miR-145與MyoCD調(diào)控VSMCs脂質(zhì)蓄積的研究

龔勇珍，賀衛(wèi)和，錢榮華，譚 峰，黃小龍 (.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 4008；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 4008)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種多因素引起的心腦血管疾病，脂質(zhì)浸潤、慢性炎癥、血栓形成、內(nèi)皮損傷、低密度脂蛋白氧化等因素均參與其中，最終導(dǎo)致血管壁硬化及AS斑塊形成[1-3]。泡沫細(xì)胞的產(chǎn)生是AS斑塊最為典型的病理變化，血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)和巨噬細(xì)胞是泡沫細(xì)胞主要來源，特別是AS斑塊中50%的泡沫細(xì)胞均來自VSMCs[4-5]，說明VSMCs在AS的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。心肌素(MyoCD)是一個(gè)強(qiáng)有力促心肌和VSMCs分化的轉(zhuǎn)錄共激活因子，在心肌細(xì)胞和VSMCs的發(fā)育過程中起著重要作用，而且敲除MyoCD會(huì)導(dǎo)致小鼠動(dòng)脈夾層及動(dòng)脈瘤形成[6]。miR-145定位于染色體5q32，在正常動(dòng)脈及VSMCs中的表達(dá)量最高。研究發(fā)現(xiàn)miR-145對(duì)于VSMCs表型轉(zhuǎn)化具有顯著的調(diào)控作用，是VSMCs的表型調(diào)節(jié)器[7-8]。但通過調(diào)控miR-145表達(dá)是否影響VSMCs內(nèi)脂質(zhì)蓄積報(bào)道較少，因此本研究將探討MyoCD過表達(dá)載體聯(lián)合miR-145 inhibitor轉(zhuǎn)染探討對(duì)VSMCs脂質(zhì)蓄積情況的影響。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(HA-VSMCs)購于ATCC(CRL-1999)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：DMEM完全培養(yǎng)基(KGM12800S，凱基生物)；ox-LDL(S26774，源葉生物)； Trizol試劑、miRNA純化提取試劑盒、超純RNA提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(CWBIO 康為世紀(jì)，批號(hào)分別為CW0580S、CW0627S、CW0581M、CW0014S)；miRNA通用SYBR qPCR Master Mix、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(諾唯贊，批號(hào)分別為MR101-02、R223-01);2×SYBR Green PCR Master Mix(A4004M，Lifeint 生命互聯(lián))；RIPA細(xì)胞裂解液(C1053，北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；超敏發(fā)光液(RJ239676，賽默飛)；鼠單克隆抗β-actin、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(中杉金橋，批號(hào)分別為TA-09、ZB-2305、ZB-2301，1/2 000)；兔抗MyoCD (DF2434，Affinity，1/500)；總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒(A111-1-1，南京建成)；飽和油紅O染色液(G1260，Solarbio)；蘇木素染液(AR11800-1，BOSTER)。RT-6100酶標(biāo)儀(Rayto)； CFX ConnectTM實(shí)時(shí)熒光PCR儀、Chemi DocTM XRS+超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]；DYY-6C蛋白垂直電泳儀(北京市六一儀器廠)；BYC-310藥品冷藏柜(山東博科生物)；CX41顯微鏡(Olympus)。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：①對(duì)照組，②MyoCD過表達(dá)空載組(NC組)，③MyoCD過表達(dá)組，④NC+miR-145 inhibitor組，⑤MyoCD過表達(dá)+miR-145 inhibitor組。

1.3.2慢病毒轉(zhuǎn)染MyoCD：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染；1 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液里加入1 μl Polybrene助染劑，根據(jù)病毒滴度，按MOI為100加入相應(yīng)的病毒量，37℃培養(yǎng)16 h，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。獲得MyoCD過表達(dá)空載組(NC)和MyoCD過表達(dá)組。

1.3.3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-145 siRNA：慢病毒轉(zhuǎn)染成功后，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行抑制劑轉(zhuǎn)染。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí)，用不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；采用Opti-MEM稀釋Lipofectamine 3000及siRNA，二者混勻后室溫孵育15 min，轉(zhuǎn)染4 h，換成20%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。獲得NC+miR-145 inhibitor組和MyoCD過表達(dá)+miR-145 inhibitor組。miR-145 inhibitor序列如下：5'-AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC-3'。陰性對(duì)照：上游引物5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，下游引物5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。FAM陰性對(duì)照：上游引物5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，下游引物5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.3.4Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果：BCA試劑盒測(cè)定標(biāo)本蛋白濃度，并制定蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。制作8%濃縮膠及12%分離膠。上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉電泳，濕法轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯膜。2%BSA室溫封閉1 h，兔抗MyoCD、β-actin多克隆抗體4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L) 室溫孵育1 h，加入化學(xué)曝光液后，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，并根據(jù)Imag J軟件分析MyoCD、β-actin電泳條帶灰度值。

1.3.5熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞基因表達(dá)水平：按照Trizol試劑盒提取RNA，紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定mRNA濃度和純度，后根據(jù)HiFi Script cDNA 第一鏈合成試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算出各組miR-145-5p、ABCA1和MyoCD mRNA的相對(duì)表達(dá)量。各引物序列見表1。操作體系: RNase Free dH2O 9.5 μl、cDNA 1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、2×qPCR混合物2.5 μl。反應(yīng)程序，三步法：預(yù)變性：95℃、10 min，變性：95℃、10 s，退火：58℃、30 s，延伸：72℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。融解曲線分析：95℃、15 s，58℃、1 min，95℃、15 s，58℃、15 s，58℃、15 s，95℃、15 s。

表1 各引物序列

1.3.6脂質(zhì)蓄積：轉(zhuǎn)染成功后將細(xì)胞正常培養(yǎng)基換成含40 mg/L 的ox-LDL培養(yǎng)基孵育細(xì)胞，48 h后做油紅O染色，ELISA 檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1熒光PCR檢測(cè)MyoCD過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效率及miR-145干擾效果：與對(duì)照組和空載組相比，miR-145-5p inhibitor組miR-145-5p表達(dá)明顯下降；與對(duì)照組相比，MyoCD過表達(dá)組MyoCD表達(dá)明顯升高，驗(yàn)證通過。見圖1。

2.2Western印跡驗(yàn)證MyoCD轉(zhuǎn)染效率：MyoCD過表達(dá)組與空載組相比，MyoCD表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可知過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染有效，驗(yàn)證通過。見圖2。

A～D：對(duì)照組、NC組、miR-145-5p inhibitor組

A～C:對(duì)照組、NC組、miR-145-5p組

2.3油紅O染色和ELISA檢測(cè)結(jié)果：如圖3A所示，為細(xì)胞油紅O染色結(jié)果。各組細(xì)胞在ox-LDL孵育48 h后進(jìn)行染色，脂滴呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量較少，其中MyoCD+miR-145 inhibitor組細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量最少。圖3B所示為ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，與對(duì)照組相比，其余三個(gè)組膽固醇含量明顯下降，其中MyoCD+miR-145 inhibitor組膽固醇含量最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A～D：對(duì)照組、NC組、NC+miR-145 inhibitor組、MyoCD過表達(dá)+miR-145 inhibitor組

2.4熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果：與NC組相比，miR-145 inhibitor組和MyoCD過表達(dá)對(duì)ABCA1的水平無顯著影響。見圖4。

A～D：對(duì)照組、NC組、MyoCD+miR-145 inhibitor組、NC+miR-145 inhibitor組

3 討論

VSMCs及巨噬細(xì)胞是泡沫細(xì)胞形成的主要來源，脂質(zhì)沉積是泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。血管脂質(zhì)的沉積是AS發(fā)生的起始，脂質(zhì)被氧化后沉積于內(nèi)膜進(jìn)而引起血管反應(yīng)，導(dǎo)致VSMCs遷移及巨噬細(xì)胞浸潤，繼而吞噬大量的脂質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)蓄積了大量脂質(zhì)后，泡沫細(xì)胞形成，加劇AS的進(jìn)展[4-5]。因此學(xué)者認(rèn)為通過防止VSMCs內(nèi)脂質(zhì)蓄積，可以抑制VSMCs源性泡沫細(xì)胞的形成。

2001年Wang等[9]采用BLAST數(shù)據(jù)搜索小鼠胚胎心臟cDNA文庫并克隆出了一個(gè)新的蛋白MyoCD，MyoCD基因位于第17號(hào)染色體p11.2區(qū)，片段長92 kb。MyoCD能夠廣泛地表達(dá)于心肌組織、收縮血管及平滑肌。研究表明MyoCD對(duì)于VSMCs增殖、分化及表型轉(zhuǎn)化具有顯著的調(diào)控作用，并與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6,10]。miRNA是一類通過調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA分子，是參與心腦血管疾病、腫瘤等多種疾病的重要調(diào)節(jié)分子[11]。miR-145定位于染色體5q32，在正常動(dòng)脈血管及VSMCs中的表達(dá)量最高。研究發(fā)現(xiàn)miR-145對(duì)于VSMCs表型轉(zhuǎn)化具有顯著的調(diào)控作用，是VSMCs的表型調(diào)節(jié)器，能夠通過靶向調(diào)控KLF-4、KLF-5、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的表達(dá)，調(diào)節(jié)VSMCs收縮、分化及功能的恢復(fù)，而且增加miR-145表達(dá)會(huì)導(dǎo)致小鼠斑塊增加[12-13]。

本文首先通過PCR檢測(cè)了MyoCD過表達(dá)載體及miR-145 inhibitor轉(zhuǎn)染VSMCs，結(jié)果表明相較于對(duì)照組，MyoCD過表達(dá)組MyoCD mRNA表達(dá)量上調(diào)，miR-145 inhibitor組miR-145表達(dá)量下調(diào)，說明轉(zhuǎn)染成功。而且進(jìn)一步采用Western印跡驗(yàn)證了MyoCD過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的成功。接著探討二者聯(lián)合轉(zhuǎn)染對(duì)于VSMCs內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況及膽固醇水平的影響，結(jié)果表明二者聯(lián)合能顯著的減少VSMCs內(nèi)脂滴形成及膽固醇水平，從而說明MyoCD過表達(dá)聯(lián)合miR-145 inhibitor能顯著的抑制VSMCs內(nèi)脂質(zhì)蓄積，可能影響到AS的進(jìn)展。

ABCA1是一種細(xì)胞膜結(jié)合蛋白，主要表達(dá)于VSMCs、巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，能夠通過介導(dǎo)VSMCs內(nèi)游離膽固醇到到載脂蛋白上形成高密度脂蛋白，是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的第一步驟，因此能夠通過維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡進(jìn)而抑制VSMCs內(nèi)泡沫細(xì)胞形成，緩解AS進(jìn)展[14]。研究表明冠心病AS患者中ABCA1表達(dá)水平降低，且體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)ABCA1減少是導(dǎo)致VSMCs脂質(zhì)蓄積的重要原因[15]。通過上調(diào)ABCA1表達(dá)抑制VSMCs內(nèi)脂質(zhì)蓄積，進(jìn)而可以抑制VSMCs源性泡沫細(xì)胞形成。因此本研究進(jìn)一步探討MyoCD過表達(dá)聯(lián)合miR-145 inhibitor對(duì)于VSMCs中ABCA1表達(dá)量的影響，結(jié)果表明抑制miR-145對(duì)ABCA1 mRNA表達(dá)無影響。另外，miR-145 inhibitor + MyoCD過表達(dá)對(duì)ABCA1 mRNA表達(dá)無顯著影響，可能存在其他機(jī)制。

綜上所述，MyoCD過表達(dá)聯(lián)合miR-145 inhibitor能顯著抑制VSMCs內(nèi)脂質(zhì)蓄積。