不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和雌孕激素受體的表達(dá)意義

溫勤堅(jiān) (深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳 518102)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)通常指的是連續(xù)自然流產(chǎn)次數(shù)≥3次的一種綜合征，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，常與生殖系統(tǒng)解剖畸形、內(nèi)分泌紊亂以及染色體異常等有關(guān)，還有一半患者無法查出病因，又被稱之為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)。近年來有文獻(xiàn)[1]報(bào)道，URSA的發(fā)生可能與孕激素受體(PR)和雌激素受體(ER)的表達(dá)異常有關(guān)，其中孕激素通過與PR的作用可以維持正常妊娠，而雌激素與ER相互作用能夠維持靶組織的生長(zhǎng)和發(fā)育過程，若蛻膜組織中的PR和ER數(shù)量減少，則會(huì)對(duì)激素的生理功能產(chǎn)生直接影響。而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)作為調(diào)節(jié)體內(nèi)血管的一個(gè)中樞物質(zhì)，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的特異性，不僅可以對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和分裂起到促進(jìn)作用，有助于形成新生血管，而血管生成是早期著床、胎盤形成以及妊娠成功所必需的。有研究[2]發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠者相比，難免流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)患者的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF表達(dá)明顯較低。因此，本研究對(duì)URSA患者蛻膜組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和雌孕激素受體的表達(dá)意義進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1一般資料：選擇我院收治的30例不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦為觀察組，再選擇同期的30例正常早孕人工流產(chǎn)孕婦為對(duì)照組，本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。對(duì)照組停經(jīng)35～70 d，平均停經(jīng)(52.4±9.3)d；年齡21～39歲，平均(29.5±8.5)歲。觀察組停經(jīng)36～71 d，平均停經(jīng)(52.5±9.4)d；年齡22～40歲，平均(29.7±8.6)歲。兩組的停經(jīng)天數(shù)和年齡等資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。入選標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料完善，已明確臨床診斷；②平素月經(jīng)正常，既往無甲狀腺功能異常及糖尿病病史；③無生殖器解剖學(xué)畸形；④流產(chǎn)絨毛行染色體核型分析未見異常；⑤無靜脈血栓史和肝腎疾??；⑥3個(gè)月內(nèi)無激素補(bǔ)充治療病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并子宮肌瘤、多囊卵巢綜合征或子宮內(nèi)膜異位癥者；②臨床資料缺失者；③中途退出研究者；④嚴(yán)重意識(shí)障礙或精神異常者。

1.2方法

1.2.1儀器：選擇奧林巴斯BX41顯微鏡、MICROM HMS760X染色機(jī)、塑料耐高溫染色架和染色缸、DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、MICROM HM340E切片機(jī)以及石蠟急埋機(jī)。

1.2.2絨毛采集及檢測(cè)：兩組患者孕周相似，絨毛取自吸宮術(shù)時(shí)，在無菌生理鹽水中保存吸出的絨毛，在實(shí)驗(yàn)室由專人對(duì)絨毛進(jìn)行挑選，運(yùn)用直接低滲的方法對(duì)染色體進(jìn)行制備：G顯帶染色體，在顯微鏡下對(duì)10～20個(gè)分裂相細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)2～3個(gè)細(xì)胞核型進(jìn)行分析，將胚胎染色體異常排除后，可測(cè)定蛻膜組織的激素受體。

1.2.3測(cè)定受體：人流術(shù)中同時(shí)無菌收集蛻膜2份，一份標(biāo)本運(yùn)用10%甲醛進(jìn)行18～24 h固定后，常規(guī)石蠟包埋切片；另一份保存于-80℃冰箱中，將胚胎染色體異常排除后，測(cè)定蛻膜組織激素受體。同時(shí)，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)ER、PR的蛋白水平表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并且對(duì)VEGF水平進(jìn)行檢測(cè)；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)蛻膜組織中ER及PR的表達(dá)。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)：0.9%生理鹽水將蛻膜組織沖洗干凈后，碾磨液氮至粉末后經(jīng)過系列處理步驟使RNA提取步驟完成，并且去基因組、檢測(cè)純度、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA以及cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：ER(111 bp)：5'-GTCTGCCAGGTTGGTCAGTAAGC-3',PR(144 bp)：5'-GACCCTTTGCCTTCAGCT-CAGTC-3'。同時(shí)，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)，并且運(yùn)用2-△△Ct對(duì)目的基因相對(duì)含量(RQ)進(jìn)行計(jì)算，即2-△△Ct=RQ。

1.3觀察指標(biāo)：運(yùn)用Sinierope改良判斷法，將染色細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度乘積得分作為基本依據(jù)，對(duì)受體表達(dá)情況進(jìn)行分級(jí)，其中>5分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)；4～5分為中度陽(yáng)性(++)；2～3分為陽(yáng)性(+)[3]。

2 結(jié)果

2.1兩組患者的VEGF水平比較：觀察組的+++和++所占比例低于對(duì)照組，且+所占比例高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組VEGF水平對(duì)比[n(%)，n=30]

2.2兩組免疫組化法檢測(cè)PR和ER的表達(dá)比較：與對(duì)照組比較，觀察組的ER表達(dá)陽(yáng)性率低，組間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組的PR表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組免疫組化檢測(cè)PR和ER比較(n，n=30)

2.3兩組RT-PCR方法檢測(cè)的PR和ER水平比較：觀察組的ER表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但是兩組的PR表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組ER和PR水平比較

3 討論

通常情況下，雌孕激素水平維持正常能夠?qū)ψ訉m內(nèi)膜容受性起到一定的促進(jìn)作用，有助于植入胚泡和胎盤的形成發(fā)育，使胚胎處于正常生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)，尤其是子宮蛻膜上的PR和ER在維持妊娠中發(fā)揮著極其重要的作用[4-6]。在受精卵著床中，雌孕激素之間存在著密切的聯(lián)系，生理狀態(tài)下，雌激素啟動(dòng)子宮內(nèi)膜增值，誘導(dǎo)PR的產(chǎn)生，上調(diào)ER和PR。只有雌激素與相應(yīng)的ER結(jié)合后，激素信號(hào)才可以向一系列細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化，PR和孕激素的生理效應(yīng)才可以得到充分發(fā)揮，所以ER表達(dá)差異也會(huì)對(duì)妊娠結(jié)局產(chǎn)生直接影響[7-8]。在本次研究中，經(jīng)免疫組化和RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的ER陽(yáng)性率高于觀察組(P<0.05)，但兩組的PR陽(yáng)性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明子宮蛻膜組織缺乏雌激素受體表達(dá)是導(dǎo)致URSA的一個(gè)重要原因。有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，將黃體功能不足誘發(fā)的流產(chǎn)排除后，若只給予患者單一孕激素補(bǔ)充，而雌激素水平不高的話，其保胎效果較差。因?yàn)榇萍に厮降拖绿ケP組織作為雌激素的一個(gè)靶器官，其無法維持妊娠正常狀態(tài)，并且雌激素水平低下會(huì)抑制蛻膜組織中的PR生成，使孕激素表達(dá)的生理效應(yīng)得不到有效發(fā)揮，從而誘發(fā)諸多不良事件如營(yíng)養(yǎng)差、蛻膜發(fā)育不良、流產(chǎn)或者胚胎死亡等[10-11]。有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)，蛻膜組織中的雌激素受體含量低，則子宮內(nèi)膜對(duì)激素的反應(yīng)性就會(huì)下降，也就降低了子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受性[12]。而升高雌激素和孕激素受體水平，則能使Th1/Th2型細(xì)胞因子保持平衡，從而維持正常妊娠[13]。反之，減弱其表達(dá)后會(huì)對(duì)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生破壞，使Th1和細(xì)胞因子偏離，對(duì)胚胎細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行阻礙，從而誘發(fā)URSA[14]。

本次研究結(jié)果顯示，觀察組VEGF的+++和++所占比例低于對(duì)照組，且+所占比例高于對(duì)照組(P<0.05)。可以推斷，VEGF在妊娠中起到一定的調(diào)節(jié)作用，VEGF表達(dá)不足，降低促血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖的能力，使與血管通透性相關(guān)的物質(zhì)表達(dá)下調(diào)，絨毛血管生成出現(xiàn)缺陷，影響胎兒組織供血，誘發(fā)胎兒發(fā)育不良，從而導(dǎo)致早期自然流產(chǎn)[15]。

在本次研究中，觀察組的ER和VEGF水平均低于對(duì)照組。有文獻(xiàn)報(bào)道，ER對(duì)于妊娠維持有著十分重要的作用，雌激素通過與雌激素受體結(jié)合而導(dǎo)致目的基因表達(dá)，并且在多種組織中發(fā)揮其生理作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在絨毛和蛻膜組織中均有ER表達(dá)，并且ER表達(dá)主要位于滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞胞核中，與本次研究報(bào)道一致。從本試驗(yàn)中可以假設(shè)，蛻膜組織中的VEGF減少，可能導(dǎo)致ER的表達(dá)不足，使蛻膜血管形成障礙，蛻膜無法正常發(fā)育而導(dǎo)致著床失敗；若發(fā)生于胚胎著床后，則會(huì)阻礙胚胎血供，從而導(dǎo)致胚胎死亡或流產(chǎn)，ER和VEGF可能存在相互調(diào)節(jié)的機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)一步的研究及治療提供了一個(gè)切入點(diǎn)。

綜上所述，雌激素受體表達(dá)偏低可能是不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因之一，ER水平低使子宮內(nèi)膜對(duì)激素的反應(yīng)性降低，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜發(fā)育不良，對(duì)胚胎的容受性降低，故ER異常直接影響到激素作用的結(jié)果?？煽紤]在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的早期階段補(bǔ)充孕激素的同時(shí)，結(jié)合適量的戊酸雌二醇治療，可能提高ER及VEGF的表達(dá)，為胚胎提供好的子宮內(nèi)膜環(huán)境，而改善臨床治療效果。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給臨床上單用孕激素治療效果不佳的患者在診療上提供了一個(gè)新的思路，具有重要的臨床研究意義。