大同黃花菜幼葉誘導再生組織培養(yǎng)初探

沈日敏 盧 瑤 李小玉 邢寶龍

（山西農(nóng)業(yè)大學高寒區(qū)作物研究所/大同黃花產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院 山西大同 037000）

黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni），別名萱草、忘憂草、金針菜等，屬百合科萱草屬多年生宿根草本植物，起源于歐洲及亞洲的溫帶地區(qū)[1]。我國種植黃花菜已有2 000多年之久，分布于全國多個地區(qū)，其中甘肅慶陽、湖南祁東、陜西大荔、山西大同、江蘇宿遷和浙江縉云形成了我國黃花菜的六大主產(chǎn)區(qū)[2]。黃花菜花色鮮亮，不僅可作為觀賞花卉，還因其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，具有清熱利濕、抗菌消炎、抗癌、抗氧化和抗抑郁等功效，深受廣大消費者青睞，極具深度開發(fā)的前景和市場價值[3]。

大同素有“黃花之鄉(xiāng)”的美譽，開始種植并食用黃花菜距今已有600多年。近幾年來，在國家及政府的鼓勵和扶持下，大同市黃花產(chǎn)業(yè)得到了空前發(fā)展，涌現(xiàn)出一批優(yōu)秀的集種植、加工、生產(chǎn)和銷售于一體的黃花菜龍頭企業(yè)，帶動當?shù)匕傩罩赂?，在大同市推動鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮了舉足輕重的作用。云州區(qū)為大同黃花菜的主產(chǎn)區(qū)，該區(qū)地處火山群下，土層深厚肥沃、疏松透氣、日照時間長、晝夜溫差大，有利于植物的光合作用和碳水化合物的積累。加之豐富的地下水資源，即使年平均降雨量少，也能保障黃花菜的正常生長需求。得天獨厚的地理優(yōu)勢和自然資源造就了大同黃花菜出眾的品質(zhì)[4-5]。大同黃花菜相比其他產(chǎn)區(qū)的黃花菜無論是外觀品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)還是食用品質(zhì)均有其優(yōu)勢：一是花蕾長且多，線條粗壯，肉質(zhì)肥厚，單蕾長12～15 cm，鮮重3.5～5.5 g，制干后色澤金黃，達到了上乘黃花菜的標準；二是干凈無菌，綠色天然，含糖量高，云州區(qū)是典型的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟區(qū)，也是黃花菜的黃金產(chǎn)區(qū)，這里種植的黃花菜脆嫩清口，營養(yǎng)豐富，是名副其實的富硒黃花和天然有機食品；三是耐貯性好，制干脫水后的大同黃花菜在干燥陰涼處可放一年不變色[6]。此外，研究發(fā)現(xiàn)大同黃花菜的纖維素含量和可溶性蛋白含量均高于全國其他主產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)的黃花菜[7]。

黃花菜的繁殖方式主要有分株繁殖、切片育苗繁殖和扦插繁殖，但這些繁殖方式存在種苗成本高、生長周期長、繁殖系數(shù)小、耗時費力、易帶病蟲害等弊端，且隨傳代次數(shù)的增加易出現(xiàn)不同程度的品種退化，嚴重影響黃花的品質(zhì)、產(chǎn)量和觀賞性[8-9]。由于黃花菜為異花授粉植物，基因型雜合且存在一定的敗育現(xiàn)象，若直接采用種子繁殖的方法，無論是自交還是異交，其后代極易產(chǎn)生性狀分離，難以維持品種的優(yōu)良性狀。由此可見，傳統(tǒng)的繁殖方式很難迎合黃花菜種苗規(guī)?；N植生產(chǎn)的需求，限制了黃花菜產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。而通過植物組織培養(yǎng)的方式既能縮短種苗的繁殖周期、增加繁殖系數(shù)，又能保持品種的優(yōu)良性狀、降低變異概率，為引種、實現(xiàn)工廠化育苗和擴大黃花的種植規(guī)模打下基礎[10]。基于此，已有一些學者以不同產(chǎn)地黃花菜為材料，選取根狀莖、花瓣、花藥、花梗、花莖、葉片等不同部位作為外植體，探索了黃花菜組織培養(yǎng)繁育體系，為利用該技術進行黃花菜的快速繁育提供了寶貴的經(jīng)驗[11-14]。綜合不同學者的研究結果得出，若用黃花菜的花器或者根狀莖作為外植體，雖然誘導效果較好，但存在季節(jié)限制，難以實現(xiàn)種苗的持續(xù)性生產(chǎn)，而以葉片作為外植體，取材容易，誘導效率高[15]。此外，黃花菜的組織培養(yǎng)存在基因型效應，不同品種間由于基因型的差異對培養(yǎng)條件的反應也不同。本試驗以大同黃花菜為材料，取植株幼葉作為外植體，研究了一種黃花菜組織培養(yǎng)的再生系統(tǒng)，以期為快速繁殖、引種和種質(zhì)保存提供理論依據(jù)和方法，為大同市黃花產(chǎn)業(yè)的種苗工廠化生產(chǎn)提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以田間剛發(fā)芽的大同黃花菜幼苗作為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的選擇與滅菌3月底到4月初，從田間挖出越冬后剛發(fā)芽的健康、無病、無蟲斑的大同黃花菜幼苗，剪去老根［圖1（A）、圖1（B）］，切除短縮莖上多余的側芽塊和隱芽塊，并剝?nèi)ロ斞可献钔鈱拥娜~片，用洗潔精清洗后在流水下沖洗2～3 h，選取淡黃綠色的幼葉進行滅菌處理［圖1（C）］，在超凈臺上用75%酒精浸泡30 s，再用0.1%HgCl2滅菌8 min，無菌水洗5～6次，將滅菌后的葉片置于濾紙上吸干多余的水分，然后切成約1.0 cm×0.5 cm大小，葉片背面朝上接種于誘導培養(yǎng)基中［圖1（D）］。置于黑暗條件下培養(yǎng)，控制溫度（23±2）℃，記錄15 d后外植體啟動率、污染率和死亡率。

圖1 黃花菜外植體消毒過程

啟動率=表現(xiàn)皺縮加厚的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)×100%。

污染率=被污染的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)×100%。

死亡率=非因污染造成的死亡外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)×100%。

1.2.2 植物激素對幼葉外植體出愈率的影響以MS（易生組培）為基本培養(yǎng)基，調(diào)pH至5.8～6.2，加入植物激素配制成不同激素濃度的培養(yǎng)基，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，在超凈工作臺中將未冷卻的培養(yǎng)基分裝于一次性90 mm培養(yǎng)皿中，每皿20 mL，待培養(yǎng)基凝固后每皿接種6片幼葉外植體，每個處理接種10皿，黑暗條件下培養(yǎng)，溫度（23±2）℃，分別在15 d和35 d觀察啟動率（葉片卷曲皺縮）和出愈率（外植體膨大并形成細胞團）。

1.2.3 愈傷組織的分化培養(yǎng)取健康無污染的愈傷組織切成1 cm3的小塊，接種于MS添加2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA的分化培養(yǎng)基中，光照度2 000～3 000 lx，光照時間12 h，30 d后觀察并統(tǒng)計結果。

1.2.4 生根培養(yǎng)待幼苗長至3～4 cm時轉接到普通的MS（含糖和瓊脂）培養(yǎng)基上，21 d后觀察并統(tǒng)計生根情況，當根長達到5～7 cm時移栽到蛭石、營養(yǎng)土比例為1∶1的基質(zhì)中。

2 結果與分析

2.1 植物激素對黃花菜幼葉愈傷誘導的影響

由表1可知，本研究借鑒了前人試驗中的黃花幼葉誘導愈傷的最佳植物激素濃度，用于篩選誘導愈傷的最佳培養(yǎng)基，結果表明，2,4-D濃度為2 mg/L時、6-BA濃度在0.1～0.5 mg/L之間均可誘導外植體啟動和愈傷形成，而15 mg/L的6-BA和10 mg/L的Kinetin都會導致黃花菜葉片變黃枯死，表明高濃度的6-BA和Kinetin不適用于大同黃花菜幼葉的愈傷誘導。

表1 黃花菜幼葉愈傷誘導培養(yǎng)基的篩選

2.2 植物激素濃度對幼葉外植體誘導的影響

在篩選外植體愈傷組織誘導培養(yǎng)基的同時，統(tǒng)計了幼葉誘導的啟動率和出愈率。由表2可知，在2,4-D濃度為2 mg/L、6-BA濃度為0.1～0.5 mg/L時，各處理幼葉外植體的啟動率分別為58%、40%和64%，出愈率分別為41.67%、23.81%和35.90%，其中0.25 mg/L 6-BA誘導幼葉外植體的啟動率和出愈率低于0.1 mg/L和0.5 mg/L的6-BA，而0.1 mg/L和0.5 mg/L 6-BA處理的結果差異不大。但在2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，有些外植體啟動之后會出現(xiàn)只膨大而不產(chǎn)生愈傷的情況［圖2（A）］，或者即使產(chǎn)生愈傷后期也不再分化莖尖［圖2（B）］，有些甚至跳過前面2個階段直接誘導出根［圖2（C）、圖2（D）］。因此在誘導黃花幼葉形成愈傷時，2 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA是大同黃花菜幼葉外植體愈傷誘導的最佳培養(yǎng)基。

表2 不同激素濃度對幼葉外植體愈傷組織誘導率的影響

圖2 幼葉外植體愈傷誘導的幾種情況

2.3 愈傷組織的分化和生根培養(yǎng)及移栽

本試驗采用的是王靜等[15]給出的最佳分化培養(yǎng)基MS+2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA，統(tǒng)計得出分化率達到65%，平均每塊愈傷組織不定芽個數(shù)為1.48。生根培養(yǎng)基為普通添加蔗糖和瓊脂的MS培養(yǎng)基，接種到生根培養(yǎng)基21 d后，觀察到平均每個芽苗生根數(shù)為3.21，根長達到5～7 cm時，組培苗移栽后成活率達到85.42%。愈傷組織誘導及分化的流程見圖3。

圖3 黃花菜幼葉外植體愈傷分化及生根移栽過程

3 討論與結論

大同黃花菜在生產(chǎn)中存在品種單一、繁殖速度慢、種植規(guī)模較小等問題，導致其在國內(nèi)六大黃花菜產(chǎn)區(qū)中知名度和市場競爭力都較差[16]。目前，大同黃花菜種苗的繁殖方法主要以分生繁殖為主，這種方法雖然簡便，但受制于母株的生長年限、環(huán)境條件及當?shù)氐臍夂?，從而導致繁殖系?shù)低、周期長，影響種苗的更新?lián)Q代和植株的生長發(fā)育[17-18]。與傳統(tǒng)的繁殖方式相比，植物組織培養(yǎng)不受季節(jié)和氣候限制，生長周期短，繁殖速度快，方便種苗的規(guī)模化生產(chǎn)、標準化管理和自動化控制[19]。為加快大同黃花菜的繁殖速度，擴大種植規(guī)模，需要建立快速高效的組織培養(yǎng)技術為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供種苗。本研究采用了易于獲取的黃花菜幼葉，通過愈傷組織培養(yǎng)獲得組培苗，經(jīng)煉苗后移栽到溫室。這種方法獲得的黃花菜種苗不攜帶病菌，為生產(chǎn)健康的黃花菜產(chǎn)品提供了保障。

本研究利用組織培養(yǎng)3個月就可獲得組培苗，極大地縮短了育苗時間。但大同黃花菜幼葉的出愈率遠低于王靜等[15]的試驗結果（86.67%），推測原因可能是由于植物激素在滅菌前添加，導致滅菌后植物激素濃度發(fā)生變化，對誘導愈傷產(chǎn)生影響，也可能是選取的葉片不夠幼嫩，從而導致出愈率偏低，因此在愈傷誘導過程中盡量選取靠近生長點外3～4層的葉片。在愈傷誘導過程中，2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基誘導的葉片有不正常情況出現(xiàn)，這是因為植物愈傷組織的誘導主要受外植體本身、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境三大因素的調(diào)控。同種植物相同外植體在相同培養(yǎng)環(huán)境下，若培養(yǎng)基中激素濃度在滅菌前后發(fā)生變化，就會導致誘導情況的不確定性，造成生根情況的原因還需進一步研究探討。本試驗所用的生根培養(yǎng)基為不添加植物激素的MS培養(yǎng)基，生根率可達94.33%，與蘇承剛等[13]所指出的不添加NAA的生根培養(yǎng)基效果相同。此外，我們還采用短縮莖作為外植體進行了誘導，可以獲得愈傷和不定芽，但愈傷繁殖3次后全部出現(xiàn)污染，經(jīng)多次重復試驗，證明短縮莖外植體攜帶的病原菌難以去除，不適用于作為愈傷誘導的外植體。

本研究以大同黃花菜幼葉為試驗材料，成功探索出適用于當?shù)攸S花菜品種組織培養(yǎng)的方法，且最終得到了健康的黃花種苗。同時本研究的試驗條件要求比較簡單，方法可行易于操作，為推廣大同黃花菜產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定了基礎。