各2.5μL，補(bǔ)水至25μL，RNase free H2O 4.3μL。反應(yīng)條件為：55℃反轉(zhuǎn)錄15 min；95℃預(yù)變性30 S；95℃變性15 S，60℃退火1 min，45個(gè)循環(huán)。

1.7 特異性試驗(yàn)

利用建立的二重RT-PCR方法分別對(duì)小反芻野毒眼鼻拭子、小反芻疫苗株和口蹄疫病毒O型、A型標(biāo)準(zhǔn)株為陽性對(duì)照，DEPC水為陰性對(duì)照，以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn)

將PPRV野毒株和疫苗毒株的RNA梯度稀釋（10-1~10-6），濃度自高到低共6個(gè)稀釋度作為模板，設(shè)立陰性對(duì)照，按步驟1.6優(yōu)化的RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PPRV野毒株和疫苗毒株的RT-PCR敏感性試驗(yàn)。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

10倍梯度稀釋的PPRV野毒株和疫苗毒株RNA，選取2個(gè)濃度等量混合，按確定的條件進(jìn)行二重?zé)晒釸T-PCR分析重復(fù)性，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)分析組內(nèi)重復(fù)性，計(jì)算Ct值的變異系數(shù)，評(píng)估重復(fù)性試驗(yàn)。

1.10 應(yīng)用實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用建立的雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法與商品雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，以野毒株病毒和小反芻疫苗病毒標(biāo)準(zhǔn)株等量混合物為陽性對(duì)照，DEPC水為陰性對(duì)照，對(duì)20份疑似PPRV臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果分析

2.1 特異性試驗(yàn)

用建立的雙重?zé)晒釸T-PCR方法對(duì)A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、PPR野毒、PPR疫苗毒等疫病核酸進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證引物的特異性。結(jié)果顯示FAM通道（藍(lán)色）只檢測(cè)出小反芻獸疫野毒株眼鼻拭子陽性樣本核酸并出現(xiàn)特異性“S”型擴(kuò)增曲線；TAMRA通道（黃色）只檢測(cè)出小反芻獸疫疫苗株樣本核酸并出現(xiàn)特異性“S”型擴(kuò)增曲線（圖1），其他病毒及陰性對(duì)照的檢測(cè)通道均無特異性擴(kuò)增，表明本研究建立的方法具有良好的特異性。

圖1 雙重?zé)晒釸T-PCR特異性實(shí)驗(yàn)

2.2 靈敏性試驗(yàn)

檢測(cè)結(jié)果表明建立的雙重?zé)晒釸T-PCR方法可以檢測(cè)到小反芻獸疫野毒株的最低稀釋度為10-3，檢測(cè)到疫苗株的最低稀釋度為10-5（圖2，圖3）

圖2 小反芻野毒株靈敏性實(shí)驗(yàn)

圖3 小反芻疫苗株靈敏性實(shí)驗(yàn)

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

選取稀釋度為10-2小反芻獸疫野毒株為模板，變異系數(shù)為1.5%，選取稀釋度為10-3疫苗株為模板，變異系數(shù)為1.9%，重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于2.0%，陰性對(duì)照未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，表明該方法具有良好的重復(fù)性，見表3。

表3 熒光定量RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 檢測(cè)方法的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)

本研究建立的雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法判定標(biāo)準(zhǔn)：Ct值小于40，擴(kuò)增曲線有良好的線性關(guān)系（“S”型）則判定為陽性，Ct值大于40的判定為陰性。應(yīng)用建立的雙重?zé)晒釸T-PCR方法與商品熒光RT-PCR試劑盒同批檢測(cè)疑似小反芻樣品20份，結(jié)果顯示，檢測(cè)出小反芻野毒陽性樣品18份，疫苗毒結(jié)果都為陰性，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致，100%符合。

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2021年我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已發(fā)布小反芻獸疫疫情14起，其中11起屬于輸入性疫情，引起小反芻獸疫發(fā)病的原因有很多，長途運(yùn)輸、飼養(yǎng)條件及養(yǎng)殖環(huán)境突然改變等因素都有可能發(fā)病，各地區(qū)受調(diào)運(yùn)動(dòng)物傳播各類動(dòng)物疫情的風(fēng)險(xiǎn)極大。因此，為加強(qiáng)輸入性動(dòng)物疫情防控，亟需加強(qiáng)動(dòng)物檢疫監(jiān)督工作，規(guī)范跨省、跨地區(qū)調(diào)運(yùn)動(dòng)物活動(dòng)[3-5]。目前，各地對(duì)小反芻獸疫防控手段以疫苗防控為主，另一方面通過實(shí)驗(yàn)室高效檢出早期感染和隱性帶毒者，為小反芻獸疫防控與凈化提供一定的幫助[6-8]。

新疆的公路動(dòng)植物聯(lián)合檢查站作為新疆動(dòng)物疫病防控的第一道屏障，對(duì)于沒有臨床癥狀的疫病需要依靠實(shí)驗(yàn)室分子病原學(xué)檢測(cè)手段診斷，以高效、快捷的檢測(cè)手段檢出早期感染和隱性病原攜帶者。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，因其操作簡單、靈敏度高、重復(fù)性好、耗時(shí)短、成本相對(duì)較低等眾多優(yōu)點(diǎn)，可以為小反芻獸疫防控提供一定的幫助。以降低調(diào)運(yùn)動(dòng)物疫病傳播風(fēng)險(xiǎn)，為調(diào)運(yùn)動(dòng)物落地監(jiān)管和小反芻疫情防控提供技術(shù)參考[9]。在設(shè)計(jì)多重?zé)晒釸T-PCR體系方法時(shí)，首先，目的基因的引物需具有特異性，避免非特異性擴(kuò)增，引物片段大小控制在20 bp左右，避免引物過長干擾擴(kuò)增效率。其次，多重反應(yīng)體系中各引物之間的Tm值差距應(yīng)控制在2℃以內(nèi)，保證各引物的擴(kuò)增效率，因此需特別注意引物和探針的設(shè)計(jì)、引物探針的濃度、退火溫度等[10]。本研究設(shè)計(jì)的2對(duì)特異性引物的Tm值相差僅1.1℃，使得在同樣退火溫度下各目的片段都能夠獲得較好的擴(kuò)增效率。

4 結(jié) 論

本研究建立的檢測(cè)方法在臨床樣品的檢測(cè)中與商品試劑盒的檢測(cè)結(jié)果一致，表明檢測(cè)結(jié)果是準(zhǔn)確的。商品化試劑是批量產(chǎn)品，雙重檢測(cè)試劑盒中的各種組分已提前混合保存，配制體系便捷，但檢測(cè)成本較高。而本研究建立的雙重RT-PCR方法，使用時(shí)可視檢測(cè)目的進(jìn)行配制各組分，可單一配制PPR野毒株體系，只需剔除PPR疫苗毒株引物及探針，余量用DEPC水補(bǔ)足體系，可快速檢測(cè)PPR野毒株；亦可配制雙重檢測(cè)組分用于PPR疫苗株和野毒株感染流行病學(xué)調(diào)查及潛伏感染調(diào)查，檢測(cè)成本較低，具有較廣泛的實(shí)際應(yīng)用前景。